Name: Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação para marcação de células ependimogliais individuais no telencéfalo de zebrafish adultos. Este método permite o monitoramento de longo prazo e a manipulação de vias de sinalização de forma autônoma em células.

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Agradecimentos especiais a James Copti para edição do manuscrito. Nós também reconhecemos com gratidão o financiamento para JN da Fundação alemã de pesquisa (DFG) pela SFB 870 e SPP "análise Integrativa de olfaction" e SPP 1738 "papéis emergentes de RNAs não codificantes no desenvolvimento do sistema nervoso, plasticidade & doença", SPP1757 " Heterogeneidade glial ", e estratégia de excelência no âmbito do cluster de Munique para Neurologia de sistemas (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Todos os animais utilizados neste protocolo foram mantidos condições de manejo padrão, e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos de manuseio da UE e do governo da Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. preparação da mistura plasmídeo para electroporação
<ol><li>Diluir o plasmídeo de interesse em água estéril e adicionar solução de estoque de mancha verde rápido [1 mg/mL]. Certifique-se de que a concentração final do plasmídeo é ~ 1 μg/μL. Adicione a mancha em uma concentração de não mais de 3%, porque seu único objetivo é colorir a solução e visualizar a injeção ventricular.</li>
	<li>Uma vez preparado, misture a solução de plasmídeo pipetando para cima e para baixo várias vezes ou tocando com o dedo. Armazene à temperatura ambiente (RT) até o uso. Nota: Para o co-Electroporation de dois plasmídeos na mesma pilha, assegure-se de que a concentração de cada plasmídeo individual usado na mistura seja pelo menos 0,8 ng/μl com uma relação do molar de 1:1 para obter a eficiência do co-Electroporation de 80%-de 90%.</li>
</ol>2. preparações para procedimento de injecção e electroporação
<ol><li>Prepare os capilares de vidro (diâmetro externo 1 mm, diâmetro interno 0,58 mm) necessários para a injeção no aparelho de tração da agulha.</li>
	<li>A fim de injetar a quantidade correta de plasmídeo (ver acima), puxe o capilar a uma temperatura de 68,5 ° c com dois pesos leves e dois pesados (ver tabela de materiais para as especificações do extrator). Nota: No caso de um extrator diferente é usado, calibrar o capilar para entregar o volume adequado de mistura de electroporação.</li>
	<li>Defina manualmente o dispositivo de injeção para uma pressão de injeção de 200 hPa (girando o botão PI) e a pressão constante de 0 hPa. Ajuste manualmente o tempo de injeção para o modo manual e controle a pressão com o pedal do pé.</li>
	<li>Ajuste o dispositivo do Electroporation ao "modo LV" com cinco pulsos em 54 – 57 V (25 MS cada um com 1 s intervalos). Ligue os eléctrodos ao dispositivo.</li>
	<li>Prepare um tanque de peixes com água de peixe limpa, onde o peixe será despertado da anestesia após o procedimento de eletroporação. Aerate a água mantendo a pedra do ar unida à bomba de ar para o período inteiro da recuperação até que o peixe esteja despertado inteiramente.</li>
	<li>Tome uma esponja de cozinha regular e faça um corte longitudinal na esponja para prender peixes durante o procedimento da injeção e do Electroporation (veja a publicação precedente3). Nota: A esponja da cozinha deve regularmente ser lavada ou trocado a fim remover produtos químicos tóxicos potenciais.</li>
	<li>Coloc uma pequena quantidade de gel multi-purpose altamente condutor do ultra-som ao lado da instalação da injeção e do Electroporation. Nota: Isso garantirá a condutividade elétrica adequada e, consequentemente, a distribuição de células eletroporadas em todo o telencon.</li>
</ol>3. anestesia de zebrafish
<ol><li>Antes da anestesiarização, prepare uma solução de anestesia com 0,2% MS222 em água destilada e ajuste o pH para 7 com tampão Tris-HCl. Diluir este estoque 1:10 (ou seja, para 0, 2% MS222) usando água de peixe.</li>
	<li>Anestesie os peixes mantendo-os nesta solução de trabalho até que o movimento do corpo e das guelras diminui (tipicamente por alguns minutos).</li>
</ol>4. injeção de solução de plasmídeo
<ol><li>Encha o capilar de vidro preparado com 10 μL de solução de plasmídeo usando pontas do microloader. Evite a formação de bolhas de ar dentro do capilar.</li>
	<li>Prima menu/alterar capilar no dispositivo de injecção. Insira e fixe a agulha no suporte da agulha.</li>
	<li>um estereomicroscópio com uma ampliação de 3,2 x ou 4x, corte apenas a ponta do capilar usando pinça Fine-end. Mude o dispositivo da injeção do modo capilar da mudança no modo da injetora , a seguir aplique a pressão com um pedal do pé para assegurar-se de que a solução do plasmídeo esteja funcionando facilmente fora da agulha e sem obstáculo.</li>
	<li>Transfira o peixe do tanque de pecuária para o recipiente (caixa plástica) com solução anestésica. Aguarde alguns minutos até o movimento das guelras Subsides.</li>
	<li>Coloque os peixes na esponja pré-molhada com o lado dorsal virado para cima. Execute todas as seguintes etapas da injeção o estereomicroscópio para assegurar a exatidão do procedimento.</li>
	<li>Usando uma microfaca de dissecação de aço inoxidável com 40 mm de aresta de corte e 0,5 mm de espessura, crie um pequeno furo no crânio de peixe no lado posterior do telencídeo (Figura 1b), ao lado da borda com Tectum óptico. Nota: Esta etapa deve ser realizada com cuidado uma vez que o furo deve ser muito pequeno e superficial, penetrando unicamente o crânio, para evitar danos cerebrais.</li>
	<li>Incline o peixe conforme necessário e Oriente a ponta do capilar de vidro em direção ao crânio no ângulo correto para facilitar a penetração da ponta capilar através do orifício.</li>
	<li>Insira a ponta do capilar através do orifício no crânio com cuidado até atingir o ventrículo telencefálico (ver Figura 1b). Isto exigirá a penetração através da camada de pilha ependymal dorsal. Tenha especialmente cuidado para não inserir o capilar muito profundamente para evitar o contato com o tecido cerebral. Mantenha o capilar precisamente entre os hemisférios, permanecendo dentro do ventrículo logo após perfurar a camada ependymal dorsal. Nota: Este é um passo muito delicado. A exatidão deste procedimento é melhorada usando linhas do mutante da pigmentação tais como brassy24, permitindo a melhor visualização da posição capilar de vidro durante a injeção.</li>
	<li>Com a ponta capilar dentro do ventrículo, injete a solução de plasmídeo aplicando pressão com o pedal por cerca de 10 s, o que corresponde a aproximadamente 1 μL de solução de plasmídeo. Nota: Se mudar o extrator da agulha, os capilares ou o injector, o sistema deve ser calibrado a fim entregar sempre 1 μL da solução do plasmídeo. A calibração pode ser realizada medindo-se o diâmetro da gota de plasmídeo expelido em óleo mineral (por exemplo, óleo de parafina) e, posteriormente, calculando o volume da gotículo. Após 10 s de injecção, deve haver ~ 1 μL de líquido plasmídeo expelido para o óleo mineral.</li>
	<li>Confirme o sucesso da etapa precedente observando a propagação do líquido durante todo o ventrículo.</li>
</ol>5. electroporação
<ol><li>Retire o peixe do conjunto de injeção enquanto ainda o segura na esponja.</li>
	<li>Mergulhe o lado interno da ponta dos eletrodos no gel de ultra-som.</li>
	<li>Cubra o telencon de peixes com uma pequena quantidade de gel de ultra-som.</li>
	<li>Posicione a cabeça de peixe entre os eletrodos, colocando o eletrodo positivo no lado ventral da cabeça do peixe e o eletrodo negativo no lado dorsal (Figura 1C), enquanto ainda mantém o corpo do peixe na esponja. Isto ajusta o sentido do fluxo da corrente necessária para electroporate o ependymoglia posicionado na zona zona.</li>
	<li>Pressione os eletrodos suavemente e precisamente contra o telencótido (Figura 1C). Administrar a corrente com o pedal do pé. Segure os eletrodos no lugar até que todos os cinco pulsos estão acabados.</li>
</ol>6. recuperação dos peixes
<ol><li>Deixe o peixe recuperar-se no tanque previamente preparado, continuamente aerado até que acorde. O gel do Lidocaine podia ser aplicado no crânio a fim aliviar toda a dor possivelmente desenvolvida.</li>
</ol>

<ol><li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li>
<li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li>
<li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li>
<li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmetal+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li>
<li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li>
<li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586(2014).</li>
<li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle%3A+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li>
<li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+%28HSV-1%29+and+electroporation%3A+methods+and+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li>
<li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells%3A+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li>
<li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li>
<li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li>
<li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).</li>
<li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarbosa%2C+JS+%22In+vivo+single+cell+analysis+reveals+distinct+behavior+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+homeostasis+and+regeneration+in+the+adult+brain%22">In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain</a>. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).</li>
<li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li>
<li>Chapouton, P., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapouton%2C+P+%22Neurogenesis.+Chapter+IV+in+The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A+Developmental+Biology%22">Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).</li>
<li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo do Electroporation é um método in vivo de confiança de etiquetar pilhas ependymoglial individuais. O protocolo pode precisar de uma adaptação adicional para rotular outros tipos de células, como neurônios ou oligodendrócitos. Para conseguir a rotulagem bem sucedida, os plasmídeos que contêm promotores diferentes podem ser usados. O promotor da galinha-beta actina, o eF1alpha, o CMV e o promotor do ubiquitin foram usados previamente para conduzir a expressão de transgenes diferentes no ependymoglia e em seu...

Zebrafish são excelentes modelos animais para examinar a regeneração cerebral após uma ferida de ferimento de facada. Em comparação com os mamíferos, na escada evolutiva, espécies menos evoluídas como o zebrafish geralmente apresentam taxas mais elevadas de neurogênese constitutiva e áreas mais amplas de residência neural adulta de células-tronco, levando à geração constante de novos neurônios ao longo a maioria das áreas cerebrais na vida adulta. Esta característica parece correlacionar com significativamente maior capacidade regenerativa de zebrafish em comparação com os mamíferos1, como zebrafish têm notável potencial para gerar eficientemente novos neurônios na maioria dos modelos de lesão cerebral estudados2, 3,4,5,6,7,8. Aqui, o telencéfalo zebrafish é estudado, uma vez que é uma área cerebral com neurogênese proeminente na idade adulta. Estas zonas da neurogênese adulta são homólogo às zonas neurogênica no cérebro mamífero adulto9,10,11.
As áreas neurogênica abundantes no telencéfalo do zebrafish estão atuais devido à existência do glia radial como pilhas ou pilhas do ependymoglia. As células ependymogliais atuam como células-tronco neurais adultas residentes e são responsáveis pela geração de novos neurônios no cérebro intacto e regenerador3,5. Experimentos de rastreamento de linhagem mostraram que a ependymoglia ventricular reage à lesão, então proliferam e geram novos neuroblastos que migram para o local da lesão5. Devido à natureza evertido do telencephalon do zebrafish, as pilhas de ependymoglial alinham a superfície ventricular e constroem a parede ventricular ventral. A parede ventricular dorsal é formada por uma camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a). Importante, o zebrafish ependymoglia incorpora as características tanto da glia radial de mamíferos quanto das células ependímicas. Os processos radiais longos são uma característica típica das células da glia radial, enquanto as extensões celulares e as junções apertadas (bem como suas posições ventriculares) são características típicas das células ependímicas12,13,14. Conseqüentemente, estas pilhas são referidas como pilhas ependymoglial.
Para seguir o comportamento in vivo de células ependymogliais únicas durante a regeneração, eles precisam ser rotulados de forma confiável. Os vários métodos da rotulagem in vivo da pilha para a microscopia fluorescente foram descritos previamente, tais como repórteres endógenos ou tinturas lipofílico15. Estes métodos, em contraste com o electroporation, podem exigir uns períodos de tempo mais longos e frequentemente não oferecem a possibilidade da única rotulagem da pilha ou do traçado a longo prazo permanente. Electroporation, entretanto (além da única rotulagem da pilha), oferece a possibilidade de introduzir o ADN novo na pilha de anfitrião. Além disso, comparado a outros métodos de transferência de DNA para as células, a eletroporação demonstrou ser um dos métodos mais eficientes16,17,18,19.
É apresentado aqui um protocolo do Electroporation que seja refinado com a finalidade de etiquetar únicas pilhas ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo permite a rotulagem de pilhas ependymoglial únicas a fim segui-los durante um período de longo prazo20 ou para manipular caminhos específicos em uma maneira pilha-autônoma21,22.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente/Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verde Rápido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>Para colorir a solução de plasmídeo</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>MS222 deve ser armazenado em RT (até duas semanas) e protegido da luz Gel de</td></tr><tr><td>ultrassom</td><td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td><td>15-60</td><td>Eletrodo Gel</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de ar</td><td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td><td></td><td>Pode ser comprado nas lojas de animais</td></tr><tr><td>BTX Tweezertrodes Eletrodos</td><td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0486</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de eletroporação</td> de 1 mm de diâmetro <td>BTX ECM830 Sistema de eletroporação de onda quadrada, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de injeção</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td></td></tr><tr><td>Parede Padrão Borosillicate Glass Capillary</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0766</td><td>Modelo nº: G100-4</td></tr><tr><td>Pontas de microcarregador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micro-faca</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td> <td>de joystickNarishige Japan</td><td>MN - 151</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>O porta-agulhas vem junto com o dispositivo de injeção</td></tr><tr><td>Dispositivo de puxar agulhas</td><td>Narishige Japão</td><td>Modelo nº: PC-10</td><td>O PC-10 foi descontinuado pela Narishige em 2017 e substituído pelo PC-100</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>633161</td><td></td></tr></tbody></table>

método de electroporation para in vivo entrega de dna plasmídeo no adulto zebrafish telencephalon

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

O electroporation é um método do transfection em que um campo elétrico é aplicado às pilhas para criar pores temporários em uma membrana de pilha e para aumentar sua permeabilidade, desse modo permitindo que as moléculas diferentes sejam introduzidas à pilha. Neste papel, o electroporation é usado para introduzir plasmídeos às pilhas ependymoglial, que alinham a zona ventricular do telencephalon adulto do zebrafish. Uma fração dessas células mostra Propriedades de células-tronco e gera novos neurônios no cérebro zebrafish; Portanto, estudar seu comportamento é essencial para determinar seus papéis na neurogênese e regeneração. A introdução de plasmídeos através do Electroporation permite a rotulagem e o seguimento a longo prazo de uma única pilha ependymoglial. Além disso, os plasmímids tais como o recombinase do CRE ou o Cas9 podem ser entregados às únicas pilhas ependymoglial, que permite a recombinação do gene ou a edição do gene e fornece uma oportunidade original de avaliar a função autônoma do gene da pilha em um controlado, natural Ambiente. Finalmente, este protocolo detalhado, passo a passo do Electroporation é usado para obter a introdução bem sucedida de plasmídeos em um grande número de únicas pilhas ependymoglial.

O método de eletroporação descrito permite a entrega do DNA plasmídeo em células ependimogliais, localizadas superficialmente no telencédigo zebrafish e logo abaixo da camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a).
Se o resultado da eletroporação for positivo, rotulados células ependymogliais únicas (células vermelhas na Figura 2a, b) podem ser observadas entre outras células ep...

É apresentado aqui um método do Electroporation para a entrega do ADN do plasmídeo e a rotulagem da pilha ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo é um método rápido e eficiente para visualizar e traçar células ependymogliais individuais e abre novas possibilidades para aplicar a eletroporação a uma ampla gama de manipulações genéticas.

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Este protocolo permite a rotulagem de células ependymoglial individuais no telencephalon de zebrafish para permitir seu monitoramento a longo prazo, bem como a manipulação de caminhos específicos de forma autônoma celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a rotulagem de células únicas de forma rápida e eficiente, bem como a edição de genes e a manipulação da via de sinalização de forma autônoma celular. Este método permite a investigação de questões básicas de biologia celular, por exemplo, sobre delaminação celular, manutenção da homeostase epitelial e a simetria da divisão celular.Comece usando um aparelho de puxar agulhas para preparar capilares de vidro. Use dicas de microcarregador para encher um capilar de vidro preparado com dez microliters de solução plasmida. Em seguida, pressione a mudança capilar do menu" no dispositivo de injeção para permitir que a agulha seja carregada no suporte da agulha.Em seguida, troque o dispositivo de injeção de mudar o modo capilar para injetar. Em seguida, usando um estereótipo com uma ampliação de quatro vezes, e fórceps Finden, corte apenas a ponta do capilar. Em seguida, aplique pressão no pedal do pé para confirmar que as soluções plasmidas correm facilmente para fora da agulha sem obstáculos.Quando a agulha estiver pronta, transfira um zebrafish do tanque de criação para um recipiente de solução anestésica. E espere alguns minutos até que o movimento das brânquias diminua. Pressione o lado dorsal do peixe sedado sobre uma esponja pré-molhada sob o estereóscópio, e use um microknife dissecando aço inoxidável com uma borda de corte de 40 milímetros e uma espessura de 0,5 milímetros para criar cuidadosamente um pequeno buraco no crânio do peixe no lado posterior do telencephalon, logo ao lado da borda do tectum óptico.Incline o peixe conforme necessário e oriente a ponta do capilar de vidro em direção ao crânio no ângulo correto para facilitar a penetração da ponta capilar através do orifício. Em seguida, insira cuidadosamente a ponta do capilar no orifício através da camada celular ependímal dorsal, até chegar ao ventrículo telenceálico, e aplique pressão no pedal do pé por cerca de 10 segundos para entregar aproximadamente 1 microliter da solução plasmida. O sucesso da entrega pode ser confirmado observando a propagação do líquido verde por todo o ventrículo.Cubra o telencephalon de peixe com uma pequena quantidade de gel de ultrassom. Para eletroporação do animal injetado plasmídeo, remova a esponja da configuração da injeção e mergulhe o lado interno das eletrofinas em gel de ultrassom. Posicione a cabeça do peixe entre os eletrodos, com o eletrodo positivo no lado ventral da cabeça e o eletrodo negativo no lado dorsal.Em seguida, enquanto ainda segura o corpo do peixe na esponja, pressione os eletrodos suavemente e precisamente contra o telencephalon e administre a corrente com o pedal do pé, segurando os eletrodos no lugar até que todos os cinco pulsos estejam terminados. Se a eletroporação for bem sucedida, plasmid rotulado células ependymoglial simples podem ser observados entre as células ependymoglial não plasmidas. Dependendo da eficiência do processo de eletroporação, pode-se rotular um número maior ou menor de células ependymoglial.No entanto, o protocolo demonstrado produz um número maior de células rotuladas do que os protocolos publicados anteriormente. Note que a maior densidade de células rotuladas tende a emergir principalmente no lado ventricular interno de ambos os hemisférios devido à forma como o líquido plasmídeo injetado se distribui entre os hemisférios. Neste vídeo, um hemisfério do telencephalon de zebrafish é apresentado em 3D, onde as células ependymoglial com radioprocessos, estão em magenta quando observadas do lado.Através da co-eletroporação com outro plasmídeo que rotula núcleos, pode-se observar a divisão celular das células ependymoglial. A eletroporação mal sucedida resulta em um número muito baixo ou sem células ependymoglial rotuladas. As células ependísicas dorsais, no entanto, são as mais propensas a serem rotuladas.Sua soma é maior em cuboide e eles não possuem processos radio alongados tão evidentes a partir de uma visão lateral da camada celular ependymoglial. as células rotuladas tdTomato-mem são provavelmente células ependímicas, que estão localizadas acima da camada de ependymoglia. Em contraste, a introdução de um tdTomato-mem expressando plasmídeos para células ependmyoglial individuais resulta na expressão tdTomato-mem, além da rotulagem celular inicial.As coisas mais importantes a se lembrar são cortar apenas a ponta do capilar e penetrar na camada ependímal enquanto injeta para que o líquido se espalhe por todo o ventrículo. Essa técnica permite o monitoramento a longo prazo de células ependymoglial únicas através de imagens in vivo e, portanto, estabelecendo seu papel na regeneração cerebral, bem como seu vasto elo genético in vivo.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

A resolução temporal e espacial das manipulações genéticas determina o espectro de fenômenos biológicos que possam perturbar. Aqui usamos temporal e espacialmente...

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Nós descrevemos um método para condicionalmente knockdown a expressão de uma proteína alvo durante a regeneração do adulto peixe-zebra barbatana. Esta técnica envolve a micro-injecção e electroporating morpholinos oligonucleótido anti-sentido para o tecido da aleta, o que permite testar o papel da proteína em vários estágios de regeneração da barbatana, incluindo a cicatrização de feridas, a formação de blastema, e excrescência regenerativo.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Este vídeo descreve a eletroporação in vivo, que é uma técnica de entrega de DNA em células ependimogliais em peixes-zebra adultos.

in vivo Eletroporação: um método específico do local para transfectar o peixe-zebra

Este vídeo descreve a técnica de injeção intramuscular para administrar compostos nos músculos dorsais de um peixe-zebra adulto.

Injeção intramuscular (IM): entrega composta no músculo dorsal de um peixe-zebra adulto

Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Aqui descrevemos um protocolo para a imunização do adulto peixe-zebra (Danio rerio) com uma vacina baseada em DNA e demonstrar a validação de um evento de sucesso da vacinação. Este método é adequado para o rastreio pré-clínico de candidatos vacinais em vários modelos de infecção.

Imunização do adulto Zebrafish para o rastreio pré-clínica de vacinas baseadas em DNA

Um novo método de injeção intraperitoneal (IP) em peixe-zebra adulto é descrito. Ao manusear compostos tóxicos como a doxorrubicina, esse procedimento é mais eficaz do que os dois métodos de IP relatados anteriormente. A técnica foi projetada para ser facilmente adotada por pesquisadores com experiência limitada no modelo de peixe-zebra.

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

Aprenda a técnica de eletroporação para marcação de células ependimogliais individuais no telencéfalo de zebrafish adultos. Este método permite o monitoramento de longo prazo e a manipulação de vias de sinalização de forma autônoma em células.

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

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