Visão mecanicista do desenvolvimento da fibrose intestinal mediada por TNBS e avaliação dos efeitos inibitórios da rapamicina

Este protocolo exibe fisiopatologia altamente comparável da fibrose de Crohn em humanos e também discute os efeitos inibitórios mediados pela rapamicina na fibrose intestinal. A principal vantagem deste protocolo é que ele descreve o desenvolvimento da fibrose intestinal em um período muito curto de tempo variando de quatro a oito semanas, o que nos dá a oportunidade de estudar a reparação tecidual e a regeneração tecidual. Este protocolo será útil para pesquisadores que estão com pressa para obter o mecanismo da fibrose, e ajudar a encontrar uma tecnologia melhor para prever a intervenção para a fibrose intestinal associada de Crohn.

Para iniciar este procedimento, raspe camundongos adultos ao redor da área do pescoço, a fim de pré-sensibilizá-los ao TNBS através da exposição dérmica. Em seguida, mergulhe um coton swab com TNBS e aplique-o na área raspada do pescoço do mouse. Oito dias após a sensibilização, induzir colite pela administração intraretal uma vez por semana, durante seis semanas.

Para isso, aplique quatro miligramas de TNBS em 25% de etanol usando um enema de 100 microliter através de uma seringa de um mililitro presa a uma agulha de gavage de aço. Dê aos ratos de controle 100 microliters de 25% de etanol. Depois de anestesiar os camundongos, injete intraperitonealmente a rapamicina a dois miligramas por quilograma por dia, ou um veículo, ou ambos, todos os dias da semana durante três a seis semanas para os camundongos tratados com controle e TNBS.

Depois disso, use intestinos de camundongos pós-tratados de seis semanas para analisar os ensaios extracelulares. Primeiro, abra o cólon longitudinalmente em HBSS gelado e lave o cólon no HBSS. Usando uma tesoura estéril, corte o cólon em pequenos pedaços que são de aproximadamente cinco centímetros no HBSS.

Transfira os pequenos pedaços de tecido do cólon para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de tampão de pré-digestão. Agite o tubo a 100 RPM em uma incubadora a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, passe a suspensão através de um coador de células de 40 micrômetros e descarte o epitélio colonico anexado.

Colete o tecido restante do coador e digere-os ainda mais no tampão de digestão contendo colagenase Tipo IV e DNASE1 em 1X HBSS com 5%FBS por 20 minutos em uma incubadora a 37 graus Celsius enquanto treme a 100 RPM. Depois disso, o vórtice dos tecidos digeridos por aproximadamente 20 segundos e passa-o através de um coador de células de 40 micrômetros para obter frações de rémina propria. Centrifugar as frações de lamina propria a 700 vezes G e 4 graus Celsius para derrubar as células.

Em seguida, faça 100 mililitros de soluções de mídia gradiente de 30% e 70%. Resuspenda as células obtidas em 10 mililitros da solução de 30% e sobreponha-as em cima de cinco mililitros da solução de 70% em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar o gradiente em uma condição livre de quebra a 1.000 vezes G e temperatura ambiente.

Colete a fase do anel branco contendo os linfócitos lamina propria, que serão entre as camadas de 30% e 70%. Lave as células obtidas reutilizando-as em HBSS gelado e centrifugando a 500 vezes G e 10 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, resuspende as células no buffer FACS.

Antes da coloração de anticorpos, primeiro bloqueie a superfície celular das células de lamina propria, incubando-as com cd16 anti-rato por 32FC bloqueador no gelo por 15 minutos. Em seguida, incubar as células com anticorpos anti-CX3CR1 PE juntamente com microesferas anti-PE no gelo por 30 minutos para capturar as células ligadas e, em seguida, lavar as células com tampão FACS. Passe o anticorpo e as células ligadas a contas através de uma coluna de classificação celular ativada magnética em um campo magnético para remover as células desvinculadas.

Lave as células três vezes com tampão FACS. Depois disso, remova a coluna do campo magnético e empurre o êmbolo na coluna para produzir as células ligadas às contas. Primeiro, bloqueie as células de lamina propria com CD16 anti-rato por bloqueador de 32FC no gelo.

Coe as células incubando com anticorpos anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C e MHC Classe II, então classifique as células usando um cítmetro de fluxo FACS conforme descrito no protocolo de texto. Lyse as células classificadas para a preparação total do RNA e detecte citocinas e marcadores fibrosos. Analise a expressão mRNA de marcadores fibrosos e análise de citocinas inflamatórias a partir de suspensões isoladas de células únicas a partir da purificação magnética.

Para iniciar a coloração e análise da superfície celular, resuspend entre 500.000 e 1 milhão de células isoladas de lamina propria em 15 mililitros de tampão FACS. Incubar as células com anti-CD16 por 32 anticorpos em uma diluição de 1 a 50 no gelo por 10 minutos. Depois disso, lave as células com 500 microliters de tampão FACS frio para remover anticorpos desvinculados.

Manchas de superfície suspensões de células únicas coloniais com anticorpos fluorescentes rotulados a uma diluição de 1 a 100 no gelo por 30 minutos. Lave as células rotuladas duas vezes para remover os anticorpos desvinculados usando 500 microliters de tampão FACS frio gelado para cada lavagem. Em seguida, analise as células mononucleares rotuladas por citômetro de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto.

Para iniciar a coloração e análise de citocinas intracelulares, use um kit de solução de permeabilização de fixação para corrigir e permeabiliizar as células manchadas de superfície de acordo com as instruções do fabricante. Gate as células de lamina propria como descrito no protocolo de texto para detectar o nível intracelular de citocina beta IL-1. Em seguida, lave as células adicionando tampão FACS e centrifugação a 200 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos para remover o excesso de tampão fixativo.

Repita esta lavagem uma vez. Para determinar o nível de actina muscular suave alfa, primeiro as células permeabilizem com o kit de solução de permeabilização de fixação. Incubar as células com anticorpos anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 a uma diluição de 1 a 1000 no gelo por 30 minutos.

Em seguida, lave as células adicionando tampão FACS e centrifugando a 200 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos para remover o excesso de tampão fixativo. Repita esta lavagem uma vez. Realize a análise FACS e portal as células conforme descrito no protocolo de texto.

Neste estudo, adota-se o modelo de colite do camundongo TNBS para estudar e elucidar os mecanismos subjacentes da fibrose intestinal. Após seis semanas de tratamento tnbs, pode-se ver que o comprimento colonico encurtou progressivamente ao longo do tratamento TNBS de aproximadamente cinco centímetros no grupo controle para aproximadamente três centímetros no grupo TNBS. Para garantir que o modelo de doença de TNBS Crohn seja comparável ao modelo de fibrose de Crohn humano e não seja um artefato relacionado à metodologia, os marcadores fibrosos são analisados em vários níveis em um estudo detalhado do curso de tempo.

Acúmulo de células positivas do músculo alfa e deposição de colágeno dentro de camadas submucosas têm sido relatados na maioria das incidências de fibrose e é considerado como uma marca registrada para eventos fibrosos Para comparar a fibrose TNBS com a fibrose associada de Crohn, a expressão de marcadores de fibrose e citocinas é analisada em biópsia de tecido fresco a partir do íleo de pacientes com CD ativo ou sob remissão. Notavelmente, a indução marcada é vista do espessamento do músculo alfa liso actin camadas positivas e aumento da deposição de colágeno em seções ativas de CD. A análise da mancha ocidental é realizada para confirmar a indução da expressão de actina muscular suave alfa em amostras de CD ativos.

Além disso, a indução significativa de marcadores de fibrose é detectada pela análise qPCR. Os efeitos da rapamicina, um inibidor farmacológico da atividade M4 são então avaliados para determinar um mecanismo para limitar a fibrose TNBS. Os camundongos são tratados com TNBS e rapamicina e os níveis de actina muscular suave alfa e colágeno na histologia do cólon são analisados.

É importante lembrar de inocular a mesma quantidade de TNBS para cada camundongo e processar células isoladas de lamina propria o mais rápido possível para evitar a perda celular, bem como para manter a viabilidade celular. Nosso protocolo detalha sobre a fibrose TNBS e a remissão da fibrose, bem como o fator inibidor da rapamicina na formação da fibrose. Outros pesquisadores podem estar interessados em usar essa técnica para encontrar um melhor alvo de drogas para fibrose e câncer de cólon.

Lembre-se que o TNBS é um irritante da pele e os jalecos devem ser usados durante o manuseio para evitar o contato com a pele.