Isolação do globo ocular intacto para obter o tecido integral da superfície da ocular para a examinação histológica e immunohistochemistry
20 de outubro de 2019
Este protocolo descreve um método para o isolamento do globo ocular do rato com pálpebra, superfície ocular, segmentos anterior e posterior em posição relativamente intacta.
Nosso laboratório se concentra no desenvolvimento ocular e nas doenças. Este protocolo descreve um método para remover o crânio e os ossos orbitais sequencialmente da cabeça do rato dissecado. Deixando pálpebras, superfície ocular, lente, e a retina juntas inteiras. O protocolo beneficiará oftalmologistas interessados em didática de superfície ocular. Eu sou Dianlel Guo, para dizer a técnica com uma luta provável ao tentar evitar o dano do globo ocular, enquanto disseca os ossos faciais. A principal vantagem desta questão de dissecção é que a integridade da folha epitelial da superfície ocular está bem preservada e as diferentes partes da superfície ocular podem ser examinadas por histologia ou imunosmuntaining em uma única seção. Certifique-se de cortar todos os pequenos ossos e detritos dos tecidos moles. Razão, causará marcas de cicatrizes na seção de tecido caso contrário. Depois de eutanásia do rato, use um par de tesouras retas para cortar a cabeça e bissectá-la ao longo da linha média sagital começando no osso intraparietal rostrally até o nasal. Coloque cada metade da cabeça bisseccionada em uma placa de petri limpa e use uma tesoura afiada para cortar a mandíbula e a língua. Liberte o nervo óptico cortando-o do cérebro antes da localização do quiasmo óptico. E remova todos os tecidos cerebrais, incluindo a lâmpada olfativa, que está presa à parede do crânio. Agora todos os tecidos restantes devem ter todo o crânio e ossos orbitais associados com o globo ocular. Lave as partes restantes com PBS para limpar qualquer sangue e detritos capilares. Pré-fixar os tecidos colocando-os em um tubo de 50 mililitros contendo 4% de paraformaldeído e girando-os à temperatura ambiente. Depois que a prefixação estiver completa, lave rapidamente a cabeça dissecada no PBS três vezes para eliminar ainda mais os cabelos e fixações quebrados. Coloque o tecido em uma placa de petri de 10 centímetros e corte o crânio em três partes ao longo dos planos indicadas na figura um do protocolo de texto. O globo ocular e a tomada estão escondidos na parte média do crânio sob ossos ethmóides, frontais e maxilais. Use dois pares de fórceps retos número quatro para descascar o osso ethmóide e expor totalmente os ossos frontal e maxilar. Então, divida geograficamente a superfície do crânio em quatro áreas. Insira a ponta das fórceps curvas horizontalmente em cada área para remover os ossos maxilares e frontais sequencialmente. Depois disso, os ossos lacrimais e jugais subjacentes serão expostos. Remova os dois ossos e os músculos subcutâneos associados e gorduras ao redor do globo ocular. Corte o globo ocular com pálpebras presas e pele em um pequeno bloco quadrado para reduzir o volume do tecido e facilitar a orientação do tecido ao incorporar. Coloque o globo ocular e os tecidos associados de volta em 4% de paraformaldeído e continue a fixar durante a noite às 4
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Visão Geral
Este protocolo concentra-se em um método para isolar o globo ocular de camundongo com a pálpebra e a superfície ocular intactas, preservando sua anatomia para estudos anatômicos. A técnica é particularmente benéfica para oftalmologistas interessados em examinar superfícies oculares sem danificar tecidos delicados.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Desenvolvimento Ocular
- Doenças Oculares
- Histologia e Imunomarcação
Antecedentes
- Importância da preservação da integridade da superfície ocular
- Dificuldades na dissecação de olhos de camundongo sem danos
- Aplicações para a educação oftalmológica
Métodos Utilizados
- Remoção sequencial dos ossos cranianos e orbitais
- Modelo de camundongo
- Uso de paraformaldeído para fixação do tecido
Resultados Principais
- O protocolo preserva a lâmina epitelial da superfície ocular para exames posteriores
- Permite análise histológica ou por imunomarcação
- Apresenta técnicas eficazes para dissecção ocular
Conclusões
- O estudo demonstra um método confiável para o isolamento do globo ocular de camundongo com estruturas anexas
- Relevante para estudos relacionados à saúde ocular e doenças oculares
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preservação da integridade da lâmina epitelial da superfície ocular permite a avaliação paralela da conjuntiva palpebral, da conjuntiva bulbar e do epitélio corneano em modelos de doença. Esta abordagem favorece a redução de riscos mecanicistas ao permitir a avaliação simultânea de alterações patogenéticas em tecidos interconectados. Ela aumenta a confiança preditiva em estudos pré-clínicos que exigem arquitetura tecidual intacta para análises histológicas e de imuno-histoquímica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao preservar as relações espaciais dentro da lâmina epitelial da superfície ocular.
- Valor Operacional: Facilita a redução de riscos biológicos mediante o preparo de tecido intacto para exame histológico paralelo de alterações relacionadas à doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados com arquitetura da superfície ocular preservada para ensaios histológicos e imunomarcações subsequentes.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios ao minimizar a distorção tecidual durante a dissecação, melhorando a reprodutibilidade entre cortes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a integridade do sistema relevante para a doença, permitindo o alinhamento translacional de biomarcadores em regiões conectadas da superfície ocular.
- Valor Operacional: Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, preservando a morfologia do tecido para corte e análise consistentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia de descoberta ao permitir o preparo de tecidos intactos para leituras histológicas e de imuno-histocoloração que apoiam a testagem de hipóteses e a clarificação de vias.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses mediante a preservação da integridade da lâmina epitelial para exame paralelo das regiões conjuntival e corneal.
- Triagem: Melhora a prontidão do ensaio por meio do isolamento reprodutível do tecido, reduzindo a variabilidade no corte histológico.
- Análises: Permite medições quantitativas de variáveis dependentes por meio de imunomarcação e histologia em cortes teciduais íntegros.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica ao manter a arquitetura da superfície ocular para avaliação patológica consistente.
- Reutilização Institucional: Estabelece uma capacidade reutilizável de preparo da superfície ocular em múltiplos modelos de doenças e campanhas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da preservação da arquitetura tecidual, permitindo a análise simultânea de múltiplos compartimentos da superfície ocular.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de um protocolo de dissecação consistente, minimizando danos teciduais e artefatos de corte.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguir ou não prosseguir com base na redução da ambiguidade mecanicista em modelos de doenças oculares mediante avaliação de tecidos intactos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco possibilitada por dados histológicos e de imuno-histoquímica confiáveis obtidos a partir de preparações intactas da superfície ocular.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em técnicas de dissecação microcirúrgica para evitar danos teciduais durante a remoção óssea.
- Depende de tesouras afiadas e pinças finas para a separação precisa dos ossos do crânio e da órbita dos tecidos moles.
- Necessita de protocolos padronizados de fixação utilizando paraformaldeído para manter a integridade tecidual para o corte em micrótomo.
- Requer considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes sistemas modelo ou estágios de desenvolvimento.
- Limitação prática: a eficácia do procedimento depende da remoção completa dos detritos ósseos para prevenir artefatos no corte.
