Name: Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda uma plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro. Este método permite estudar respostas imunes pós-transplante.

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Este estudo é apoiado pela Bolsa inicial da University of Central Florida College of Medicine (à HN), pela bolsa inicial do Centro Médico hillman Hillman (para a HL), pelo Bolsa de #1P20CA210300-01 do Ministério da Saúde dos Estados Unidos #4694 (para a PTH). Agradecemos ao Dr. Xue-zhong Yu da Universidade Médica da Carolina do Sul por fornecer materiais para o estudo.

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Flórida Central.
1. Indução GVHD
NOTA: O transplante de células de medula óssea alogênica (BM) (etapa 1.2) é realizado dentro de 24h após a irradiação. Todos os procedimentos descritos abaixo são realizados em ambiente estéril. Realize o procedimento em uma capa de cultura de tecido e use reagentes filtrados.
<ol><li>Dia 0: Prepare os ratos receptores.<ol>
<li>Use camundongos do tipo selvagem feminino (WT) em um fundo BALB/c (CD45.2+ H2kd+), 10-12 semanas de idade como destinatários.</li>
		<li>Tag ear e pesar os receptores antes do TBI. Em seguida, coloque até 11 ratos na câmara de irradiação e mantenha-os no irradiador. Irradie em uma dose única de 700 cGy por 10-15 min.</li>
		<li>Devolva animais irradiados para as gaiolas e os abriga em instalações livres de patógenos antes do transplante. NOTA: O peso corporal mínimo dos receptores deve ser de cerca de 20 g. Use este peso como referência para calcular a perda de peso corporal durante o período experimental.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 1: Preparar medula óssea empobrecida com células T (TCD-BM) dos camundongos doadores.<ol>
<li>Eutanásia CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 camundongos por asfixia de CO2 e aguardem por 2-3 min até ficarem inconscientes. Realizar a luxação cervical como uma eutanásia secundária, se necessário.</li>
		<li>Coloque cada rato em uma tábua de trabalho limpa. Higienize a pele e a pele com 70% de isopropanol.</li>
		<li>Recolher a tíbia e o fêmur de ambas as pernas usando fórceps e tesouras. Coloque-os em RPMI frio contendo 1% de FCS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 2 mM L-glutamina (1% RPMI) em tubos cônicos de 50 mL. Limpe bem o fêmur e os ossos da tíbia removendo todos os tecidos musculares usando fórceps e tesouras. Transfira o fêmur e a tíbia dos tubos cônicos de 50 mL para uma placa de Petri de 92 mm de diâmetro contendo 1% de RPMI.</li>
		<li>Com uma tesoura, corte as pontas do fêmur ou da tíbia. Encha um tubo de 50 mL com 25 mL de 1% de meio RPMI 1640. Use isso para encher uma seringa de 3 mL presa a uma agulha de 26 G com 3 mL de 1% de RPMI. Insira esta seringa no osso e empurre o êmbolo para tirar a medula óssea (BM) da cavidade para dentro do tubo de coleta com 1% de RPMI (~3 mL/osso).</li>
		<li>Repita o passo 1.2.4 para todos os ossos restantes da tíbia e do fêmur de outros camundongos doadores. Mantenha todos os tubos de coleta no gelo.</li>
		<li>Faça a suspensão de uma única célula lavando os pedaços de medula óssea através de um filtro de células de malha de 75 μm. Recolher a suspensão unicelular em um tubo de 50 mL.</li>
		<li>Tubos de centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Aspire e descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota no tampão PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) a 20 x 106 células/mL. Guarde uma alíquota de 2 x 106 células para coloração de pureza.</li>
		<li>Adicione o anticorpo Thy 1 a 0,05 μg/106 células14 e incubar por 30 min a 4 °C. Lave uma vez com 25 mL de PBS gelada. Resuspender a 20 x 106/mL em 0,5% BSA/10% de complemento de coelho jovem/2% DNase (10.000 U/mL em H2O estéril). Incubar por 45 min a 37 °C e lavar 2x como antes. NOTA: As células T são esgotadas usando um mAb específico para Thy1, uma proteína expressa por todas as células T, mas não por outros leucócitos.</li>
		<li>Resuspender as células em 20 mL de tampão PBS contendo 0,5% de BSA. Conte as células de medula óssea em 1% de ácido acético usando um hemocytometro. Mantenha uma alíquota de 2 x 106 células para uma verificação de pureza por citometria de fluxo após a purificação celular. NOTA: Um rato doador normalmente gera cerca de 25 x 106 TCD-BM.</li>
		<li>Use citometria de fluxo para confirmar um esgotamento bem sucedido da célula T. Mancha 1 x 106 células, preservadas das etapas 1.2.7 (antes do esgotamento da célula T) e 1.2.9 (TCD-BM após esgotamento da célula T) com os seguintes anticorpos: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 1: Prepare células T dos ratos doadores<ol>
<li>Use cd45.2+ H2kb+ C57BL/6 camundongos do tipo selvagem (WT) como doadores para células T.</li>
		<li>Eutanie camundongos C57BL/6 por asfixia por dióxido de carbono (CO2) conforme descrito em 1.2.1.</li>
		<li>Limpe bem a pele e a pele do rato com 70% de etanol. Excise baços e linfonodos e separe-os em uma única suspensão celular de esplenocites usando um êmbolo de seringa e filtros de malha de 40 μm. Lave o filtro e o êmbolo de seringa com 1% de RPMI (1% FBS contendo mídia RPMI) para coletar todos os esplenocitos.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular a 800 x g por 5 min a 4 °C. Adicionar 5 mL de tampão de revestimento ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) depois de descartar o sobrenadante. Incubar a suspensão celular por 5 min em temperatura ambiente. NOTA: O tampão de lyse ACK é usado para a repressão de glóbulos vermelhos.</li>
		<li>Adicione 5 mL de 1% rpmi para parar a lésia. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Prepare o tampão de classificação celular ativado por gelo (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA em PBS, pH 7.2). Degas o buffer antes de usar. Resuspenda as pelotas de célulaem 5 mL de tampão MACS.</li>
		<li>Conte os esplenocites e verifique as células vivas e mortas usando um hemocytometer e 1% de trippan azul. Guarde uma alíquota de 2 x 106 células para avaliar o rendimento de purificação com análise de citometria de fluxo.</li>
		<li>Resuspender os esplenocites na concentração de 200 x 106/mL no tampão MACS. Adicionar 0,03 μL de biotina anti-mouse-Ter-119, 0,03 μL de biotina anti-rato-CD11b, 0,03 μL de biotina anti-mouse-CD45R e 0,03 μL de biotina anti-mouse-DX5 por 106 células. Incubar por 15 min a 4 °C. NOTA: Biotina anti-mouse-Ter-119, biotina anti-mouse-CD11b, biotina anti-rato-CD45R e biotina anti-mouse-DX5 foram usadas para reagir com células eritróidas, granulócitos, células B e NK, respectivamente. Portanto, esses subconjuntos celulares estão esgotados na etapaseguinte 15.</li>
		<li>Adicione 10 mL de tampão MACS gelado à suspensão celular. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender as pelotas celulares no tampão MACS a uma concentração de 100 x 106/mL. Adicione microesferas anti-biotina (0,22 μL/106 células) à suspensão do esplenocite. Misture bem e incubar por mais 15 min a 4 °C. Lave a suspensão celular uma vez com 10 mL de tampão MACS gelado. Centrifugação a 800 x g por 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Coloque uma coluna de separação magnética no campo magnético. Enxágüe a coluna com 3 mL de tampão MACS. Deixe a suspensão da célula na coluna. Coletar o fluxo constituído por células T não encadernadas e enriquecidas, em um novo tubo cônico de 15 mL. Lave a coluna MS com 3 mL de tampão MACS gelado. NOTA: Certifique-se de que a coluna está vazia antes de executar as etapas de lavagem.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular a 800 x g por 5 min a 4 °C. Resuspenda a pelota celular em 5 mL de tampão MACS.</li>
		<li>Conte as células em azul trippan de 1% usando um hemocytometro. Guarde uma alíquota de 2 x 106 células para uma verificação de pureza por citometria de fluxo. NOTA: O rendimento médio das células T esplênicas isoladas por este método é de ~20-25 x 106 células por rato.</li>
		<li>Confirme o rendimento do enriquecimento da célula T por citometria de fluxo. Mancha 1 x 106 células, preservadas das etapas 1.3.7 (antes do esgotamento da célula T) e 1.3.13 (TCD-BM após o esgotamento da célula T), com os seguintes anticorpos: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 1: Injete camundongos irradiados com células T doadoras e TCD-BM.<ol>
<li>Lave as células TCD-BM e T 2x com PBS (800 x g para 5 min a 4 °C). Resuspenda as células em PBS frio para injeção. Ajuste a concentração celular para 20 x 106/mL para TCD BM e 4 x 106/mL para células T.</li>
		<li>Aqueça o animal usando uma lâmpada de aquecimento para aumentar a visibilidade das veias traseiras bilaterais. Se necessário, coloque o rato em uma contenção.</li>
		<li>Limpe a superfície da cauda usando 70% de isópropanol. Injetar TCD-BM (5 x 106 células/mouse) com ou sem células T (0,75 x 106 células/mouse). Tenha cuidado para não introduzir ar na seringa.</li>
		<li>Remova a agulha e aplique um cotonete anti-séptico diretamente no local da injeção 5-10 s para parar qualquer sangramento.</li>
	</ol></li>
	<li>Avalie o GVHD nos dias 2-80.<ol>
<li>Acompanhe a sobrevivência dos animais. Monitore os sinais clínicos de GVHD adaptados do sistema de pontuação estabelecido anteriormente por Cook et al.16 e o peso corporal dos camundongos receptores 2x por semana. Use o peso corporal determinado antes do TCE para calcular a perda de peso corporal.</li>
		<li>Pesar cada rato individualmente. Escore a perda de peso da seguinte forma: grau 0 = menos de 10%; grau 1 = 10%-20%; grau 2 = mais de 20%.</li>
		<li>Pontuação o sinal de postura dos beneficiários: grau 0 = sem palpite; grau 0,5 = leve palpite, mas endireita-se ao caminhar; grau 1 = animal permanece curvado ao caminhar; grau 1,5 = animal não se endireita; grau 2.0 = pé animal nos dedos traseiros.</li>
		<li>Pontuação o sinal de mobilidade dos beneficiários: grau 0 = muito ativo; grau 0,5 = mais lento que camundongos ingênuos; grau 1,0 = movimentos somente quando cutucados; grau 1,5 = movimentos ligeiramente quando cutucados; grau 2.0 = não se move quando cutucado.</li>
		<li>Pontuação da pele dos receptores: grau 0 = sem escoriações, lesões ou escala; grau 0,5 = vermelhidão em uma área específica; grau 1 = abrasão em uma área ou abrasão leve em duas áreas; grau 1,5 = escoriações graves em duas ou mais áreas; grau 2.0 = escoriações graves, pele rachada, sangue seco.</li>
		<li>Pontuação da pele dos receptores: grau 0 = sem sinais anormais; grau 0,5 = ridicularização na lateral da barriga ou nuca do pescoço, grau 1,0 = desviamento através ou do lado da barriga e pescoço; grau 1,5 = pele emaranhada e babada; grau 2.0 = pele mal emaranhada na barriga e nas costas.</li>
		<li>Pontuação da diarreia dos beneficiários: grau 0 = sem diarreia; grau 0,5 = fezes leves e macias; grau 1,0 = leve (fezes amarelas); grau 1,5 = moderado (fezes amarelas com um pouco de sangue); grau 2 = grave (fezes amarelas e ensanguentadas, "fezes de bolo seco" aparecem na área anal).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Modelo de Cotransplante
<ol><li>Gerar células dendríticas derivadas da medula óssea (BM-DCs).<ol>
<li>Isole a medula óssea dos fêmures e tíbias de TW ou fator B (fB)-/- camundongos no fundo B6 conforme descrito nos passos 1.2.3-1.2.4. Gire as células a 800 x g por 5 min.</li>
		<li>Ressuspensão da pelota em 5 mL de tampão de latrização ACK para lésis de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão celular por 5 min no gelo. Adicione 10 mL de 1% rpmi à suspensão celular para parar a lésia e centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender as pelotas celulares em 10 mL de mídia de cultura (RPMI 1460 contendo 10% FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2 mM l-glutamina e 50 mM β-mercaptoetanol) e ajustar o volume para atender à concentração final de 2 x 106 células/mL.</li>
		<li>Adicione o fator estimulante da colônia de granulocyte-macrófago de 20 ng/mL (GM-CSF) à suspensão celular. Cultura as células de medula óssea em placas de Petri de 100 x 15 mm a 37 °C em 5% de CO2 por 6 dias.</li>
		<li>Substitua metade da mídia de cultura em curso (cerca de 5 mL) por mídias frescas contendo 40 ng/mL GM-CSF no dia 3.</li>
		<li>Pré-aqueça a mídia cultural em um banho de água a 37 °C. Colete cerca de 5 mL da mídia dos pratos de cultura de medula óssea. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota de célula em meios de cultura de 5 mL contendo 40 ng/mL GM-CSF.</li>
		<li>Adicione 25 μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) à mídia no dia 6 da cultura para amadurecer os BM-DCs. Salve uma alíquota de 2 x 106 células para determinar a eficácia da diferenciação dc por citometria de fluxo.</li>
		<li>Coletar BM-DCs maduros: Use elevadores de célulapara raspar suavemente DCs das placas de Petri. Recolher todas as suspensões celulares em tubos cônicos de 50 mL. Centrífuga a 800 x g,por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Lave as pelotas de célula3x com 50 mL de PBS gelado. Economize cerca de 2 x 106 BM-DCs para análise de fenótipo imunológico por citometria de fluxo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar co-transplante de células dendríticas de TMO (TMO COTRANSPLANTE DC-cotransplante). NOTA: Use camundongos FVB (H2kq) como doadores para células T e células BM. Irradiar B6 Ly5.1 camundongos receptores em uma dose de 1.100 cGy (2 doses, intervalo de 3 h). Veja detalhes na etapa 1.1.<ol>
<li>Isolar bm de fêmures e tíbias dos camundongos doadores do FVB. Veja detalhes nas etapas 1.2.3-1.2.10. NOTA: Use medula óssea total isolada em vez de TCD-BM neste modelo.</li>
		<li>Purificar células T dos baços e linfonodos dos camundongos doadores do FVB. Veja detalhes nas etapas 1.3.1-1.3.13.</li>
		<li>Injete BM (5 x 106/mouse), Células T (0,5 x 106/mouse) com BM-DCs (2 x 106/mouse) no dia 0 do curso experimental.</li>
		<li>No 3º dia após o transplante, examine a reconstituição do doador DC por citometria de fluxo.<ol>
<li>Coletar sangue dos olhos dos receptores.</li>
			<li>Anestesiar os camundongos CD45.1/Ly5.1 B6 por inalação isoflurana de 3%. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a um pinça do dedo do dedo.</li>
			<li>Coloque um tubo de pipeta de vidro estéril no canto medial do olho direcionado caudally a um ângulo de 30-45° do plano do nariz. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo.</li>
			<li>Jogue o sangue em tubos de microcentrífuge estéreis de 1,5 mL contendo heparina. Transfira 50 μL de sangue para tubos de fluxo de vidro de 5 mL.</li>
			<li>Adicione 2 mL de buffer de lysing ACK. Incubar a 37 °C em banho-maria por 45 min. Adicione 2 mL de tampão de coloração FACS. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.</li>
			<li>Resuspender as pelotas celulares com 200 μL de tampão FACS contendo anticorpos de coloração de fluxo apropriados (amarelo vivo/morte, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c e α-MHCII). Incubar por 15 min a 4 °C no escuro. Lave 2x com tampão FACS de 1 mL. Resuspender as pelotas celulares em 200 μL de tampão FACS e realizar a análise por citometria de fluxo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Modelos GVHD/GVL de BMT
<ol><li>Realize a indução GVHD/GVL.<ol>
<li>Cultura a luciferase transduziu linfoma de células A20 B em meios de cultura RPMI.</li>
		<li>Irradiar fundo BALB/c WT ou receptor Ly5.1 a 700 cGy (dose única). Veja detalhes na etapa 1.1.</li>
		<li>Isolar TCD-BM dos fêmures e tíbias de B6. Ly5.1 ratos doadores. Veja detalhes nas etapas 1.2.1-1.2.10.</li>
		<li>Purificar células T de baços e linfonodos dos camundongos doadores C57BL/6. Veja detalhes nas etapas 1.3.1-1.3.15.</li>
		<li>Lave o linfoma A20 2x com 25 mL de PBS. Resuspenda as pelotas celulares em 10 mL de PBS gelado. Pegue uma alíquota de suspensão celular (10 μL) e conte as células usando 1% de trippan azul e um hemocytometer. Ajuste a concentração celular para 20.000 células/mL.</li>
		<li>Injetar TCD-BM (5 x 106/mouse) com ou sem células T (0,75 x 106/mouse) e linfoma A20 (5.000 células/mouse).</li>
		<li>Acompanhamento sobre a sobrevivência do receptor, sinais clínicos GVHD e perda de peso corporal durante o curso experimental. Veja detalhes na etapa 1.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faça imagens bioluminescentes.<ol>
<li>Monitore o crescimento do tumor no receptor transplantado injetando os camundongos receptores com 4 mg de D-luciferina. Incubar por 5 min para garantir que a luciferina reaja com luciferase.</li>
		<li>Anestesiar o mouse usando 3% de isoflurano na câmara de um imager de bioluminescência e imagem dos receptores por 5 min no campo D e o tempo de exposição de 1 min.</li>
		<li>Analisar dados usando software de análise de imagens. Altere a escala das imagens pseudo coloridas para obter melhores resultados. NOTA: Todas as imagens devem estar na mesma escala entre os experimentos.</li>
		<li>Use o software de análise de imagem para determinar as regiões de interesse e quantificar a densidade do sinal calculando o fluxo (fótons/s) emitido de cada região de interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

O uso de células-tronco para se adequar a um indivíduo específico é uma abordagem eficaz para tratar cânceres avançados e resistentes18. Os fármacos de pequenas moléculas, no entanto, têm permanecido por muito tempo um foco primário da terapia personalizada contra o câncer. Por outro lado, na terapia celular uma infinidade de interações entre doador e hospedeiro pode influenciar decisivamente os desfechos do tratamento, como o desenvolvimento do GVHD após a TMO1.
<p cla...

O transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas (TMO) é uma terapia eficaz para tratar malignidades hematológicas1,2 através do efeito enxerto-versus-leucemia (GVL)3. No entanto, os linfócitos doadores sempre montam ataques imunológicos indesejados contra tecidos receptores, um processo chamado doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD)4.
Os modelos murine de GVHD são uma ferramenta eficaz para estudar a biologia do GVHD e a resposta GVL5. Camundongos são um modelo animal de pesquisa econômico. São pequenos e eficientemente dosados com moléculas e biológicas nas fases iniciais do desenvolvimento6. Camundongos são animais de pesquisa ideais para estudos de manipulação genética por serem geneticamente bem definidos, o que é ideal para estudar caminhos biológicos e mecanismos6. Vários modelos de complexo de histocompatibilidade maior estrito do mouse (MHC) MHC-incompatíveis de GVHD foram bem estabelecidos, tais como C57BL/6 (H2b) para BALB/c (H2d) e FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Estes são modelos particularmente valiosos para determinar o papel de tipos de células individuais, genes e fatores que afetam o GVHD. Transplante de C57/BL/6 (H2b) doadores parentais para receptores com mutações no MHC I (B6.C-H2bm1) e/ou MHC II (B6.C-H2bm12) revelaram que uma incompatibilidade tanto na classe MHC I quanto na classe II é um requisito importante para o desenvolvimento do GVHD agudo. Isso sugere que tanto as células CD4+ quanto CD8+ T são necessárias para o desenvolvimento da doença7,8. GVHD também está envolvido em uma cascata inflamatória conhecida como a "tempestade de citocinas pró-inflamatórias"9. O método de condicionamento mais comum em modelos de murina é a irradiação corporal total (TBI) por raio-X ou 137Cs. Isso leva à ablação da medula óssea do receptor, permitindo assim o enxerto de células-tronco do doador e prevenindo a rejeição do enxerto. Isso é feito limitando a proliferação de células T receptoras em resposta às células doadoras. Além disso, as disparidades genéticas desempenham um papel importante na indução da doença, que também depende da menor incompatibilidademhc-incompatível 10. Portanto, a dose mieloablativa de irradiação varia em diferentes cepas de camundongos (por exemplo, BALB/c→C57BL/6).
A ativação de células T doadoras por células apresentadoras de antígenos hospedeiros (APCs) é essencial para o desenvolvimento do GVHD. Entre os APCs, as células dendríticas (DCs) são as mais potentes. Eles são herdavelmente capazes de induzir GVHD devido à sua captação superior de antígenos, expressão de moléculas co-estimuladoras de células T e produção de citocinas pró-inflamatórias que polarizam as células T em subconjuntos patogênicos. Os DCs receptores são fundamentais para facilitar a escorva de células T e a indução de GVHD após o transplante11,12. Assim, os DCs tornaram-se alvos interessantes no tratamento do GVHD12.
O TCE é necessário para melhorar o enxerto celular do doador. Devido ao efeito TBI, os DCs receptores são ativados e sobrevivem por um curto período de tempo após o transplante12. Apesar dos grandes avanços no uso da bioluminescência ou fluorescência, estabelecer um modelo eficaz para estudar o papel dos DCs receptores no GVHD ainda é desafiador.
Como as células T doadoras são a força motriz para a atividade da GVL, estratégias de tratamento usando drogas imunossupressoras, como esteróides, para suprimir a aloreatividade das células T, muitas vezes causam recaída ou infecçãotumoral 13. Portanto, direcionar os DCs receptores pode fornecer uma abordagem alternativa para tratar o GVHD, preservando o efeito GVL e evitando a infecção.
Em resumo, o presente estudo fornece uma plataforma para entender como diferentes tipos de sinalização em DCs receptoras regulam o desenvolvimento de GVHD e o efeito GVL após o TMO.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0 100ML</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td>MACS buffer</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>MACS tampão</td></tr><tr><td>A20 Linfoma de células B</td><td>University of Central Florida</td><td>Experimento GVL</td><td>interno</td></tr><tr><td>ACC1 fl / fl</td><td>Jackson Lab</td><td>30954</td><td>Experimento GVL</td></tr><tr><td>ACC1 fl / fl CD4cre</td><td>University of Central Florida</td><td></td><td>Experimento GVL</td></tr><tr><td>Anti-Biotina MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>Anti-Humano/Camundongo CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-85</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10452-85</td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c- AF700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>117319</td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD25 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0251-82</td><td>Coloração de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0041-86</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor&reg; 450 (Pacific Blue&reg; substituição)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0042-82</td><td>Coloração de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.1 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0900-83</td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD8a APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0081-83</td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5958-82</td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC Classe II-anticorpo APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5320-82</td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anti-Mouse TER-119 Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5921-85</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>Anti-Thy1.2</td><td>Bio Excel</td><td>BE0066</td><td>BM geração</td></tr><tr><td>B6 camundongos fB-/-</td><td>Universidade da Flórida Central</td><td>Destinatários internos</td><td></td></tr><tr><td>B6. Camundongos Ly5.1 (CD45.1+)</td><td>Charles River</td><td>564</td><td>Doadores Camundongos</td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>Receptores de transplante Camundongos</td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Doadores/Receptores</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0112-85</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>CD25-biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0251-82</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-82</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>CD49b Anticorpo monoclonal (DX5)-biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5971-82</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>Filtro celular 40 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>Preparação celular</td></tr><tr><td>Filtro celular 70 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Preparação celular</td></tr><tr><td>D-Luciferina</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>Imagem de animais vivos</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Atlanta Bilogicals R & D sistema</td><td>D17051</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Tubos de citometria de fluxo</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>FVB/NCrl</td><td>Charles River</td><td>207</td><td>Doadores</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>DC coluna LS madura</td></tr><tr><td></td><td>Mitenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Preparação celular</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Enriquecimento de células T</td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 170R incubadora</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Penicilina + estreptomicinaPenicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg / ml de estreptococo)</td> <td>GIBCO</td><td>15140</td><td>Mídia</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scienctific</td><td>11875-093</td><td>Mídia</td></tr><tr><td>TER119</td><td>Thermo Fisher Enriquecimento</td><td>de células T</td>Scientific <td>13-5921-82</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS-200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Xenogen IVIS-200</td><td>Imagem de animais vivos</td></tr><tr><td>X-RAD 320 Irradiador Biológico</td><td>Precision X-RAY X-RAD</td><td>320</td><td>Irradiação Total do Corpo</td></tr></tbody></table>

plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

O transplante de medula óssea alogênico (TMO) é uma terapia eficaz para malignidades hematológicas devido ao efeito enxerto versus leucemia (GVL) para erradicar tumores. No entanto, sua aplicação é limitada pelo desenvolvimento da doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), uma grande complicação da TMO. GVHD é evocado quando as células T nos enxertos doadores reconhecem alloantigen expresso por células receptoras e montam ataques imunológicos indesejados contra tecidos saudáveis receptores. Assim, as terapias tradicionais são projetadas para suprimir a aloreatividade das células T do doador. No entanto, essas abordagens prejudicam substancialmente o efeito GVL para que a sobrevivência do destinatário não seja melhorada. Compreender os efeitos das abordagens terapêuticas em TMO, GVL e GVHD é, portanto, essencial. Devido às capacidades de apresentação de antígenos e secreção de citocinas para estimular células T doadoras, as células dendríticas receptoras (DCs) desempenham um papel significativo na indução do GVHD. Portanto, direcionar dCs destinatários torna-se uma abordagem potencial para controlar o GVHD. Este trabalho fornece uma descrição de uma nova plataforma de TMO para investigar como os DCs host regulam as respostas GVH e GVL após o transplante. Também é apresentado um modelo eficaz de TMO para estudar a biologia do GVHD e gvl após o transplante.

O principal modelo B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)correspondeu de perto ao desenvolvimento do GVHD após o transplante(Figura 2). Todos os seis sinais clínicos gvhd estabelecidos anteriormente por Cooke et al.16 ocorreram nos receptores transplantados com células T WT-B6, mas não nos receptores transplantados apenas com BM (etapa 1,5), que representavam o grupo GVHD-negativo. Existem duas fases no desenvolvimento do GVHD n...

A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Este novo protocolo de transplante de medula óssea pode ser usado para investigar como as células dendríticas hospedeiras regulam as respostas de enxerto versus hospedeiro e enxerto versus leucemia após o transplante. As regenerações celulares ex vivo permitem que este protocolo seja adaptado para testar o papel de outras células imunes, como macrófagos e neutrófilos simplesmente modificando a condição cultural. Demonstrando o procedimento comigo estarão a gerente de laboratório Krystal Hossack e a graduanda Sanjeev Gurshaney.Para o doador, a preparação da medula óssea C57BL/6, colhe o fêmur e a tíbia de acordo com os protocolos padrão de camundongos doadores eutanizados e transfira os ossos para uma placa petri de 92 milímetros de diâmetro contendo meio 1%RPMI. Com uma tesoura, remova as extremidades de cada osso e encha uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 26 com meio RPMI fresco de 1%.. Insira a agulha em uma extremidade de um osso e deprimir o êmbolo para tirar a medula óssea da cavidade e em um coador de células de coleta.Quando toda a medula óssea tiver sido coletada, coe as peças da medula óssea através de um filtro de malha de 75 micrômetros e transfira a suspensão unicelular para um novo tubo de 50 mililitros. Sedimentar as células por centrifugação e resuspensar a pelota em 20 vezes 10 para as seis células por concentração de mililitro em PBS suplementada com 0,5%BSA. Em seguida, adicione 0,05 microgramas de anticorpo THI1 por um vezes 10 às seis células para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius.No final da incubação, lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS gelado e resuspenque a pelota em duas vezes 10 às sete células por concentração de mililitro em 0,5%BSA complementada com complemento de coelho 10% jovem e 2%DNAse em água estéril para uma incubação de 45 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, lave as células duas vezes com 15 mililitros de PBS fresco por lavagem e resuspenha a pelota em 20 mililitros de PBS contendo 0,5% de BSA. Acumule os linfonodos e o baço em um filtro de poros de 40 micrômetros e use um êmbolo de seringa para macerar os tecidos através dos filtros para liberar as células.Lave o coador e o êmbolo com meio RPMI suplementado com 1%FBS para coletar todas as células e sedimentar as células por centrifugação. Adicione cinco mililitros de tampão de lise ACK à pelota celular. Após cinco minutos em temperatura ambiente, pare a reação com cinco mililitros de médio suplementado com 1%FBS e pelota os glóbulos brancos por centrifugação.Resuspenda a pelota em cinco mililitros de tampão MACS para contagem e diluir as células para uma concentração de duas vezes 10 para as oito células por mililitro em tampão MACS fresco. Adicione a concentração apropriada de anticorpos anti-eritrócitos, anti-granulocitos, anti-células B e anticorpos anti-NK-nk-plotion de esgotamento por uma vez 10 às seis células para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células com 10 mililitros de tampão MACS frio e resuspenja a pelota em uma única vez 10 para as oito células por concentração mililitro em tampão MACS fresco.Em seguida, adicione 0,22 microliters de MicroEsferas Anti-Biotina por uma vezes 10 às seis células com mistura para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células com 10 mililitros de tampão MACS frio gelado e colete as células T enriquecidas sem limites por separação de contas magnéticas usando separador MACSxpress de acordo com protocolos padrão de isolamento de contas. No final da separação, sedimente as células T por centrifugação e resuspenda a pelota em cinco mililitros de tampão MACS fresco para contar.Para gerar células dendríticas derivadas da medula óssea, isole a medula óssea dos fêmures do tipo selvagem ou dos camundongos de knockout fator B como demonstrado e lise os glóbulos vermelhos em cinco mililitros de tampão de lise ACK, interrompendo a reação com 10 mililitros de RPMI complementados com 1% de FBS após cinco minutos. Depois de coletar as células sanguíneas inteiras por centrifugação, resuspengue a pelota em 10 mililitros de cultura média a duas vezes 10 a 6 células por concentração de mililitro e adicione 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF às células antes de semear 10 mililitros de células em placas de Petri individuais de 15 milímetros a 37 graus e 5% de dióxido de carbono por seis dias. No sexto dia, ative as culturas celulares dendríticas derivadas da medula óssea com 25 microgramas por mililitro de LPS por placa.Pelo menos 85% das células de medula óssea cultivadas se diferenciam em células dendríticas. A pureza das células T após o enriquecimento de contas magnéticas é de 90%O principal modelo de MHC incompatível C57BL/6 BALB/c corresponde intimamente ao desenvolvimento de GVHD após o transplante. O pico de gravidade ocorre aproximadamente 11 dias após a transferência celular, seguido de redução nos escores clínicos e recuperação do peso corporal até o dia 16.Os destinatários sucumbiram uniformemente ao GVHD por 30 a 40 dias após a transferência. Curiosamente, o transplante com células dendríticas de choque fator B melhora a sobrevivência do receptor e os escores clínicos de GVHD. O linfoma de células A20 B transduzidas pela luciferase permite o monitoramento do crescimento do tumor em animais vivos.Neste experimento representativo, todos os receptores balb/c do tipo selvagem que receberam medula óssea sozinhos mais A20 morreram de uma recaída tumoral. Receptores balb/c do tipo selvagem transplantados com células T de doadores derivados da medula óssea morreram de GVHD. Além disso, animais que receberam medula óssea doadora e células T empobrecidas por ACC1 morreram de GVHD e recaída tumoral.Para gerar células de medula óssea suficientes, os ossos coletados da tíbia e do fêmur devem estar completamente livres de tecido muscular antes da correção da medula óssea. A purificação negativa das células de medula óssea com biotinilase anti-CD3 e MicroEsferas Anti-Biotina também pode ser realizada para esgotar o linfócito da medula óssea.

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Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

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Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

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Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e permite repetitivas avaliações miniendoscópica do cólon distal in situ para a presença, as características e gravidade da inflamação do cólon dentro ao vivo ratos sofrem intestinal enxerto versus doença-- host.

Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

Descrevemos três métodos de transplante de medula óssea (TMO): TMO com irradiação total do corpo, TMO com irradiação blindada e método de TMO sem pré-condicionamento (TMO adotivo) para o estudo da hematopoiese clonal em modelos de camundongos.

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Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Aprenda uma plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro. Este método permite estudar respostas imunes pós-transplante.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

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