Name: Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a análise de N-glicanos de IgG por cromatografia líquida de ultra-desempenho. Este método sensível e reprodutível permite separar isômeros de glicanos com baixo custo, auxiliando pesquisadores em diagnósticos médicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e da Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

Todos os assuntos incluídos no protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica capital, Pequim, China12. O consentimento informado escrito foi obtido de cada sujeito no início do estudo.
1. Isolamento igg
<ol><li>Prepare os produtos químicos, incluindo tampão de ligação (soisma tampão de fosfato, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutralizando buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), eluente: 0,1 M ácido fórmico (pH = 2,5), neutralizando a solução para eluente: 1 M amônio bicarbonato, tampão armazenado: 20% etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), solução de limpeza para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol. NOTA: O nível de pH é fundamental neste protocolo. A lusão do IgG requer um pH muito baixo, e há um risco de perda de ácidos siálicos devido à hidlíse ácida. Portanto, a elução ocorre em segundos, e o pH é rapidamente restaurado à neutralidade, preservando a integridade do IgG e dos ácidos síalicos.</li>
	<li>Prepare as amostras: descongele a amostra de plasma congelado e, em seguida, centrífuga a 80 x g por 10 min, e deixe a proteína G placa monolítica e os produtos químicos acima mencionados para 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Transfira uma amostra de 100 μL (que pode ser usada para detectar 2x para evitar a primeira falha) em uma placa de coleta de 2 mL (aqui, um total de seis amostras padrão, uma amostra de controle [água ultra-pura], e 89 amostras de plasma foram projetadas para 96 placas de poço e aleatoriamente atribuídas para a placa).</li>
	<li>Diluir as amostras com 1x PBS por 1:7 (v/v).</li>
	<li>Limpe uma placa de filtro hidrofílico de polipropileno (GHP) de 0,45 μm com 200 μL de água ultra-pura (repita 2x).</li>
	<li>Transfira as amostras diluídas para a placa de filtro e filtre as amostras na placa de coleta usando uma bomba de vácuo (pressão de vácuo de controle em 266,6-399,9 Pa).</li>
	<li>Preparação das placas monolíticas g proteicas<ol>
<li>Descarte o tampão de armazenamento.</li>
		<li>Limpe as placas monolíticas com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 1x PBS, 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico, 2 mL de 10x PBS, 2 mL de 1x PBS (sequencialmente), e remover o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira as amostras filtradas para a placa monolítica G de proteína para a ligação e limpeza igg, em seguida, limpe as placas monolíticas com 2 mL de 1x PBS (repita a limpeza 2x).</li>
	<li>Elute IgG com 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico e filtrar as amostras na placa de coleta por bomba de vácuo, em seguida, adicione 170 μL de 1 M bicarbonato de amônio na placa de coleta.</li>
	<li>Detectar a concentração de IgG usando um espectrômetro de absorção (comprimento de onda ideal = 280 nm).<ol>
<li>Abra o software e selecione o modo proteína-CY3.</li>
		<li>Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela (repita 1x).</li>
		<li>Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em Sample no software para detectar a água ultra-pura.</li>
		<li>Desenhe 2 μL de amostra IgG e carregue-a na tela e clique na Amostra no software para detectar a amostra.</li>
		<li>Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela.</li>
		<li>Feche o software. NOTA: A fórmula para calcular a concentração de IgG é a seguinte: CIgG = absorvente x coeficiente de extinção (13,7) x 1.000 μg/mL</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o IgG extraído para secar em forno a 60 °C e preserve o IgG extraído (300 μL extraído IgG por 4 h).<ol>
<li>Remover 300 μL de IgG extraído se a concentração for superior a 1.000 μg/mL.</li>
		<li>Remover 350 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 500-1.000 μg/mL.</li>
		<li>Remover 400 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 200-500 μg/mL.</li>
		<li>Remover 600 μL de IgG extraído se a concentração for menor que 200 μg/mL. NOTA: A concentração de IgG deve ser de preferência >200 μg/mL para detecção subsequente. A quantidade média de IgG deve ser de preferência >1,200 μg, que pode ser testado 2x no caso de o primeiro teste falhar.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza da proteína G placa monolítica para reutilização<ol>
<li>Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 1 mL de 0,1 M NaOH (para remover proteínas precipitadas), 4 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.</li>
		<li>Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 30% propan-2-ol (para remover proteínas hidrofóbicas encadernadas), 2 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.</li>
		<li>Lave a placa com 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) e adicione 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) para a placa, em seguida, deixe a placa em 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Liberação de glicano
<ol><li>Prepare o IgG seco e armazenar os produtos químicos, incluindo 1,33% SDS, 4% Igepal (loja longe da luz), e 5x PBS na RT.</li>
	<li>Prepare a enzima PNGase F diluindo a enzima 250 U com 250 μL de água ultra-pura.</li>
	<li>Desnaturação do IgG<ol>
<li>Adicione 30 μL de 1,33% SDS e misture vórtice, transfira a amostra para um forno de 65 °C por 10 min, em seguida, retire-o do forno e deixe descansar por 15 min.</li>
		<li>Adicione 10 μL de 4% igepal e coloque-o na incubadora tremer por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remoção e liberação de glicanos<ol>
<li>Adicione 20 μL de 5x PBS e 30-35 μL de 0,1 mol/L NaOH para regular um pH de 8,0, e misture vórtice. Adicione 4 μL de enzima PNGase F e misture vórtice. Em seguida, incubar por 18-20 h em um banho de água 37 °C.</li>
		<li>Coloque os glicanos liberados para secar em um forno a 60 °C para 2,5-3,0 h.</li>
		<li>Salve os glicanos liberados a -80 °C até mais medições. NOTA: Este passo é fundamental. A chave para a liberação de glicano é melhorar a atividade da enzima PNGase F para maximizar sua eficiência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Rotulagem e purificação de glicanos
<ol><li>Prepare o reagente de rotulagem 2-aminobenzamida (2-AB) com 0,70 mg de 2-AB, 10,50 μL de ácido acético, 6 mg de cianoboroborodiride de sódio (NaBH3CN) e 24,50 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) (volume total = 35 μL). Em seguida, adicione o ácido acético, 2-AB, e NaBH3CN no DMSO em ordem.</li>
	<li>Rotular os glicanos usando 35 μL de reagente de rotulagem 2-AB, transfira os glicanos rotulados para o oscilador por 5 min, transfira para o forno por 3 h a 65 °C e, em seguida, transfira para a RT por 30 min. NOTA: Toda a etapa de rotulagem de glicanos deve ser realizada enquanto protegida da luz.</li>
	<li>Pré-trate uma placa de filtro GHP de 0,2 μm com 200 μL de 70% de etanol, 200 μL de água ultra-pura e 200 μL de 96% acetônio (4 °C), depois remova resíduos usando uma bomba de vácuo.</li>
	<li>Purificação de glicano rotulado de 2 AB<ol>
<li>Adicione 700 μL de 100% acetônio ao glicano rotulado de 2 AB e transfira para uma incubadora tremer por 5 min.</li>
		<li>Centrífuga a 134 x g por 5 min (4 °C).</li>
		<li>Transfira a amostra para uma placa de filtro GHP de 0,2 μm por 2 min e remova a filtragem (líquido corrente) usando uma bomba de vácuo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave glican rotulado 2-AB com 200 μL de 96% acetonitrile (4 °C) e retire o filtrado (líquido fluindo) usando uma bomba de vácuo 5x-6x.</li>
	<li>Glican rotulado como Elute 2-AB com 100 μL de água ultra-pura 3x.</li>
	<li>Transfira o glicano rotulado de 2 AB para um forno para secar a 60 °C por 3,5 h.</li>
	<li>Salve os n-glicanos rotulados em -80 °C até mais medição.</li>
</ol>4. Cromatografia de interação hidrofílica e análise de glicanos
<ol><li>Condicionamento de instrumentos UPLC e preparação de fases móveis<ol>
<li>Prepare fases móveis, incluindo solvente A: formato de amônio de 100 mM (pH = 4,4), solvente B: 100% acetônio, solvente C: 90% de água ultra-pura (10% metanol) e solvente D: 50% metanol (água ultra-pura).</li>
		<li>Abra o software para controlar as fases móveis.</li>
		<li>Lave instrumentos UPLC a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) equilibrando-se por 30 min, depois a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) equilibrando-se por 20 min, em seguida, uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min equilíbrio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolva os n-glicanos rotulados com 25 μL de uma mistura de 100% acetônio e água ultra-pura em uma proporção de 2:1 (v/v). Em seguida, centrífuga a 134 × g por 5 min (4 °C) e carregar 10 μL do N-glicans rotulados nos instrumentos UPLC.</li>
	<li>Separe os n-glicanos rotulados a uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min com um gradiente linear de 75% a 62% acetônio por 25 min. Em seguida, realize uma coluna analítica de escada/glicopeptide em um UPLC a 60 °C (aqui, as amostras foram mantidas a 4 °C antes da injeção).</li>
	<li>Detecte n- fluorescência glicana na excitação e emissões comprimentos de onda de 330 nm e 420 nm, respectivamente.</li>
	<li>Integrar os glicanos com base no pico de posição e tempo de retenção.</li>
	<li>Calcule o valor relativo de cada Pico glicano (GP) / todos os picos de glicanos (GPs) (porcentagem, %) da seguinte forma: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
<li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Glycosylation+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392(2013).</li>
<li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65(2018).</li>
<li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).</li>
<li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).</li>
<li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).</li>
<li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).</li>
<li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

UPLC serve como um método de análise quantitativa relativa5,15. Os resultados indicam que o UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e precisão quantitativa relativa. A quantidade de glicanos em cada pico é expressa como uma porcentagem da área integrada total usando UPLC, que é o valor relativo. A quantificação relativa melhora a comparabilidade das amostras de teste. Além disso, 96 placas G de proteína bem são usadas para purificar o...

N-glicosilação de proteínas humanas é uma modificação pós-translacional comum e essencial1 e pode ajudar a prever a ocorrência e o desenvolvimento de doenças com relativa precisão. Devido à complexidade de sua estrutura, espera-se que existam mais de 5.000 estruturas glicanas, proporcionando grande potencial como biomarcadores diagnósticos e preditivos para doenças2. N-glicanos ligados à imunoglobulina G (IgG) têm se mostrado essenciais para a função da IgG, e a IgG N-glicosilação participa do equilíbrio entre os sistemas pró e antiinflamatórios3. A glicosilação diferencial igg nestá envolvida no desenvolvimento e progressão da doença, representando tanto uma predisposição quanto um mecanismo funcional envolvido na patologia da doença. O papel inflamatório do IgG N-glicosilação tem sido associado ao envelhecimento, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer4.
Com o desenvolvimento da tecnologia de detecção, os seguintes métodos são mais amplamente utilizados em glifosas de alta produtividade: cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho com detecção de fluorescência (UPLC-FLR), eletroforese de gel capilar multiplex com fluores induzidos por laser detecção de cência (xCGE-LIF), desintoxicação/ionização assistida por matriz tipode espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) e espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-ESI-MS) . Estes métodos superaram deficiências anteriores de baixo fluxo, resultados instáveis e baixa especificidade de sensibilidade5,6.
UPLC é amplamente utilizado para explorar a associação entre IgG N-glicosilação e certas doenças (ou seja, envelhecimento7, obesidade8, disslipidemia9, diabetes tipo II10, hipertensão11, acidente vascular cerebral isquêmico12, e doença de Parkinson13). Em comparação com os outros três métodos acima mencionados, uplc tem as seguintes vantagens5,14. Primeiro, ele fornece um método de análise quantitativa relativa, e a análise de dados que envolve a normalização total da área melhora a comparabilidade de cada amostra. Em segundo lugar, o custo do equipamento e a experiência necessária são relativamente baixos, o que facilita a implementação e transformação de biomarcadores de glicosilação em aplicações clínicas. Apresentado aqui é uma introdução ao UPLC para que ele possa ser mais amplamente utilizado.

<table><tbody><tr><td>2-aminobenzamida, 2-AB</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de coleta de 96 poços</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa filtrante de 96 poços</td><td>Pol</td><td>0,45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>Placa monolítica de 96 poços</td><td>BIA Separações</td> Rotor de placa de 96 poços <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formato de amônio</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação constante / balancim</td><td>Zhicheng instrumento analítico manufacturing co., Ltd, China</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Escada de calibração de dextrano / coluna de glicopeptídeo</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>Coluna</td><td></td>BEH</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dissódico</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fornos elétricos</td><td>Tester instruments Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technology Co., Ltd, America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Kit de rotulagem</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de baixa temperatura</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de baixa temperatura</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manifold 96 poços</td><td>placa Watts tecnologia Co., Ltd, China</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de água pura</td><td>Millipore Co., Ltd, América</td><td>Vantagem A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Testador de PH</td><td>Sartorius Co., Ltd, Alemanha</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>4672100, 0.5-10&mu; l & 10-100&mu; l & 20-200&mu; l & 1000&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F enzima</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN)</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de transferência de líquido</td><td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, América</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de temperatura ultrabaixa</td><td>Thermo Co., Ltd, América</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia líquida de ultra-desempenho</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de</td><td>vácuo Watts technology Co., Ltd, China</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de volatilização / secador</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos Co. do verificador</td> <td>do banho-maria</td>, Ltd <td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>Balança de pesagem</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de imunoglobulina g n-glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics é uma nova subespecialidade em pesquisa do sistema de omics que oferece um potencial significativo na descoberta de biomarcadores de última geração para a suscetibilidade à doença, descoberta de alvos de medicamentos e medicina de precisão. Os glicanos alternativos de IgG Nforam relatados em diversas doenças crônicas comuns e sugeridos ter o grande potencial em aplicações clínicas (isto é, biomarcadores para o diagnóstico e a predição das doenças). Os igg n-glicanos são amplamente caracterizados usando o método de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho (UPLC). A UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e alta precisão quantitativa relativa. Além disso, a estrutura do IgG N-glicano é claramente separada, e a composição glicana e a abundância relativa no plasma são caracterizadas.

Como mostrado na Figura 1,IgG N-glicanos foram analisados em 24 picos iniciais de glicoglicemia IgG (GPs) com base no pico de posição e tempo de retenção. As estruturas N-glicanestão disponíveis através da detecção de espectrometria de massa de acordo com um estudo anterior ( Tabela1)15. Para garantir que os resultados fossem comparáveis, foi aplicada normalização total da área, na qual a quantidade d...

A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Cromatografia líquida de ultra-desempenho é tecnologia estabelecida para análise precisa do IgG n-glycan Devido à sua sensibilidade parece ser e tem capacidade de fornecer uma informação específica de glicano Este método é fácil de usar e tem um número de diferentes custos relativamente baixos de incrementos, alta reprodutibilidade A capacidade de isômeros glicanos. As medidas de proteína no plasma podem ser atraentes. na medicina.também associado ao IgG na base glicose e tal e biológico contendo a população. Você sabe que o estado impuro é usado para testar IgG em glicanes. Na verdade, pode testar n-glicanos de proteína.Isso é necessário em uma proteína transversal de dois estados puros pode ser aplicado à proteína O processo experimental or é relativamente simples enquanto o processo experimental precisa ser padronizado. O processo experimental de ponta a ponta leva três dias para funcionar, e as etapas experimentais precisam ser memorizadas para dominar as habilidades experimentais. Para preparar as amostras, descongele a amostra de plasma congelado.Em seguida, centrífuga a 80 vezes G por 10 minutos. Deixe a placa monolítica proteína G em temperatura ambiente por 30 minutos. Tra

immunoglobulin-g-n-glycan-analysis-ultra-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Este vídeo demonstra o princípio da separação de compostos polares hidrofílicos usando cromatografia líquida de interação hidrofílica. Essa técnica auxilia na purificação de vários analitos polares, incluindo N-glicanos.

Cromatografia Líquida de Interação Hidrofílica: Uma Técnica para Separar Analitos Polares Hidrofílicos Usando Grânulos Hidrofílicos

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Este artigo apresenta uma forma aprimorada de uma nova técnica de glicômica de baixo para cima projetada para analisar o perfil de composição agrupado de glicanos em biofluidos não fracionados por meio da decomposição química de glicanos em seus monossacarídeos específicos de ligação constituinte para detecção por GC-MS. As aplicações potenciais incluem a detecção precoce de câncer e outros distúrbios afetivos glicanos.

Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Este trabalho mostra o potencial da tecnologia de matriz (PGA) glicano impressa para a análise de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação.

Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação

Um protocolo detalhado para a purificação e a análise subseqüente de um anticorpo monoclonal do líquido de cultura de pilha colhido (HCCF) de microbioreactors automatizados foi descrito. O uso de análises para determinar os atributos críticos de qualidade (CQAs) e maximizar o volume de amostra limitado para extrair informações vitais também é apresentado.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

O padrão de glicosylation de um anticorpo determina seu desempenho clínico, assim persistem os esforços industriais e acadêmicos para controlar a glicosylation. Uma vez que as campanhas típicas de glicoengenia são tempo e trabalhoso, a geração de um protocolo rápido para caracterizar o impacto dos genes de glicosylação usando silenciamento transitório seria útil.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada que oferece informações abrangentes sobre o glicoproteoma heterogêneo em microambientes tumorais complexos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos 

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a liberação de O-glicanos das mucinas e a subsequente dessalinização, permetilação e análise usando espectrometria de massa MALDI-TOF.

Perfil de O-glicanos de mucina permetilada usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz

Aprenda a análise de N-glicanos de IgG por cromatografia líquida de ultra-desempenho. Este método sensível e reprodutível permite separar isômeros de glicanos com baixo custo, auxiliando pesquisadores em diagnósticos médicos.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Explorar mais vídeos