Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Cromatografia líquida de ultra-desempenho é tecnologia estabelecida para análise precisa do IgG n-glycan Devido à sua sensibilidade parece ser e tem capacidade de fornecer uma informação específica de glicano Este método é fácil de usar e tem um número de diferentes custos relativamente baixos de incrementos, alta reprodutibilidade A capacidade de isômeros glicanos. As medidas de proteína no plasma podem ser atraentes. na medicina.

também associado ao IgG na base glicose e tal e biológico contendo a população. Você sabe que o estado impuro é usado para testar IgG em glicanes. Na verdade, pode testar n-glicanos de proteína.

Isso é necessário em uma proteína transversal de dois estados puros pode ser aplicado à proteína O processo experimental or é relativamente simples enquanto o processo experimental precisa ser padronizado. O processo experimental de ponta a ponta leva três dias para funcionar, e as etapas experimentais precisam ser memorizadas para dominar as habilidades experimentais. Para preparar as amostras, descongele a amostra de plasma congelado.

Em seguida, centrífuga a 80 vezes G por 10 minutos. Deixe a placa monolítica proteína G em temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira 100 micrômetros de amostra para cada poço da placa de coleta de dois mililitros.

Adicione água ultra pura como uma amostra de controle. Diluir as amostras com um X PBS por um a sete volumes por relação de volume. Limpe uma placa de filtro de polipropolen hidrofílico de 0,45 míclica com 200 microliters de água ultra pura.

Repita a limpeza duas vezes adicionais. Transfira as amostras diluídas para a placa do filtro e filtre as amostras na placa coletiva usando uma bomba de vácuo com pressão de 266,6 a 399,9 Pascals. Para preparar as placas monolíticas da proteína G, primeiro descarte o tampão de armazenamento.

Limpe as placas monolíticas com dois mililitros de água ultra pura, dois mililitros de um X PBS, um mililitro de ácido fórmico molar de 0,17, dois mililitros de 10 X PBS, e dois mililitros de um X PBS sequencialmente. Remova o seguinte líquido usando uma bomba de vácuo. Utilizando um tubo multicanal, transfira as amostras filtradas para a placa monolitosa de proteína G para ligação e limpeza de IgG.

Em seguida, adicione dois mililitros de um X PBS para limpar as placas monolíticas. Remova o PBS usando uma bomba de vácuo e repita a limpeza duas vezes adicionais. Illute IgG com um mililitro de ácido fórmico molar de 0,17, e filtrar as amostras na placa de coleta por bomba de vácuo.

Em seguida, adicione 170 microliters de um bicarbonato de amônio molar na placa de coleta. Detecte a concentração de IgG usando um espectetômetro de absorção no comprimento de onda ideal de 280 nanômetros. Coloque o IgG extraído em um forno para secar a 60 graus Celsius por três horas.

Determine a quantidade a ser observada de acordo com sua concentração, conforme descrito no manuscrito, e preserve-a em menos 80 graus Celsius. Reúna o IgG seco e armazene produtos químicos incluindo 1,33% SDS, 4% IgePal e 5% PBS à temperatura ambiente. Prepare a enzima F indoglycosidase diluindo 250 unidades de enzima com 250 microliters de água ultra pura.

Para desnaturar o IgG, adicione 30 microliters de 1,33% SDS e misture por vórtice. Transfira a amostra para um forno Celsius de 65 graus por 10 minutos. Em seguida, retire-o do forno e deixe esfriar por 15 minutos.

Adicione 10 microliters de 4% IgePal na mesma amostra e coloque-o em uma incubadora de agitação por cinco minutos. Adicione 20 microliters de cinco X PBS e 30 a 35 microliters de 0,1 hidróxido de sódio molar para regular o pH a 8,0, e misture por vórtice. Adicione quatro microliters de enzima Endoglycosidase F, e misture por vórtice.

Em seguida, incubar por 18 a 20 horas em um banho de água de 37 graus Celsius. No dia seguinte, coloque os gylcans soltos em um forno a 60 graus Celsius para secar por duas horas e meia a três horas. Salve os glicanos de liberação a menos 80 graus Celsius até uma nova medição.

Prepare o reagente de rotulagem de amino benzimida com 24,5 microliters de DMSO, 10,5 microliters de ácido acético, 0,7 miligramas de dois amino benzimida e seis miligramas de cianoboroidido de sódio. Em seguida, em uma sala escura, rotule os glicanos adicionando 35 microliters de dois reagentes de rotulagem amino benzimida. Transfira os glcans rotulados para um oscilador por cinco minutos e, em seguida, transfira-o para o forno por três horas a 65 graus Celsius.

Depois disso, transfira para temperatura ambiente por 30 minutos. O IgG n-glycase, vamos rotulá-lo com a fim de ser detectado pela detectagem fluorescente de estado impuro. Pré-tree uma placa de filtro GHP de 0,2 mícrons com 200 microliters de 70% de etanol, 200 microliters de água ultra pura e 200 microliters de 96% aceto nitrito a quatro graus Celsius.

Em seguida, remova o resíduo usando uma bomba de vácuo. Para purificar os dois glimices rotulados de amino benzimida, adicione 700 microlitadores de 100% acetonitrilo à amostra e transfira-o para uma incubadora de agitação por cinco minutos. Centrifugar a 134 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Transfira o supernassente para uma placa de filtro GHP de 0,2 mícrons por dois minutos e remova o filtrado usando o vácuo. Lave os dois amino benzimídeos rotulados de glycan com 200 microlitres de 96% de acetonitrilo a quatro graus Celsius, e remova o filtrado usando uma bomba de vácuo de cinco a seis vezes. Illute dois amino benzimida rotulado glycan com 100 microliters de água ultra pura três vezes.

Transfira os dois amino benzímidas rotulados glicocano em um forno para secar a 60 graus Celsius por três horas e meia. Salve os n-glicocanos rotulados a menos 80 graus Celsius até uma nova medição. Primeiro, abra o software para controlar as fases móveis.

Lave os instrumentos UPLC com 50% de solvente B e 50% de solvente C na vazão de 0,2 mililitros por minuto durante 30 minutos. Em seguida, lave com 25% de solvente A e 75% solvente B a uma vazão de 0,2 mililitros por minuto durante 20 minutos. Em seguida, adicione uma taxa de fluxo de 0,4 mililitros por minuto.

Dissolva os n-glicanos rotulados com 25 microliters de uma mistura de 100% de acetonitrilo e água ultra pura em uma proporção de volume de dois a um. Em seguida, centrífugas a 134 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, e use um tubo seco para carregar 10 microlitadores da supernênite nos instrumentos UPLC. Separe os n-glicanos rotulados à taxa de fluxo de 0,4 mililitros por minuto com um gradiente linear de 75% a 62% de acetonitrilo por 25 minutos.

Em seguida, execute uma análise da coluna de glycopeptida escada de calibração Dexteran em um UPLC a 60 graus Celsius. Detecte fluorescentes n-glicanos em citação X e comprimentos de onda de emissão de 330 nanômetros e 420 nanômetros, respectivamente. Como mostrado nesta figura, os n-glycanos IgG foram analisados em 24 picos iniciais de glicocano IgG com base na posição de pico e tempo de retenção.

As estruturas n-glycan estão disponíveis em 24 tipos através da detecção de espectrometria de massa. Para acotoar a repetibilidade e estabilidade do método, a amostra padrão foi testada em paralelo seis vezes. Os picos glicanos com proporções relativamente pequenas apresentaram altos erros de medição de mais de 10% de coeficiente de variação.

Na peça e importante para se formar a uma estrutura IgG n-glycan, especialmente para o estabelecimento do terminal Portanto, em vez de 3,3 IgG n-glycase encontrado é fundamental nesta a importância do IgG. Os glicanos são conhecidos por serem diferentes. Com os desenvolvimentos da protomica glican, combinados em glicanos para explorar informações para isso, pode ser usado como potencial para o diagnóstico atual.

Após esse desenvolvimento de técnica, ele fornece uma nova maneira de explorar o