Name: Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a análise de N-glicanos de IgG por cromatografia líquida de ultra-desempenho. Este método sensível e reprodutível permite separar isômeros de glicanos com baixo custo, auxiliando pesquisadores em diagnósticos médicos.

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Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e da Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

Todos os assuntos incluídos no protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica capital, Pequim, China12. O consentimento informado escrito foi obtido de cada sujeito no início do estudo.
1. Isolamento igg
<ol><li>Prepare os produtos químicos, incluindo tampão de ligação (soisma tampão de fosfato, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutralizando buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), eluente: 0,1 M ácido fórmico (pH = 2,5), neutralizando a solução para eluente: 1 M amônio bicarbonato, tampão armazenado: 20% etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), solução de limpeza para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol. NOTA: O nível de pH é fundamental neste protocolo. A lusão do IgG requer um pH muito baixo, e há um risco de perda de ácidos siálicos devido à hidlíse ácida. Portanto, a elução ocorre em segundos, e o pH é rapidamente restaurado à neutralidade, preservando a integridade do IgG e dos ácidos síalicos.</li>
	<li>Prepare as amostras: descongele a amostra de plasma congelado e, em seguida, centrífuga a 80 x g por 10 min, e deixe a proteína G placa monolítica e os produtos químicos acima mencionados para 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Transfira uma amostra de 100 μL (que pode ser usada para detectar 2x para evitar a primeira falha) em uma placa de coleta de 2 mL (aqui, um total de seis amostras padrão, uma amostra de controle [água ultra-pura], e 89 amostras de plasma foram projetadas para 96 placas de poço e aleatoriamente atribuídas para a placa).</li>
	<li>Diluir as amostras com 1x PBS por 1:7 (v/v).</li>
	<li>Limpe uma placa de filtro hidrofílico de polipropileno (GHP) de 0,45 μm com 200 μL de água ultra-pura (repita 2x).</li>
	<li>Transfira as amostras diluídas para a placa de filtro e filtre as amostras na placa de coleta usando uma bomba de vácuo (pressão de vácuo de controle em 266,6-399,9 Pa).</li>
	<li>Preparação das placas monolíticas g proteicas<ol>
<li>Descarte o tampão de armazenamento.</li>
		<li>Limpe as placas monolíticas com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 1x PBS, 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico, 2 mL de 10x PBS, 2 mL de 1x PBS (sequencialmente), e remover o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira as amostras filtradas para a placa monolítica G de proteína para a ligação e limpeza igg, em seguida, limpe as placas monolíticas com 2 mL de 1x PBS (repita a limpeza 2x).</li>
	<li>Elute IgG com 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico e filtrar as amostras na placa de coleta por bomba de vácuo, em seguida, adicione 170 μL de 1 M bicarbonato de amônio na placa de coleta.</li>
	<li>Detectar a concentração de IgG usando um espectrômetro de absorção (comprimento de onda ideal = 280 nm).<ol>
<li>Abra o software e selecione o modo proteína-CY3.</li>
		<li>Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela (repita 1x).</li>
		<li>Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em Sample no software para detectar a água ultra-pura.</li>
		<li>Desenhe 2 μL de amostra IgG e carregue-a na tela e clique na Amostra no software para detectar a amostra.</li>
		<li>Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela.</li>
		<li>Feche o software. NOTA: A fórmula para calcular a concentração de IgG é a seguinte: CIgG = absorvente x coeficiente de extinção (13,7) x 1.000 μg/mL</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o IgG extraído para secar em forno a 60 °C e preserve o IgG extraído (300 μL extraído IgG por 4 h).<ol>
<li>Remover 300 μL de IgG extraído se a concentração for superior a 1.000 μg/mL.</li>
		<li>Remover 350 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 500-1.000 μg/mL.</li>
		<li>Remover 400 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 200-500 μg/mL.</li>
		<li>Remover 600 μL de IgG extraído se a concentração for menor que 200 μg/mL. NOTA: A concentração de IgG deve ser de preferência >200 μg/mL para detecção subsequente. A quantidade média de IgG deve ser de preferência >1,200 μg, que pode ser testado 2x no caso de o primeiro teste falhar.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza da proteína G placa monolítica para reutilização<ol>
<li>Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 1 mL de 0,1 M NaOH (para remover proteínas precipitadas), 4 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.</li>
		<li>Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 30% propan-2-ol (para remover proteínas hidrofóbicas encadernadas), 2 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.</li>
		<li>Lave a placa com 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) e adicione 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) para a placa, em seguida, deixe a placa em 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Liberação de glicano
<ol><li>Prepare o IgG seco e armazenar os produtos químicos, incluindo 1,33% SDS, 4% Igepal (loja longe da luz), e 5x PBS na RT.</li>
	<li>Prepare a enzima PNGase F diluindo a enzima 250 U com 250 μL de água ultra-pura.</li>
	<li>Desnaturação do IgG<ol>
<li>Adicione 30 μL de 1,33% SDS e misture vórtice, transfira a amostra para um forno de 65 °C por 10 min, em seguida, retire-o do forno e deixe descansar por 15 min.</li>
		<li>Adicione 10 μL de 4% igepal e coloque-o na incubadora tremer por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remoção e liberação de glicanos<ol>
<li>Adicione 20 μL de 5x PBS e 30-35 μL de 0,1 mol/L NaOH para regular um pH de 8,0, e misture vórtice. Adicione 4 μL de enzima PNGase F e misture vórtice. Em seguida, incubar por 18-20 h em um banho de água 37 °C.</li>
		<li>Coloque os glicanos liberados para secar em um forno a 60 °C para 2,5-3,0 h.</li>
		<li>Salve os glicanos liberados a -80 °C até mais medições. NOTA: Este passo é fundamental. A chave para a liberação de glicano é melhorar a atividade da enzima PNGase F para maximizar sua eficiência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Rotulagem e purificação de glicanos
<ol><li>Prepare o reagente de rotulagem 2-aminobenzamida (2-AB) com 0,70 mg de 2-AB, 10,50 μL de ácido acético, 6 mg de cianoboroborodiride de sódio (NaBH3CN) e 24,50 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) (volume total = 35 μL). Em seguida, adicione o ácido acético, 2-AB, e NaBH3CN no DMSO em ordem.</li>
	<li>Rotular os glicanos usando 35 μL de reagente de rotulagem 2-AB, transfira os glicanos rotulados para o oscilador por 5 min, transfira para o forno por 3 h a 65 °C e, em seguida, transfira para a RT por 30 min. NOTA: Toda a etapa de rotulagem de glicanos deve ser realizada enquanto protegida da luz.</li>
	<li>Pré-trate uma placa de filtro GHP de 0,2 μm com 200 μL de 70% de etanol, 200 μL de água ultra-pura e 200 μL de 96% acetônio (4 °C), depois remova resíduos usando uma bomba de vácuo.</li>
	<li>Purificação de glicano rotulado de 2 AB<ol>
<li>Adicione 700 μL de 100% acetônio ao glicano rotulado de 2 AB e transfira para uma incubadora tremer por 5 min.</li>
		<li>Centrífuga a 134 x g por 5 min (4 °C).</li>
		<li>Transfira a amostra para uma placa de filtro GHP de 0,2 μm por 2 min e remova a filtragem (líquido corrente) usando uma bomba de vácuo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave glican rotulado 2-AB com 200 μL de 96% acetonitrile (4 °C) e retire o filtrado (líquido fluindo) usando uma bomba de vácuo 5x-6x.</li>
	<li>Glican rotulado como Elute 2-AB com 100 μL de água ultra-pura 3x.</li>
	<li>Transfira o glicano rotulado de 2 AB para um forno para secar a 60 °C por 3,5 h.</li>
	<li>Salve os n-glicanos rotulados em -80 °C até mais medição.</li>
</ol>4. Cromatografia de interação hidrofílica e análise de glicanos
<ol><li>Condicionamento de instrumentos UPLC e preparação de fases móveis<ol>
<li>Prepare fases móveis, incluindo solvente A: formato de amônio de 100 mM (pH = 4,4), solvente B: 100% acetônio, solvente C: 90% de água ultra-pura (10% metanol) e solvente D: 50% metanol (água ultra-pura).</li>
		<li>Abra o software para controlar as fases móveis.</li>
		<li>Lave instrumentos UPLC a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) equilibrando-se por 30 min, depois a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) equilibrando-se por 20 min, em seguida, uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min equilíbrio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolva os n-glicanos rotulados com 25 μL de uma mistura de 100% acetônio e água ultra-pura em uma proporção de 2:1 (v/v). Em seguida, centrífuga a 134 × g por 5 min (4 °C) e carregar 10 μL do N-glicans rotulados nos instrumentos UPLC.</li>
	<li>Separe os n-glicanos rotulados a uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min com um gradiente linear de 75% a 62% acetônio por 25 min. Em seguida, realize uma coluna analítica de escada/glicopeptide em um UPLC a 60 °C (aqui, as amostras foram mantidas a 4 °C antes da injeção).</li>
	<li>Detecte n- fluorescência glicana na excitação e emissões comprimentos de onda de 330 nm e 420 nm, respectivamente.</li>
	<li>Integrar os glicanos com base no pico de posição e tempo de retenção.</li>
	<li>Calcule o valor relativo de cada Pico glicano (GP) / todos os picos de glicanos (GPs) (porcentagem, %) da seguinte forma: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
<li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Glycosylation+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392(2013).</li>
<li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65(2018).</li>
<li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).</li>
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<li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).</li>
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<li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

UPLC serve como um método de análise quantitativa relativa5,15. Os resultados indicam que o UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e precisão quantitativa relativa. A quantidade de glicanos em cada pico é expressa como uma porcentagem da área integrada total usando UPLC, que é o valor relativo. A quantificação relativa melhora a comparabilidade das amostras de teste. Além disso, 96 placas G de proteína bem são usadas para purificar o...

N-glicosilação de proteínas humanas é uma modificação pós-translacional comum e essencial1 e pode ajudar a prever a ocorrência e o desenvolvimento de doenças com relativa precisão. Devido à complexidade de sua estrutura, espera-se que existam mais de 5.000 estruturas glicanas, proporcionando grande potencial como biomarcadores diagnósticos e preditivos para doenças2. N-glicanos ligados à imunoglobulina G (IgG) têm se mostrado essenciais para a função da IgG, e a IgG N-glicosilação participa do equilíbrio entre os sistemas pró e antiinflamatórios3. A glicosilação diferencial igg nestá envolvida no desenvolvimento e progressão da doença, representando tanto uma predisposição quanto um mecanismo funcional envolvido na patologia da doença. O papel inflamatório do IgG N-glicosilação tem sido associado ao envelhecimento, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer4.
Com o desenvolvimento da tecnologia de detecção, os seguintes métodos são mais amplamente utilizados em glifosas de alta produtividade: cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho com detecção de fluorescência (UPLC-FLR), eletroforese de gel capilar multiplex com fluores induzidos por laser detecção de cência (xCGE-LIF), desintoxicação/ionização assistida por matriz tipode espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) e espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-ESI-MS) . Estes métodos superaram deficiências anteriores de baixo fluxo, resultados instáveis e baixa especificidade de sensibilidade5,6.
UPLC é amplamente utilizado para explorar a associação entre IgG N-glicosilação e certas doenças (ou seja, envelhecimento7, obesidade8, disslipidemia9, diabetes tipo II10, hipertensão11, acidente vascular cerebral isquêmico12, e doença de Parkinson13). Em comparação com os outros três métodos acima mencionados, uplc tem as seguintes vantagens5,14. Primeiro, ele fornece um método de análise quantitativa relativa, e a análise de dados que envolve a normalização total da área melhora a comparabilidade de cada amostra. Em segundo lugar, o custo do equipamento e a experiência necessária são relativamente baixos, o que facilita a implementação e transformação de biomarcadores de glicosilação em aplicações clínicas. Apresentado aqui é uma introdução ao UPLC para que ele possa ser mais amplamente utilizado.

<table><tbody><tr><td>2-aminobenzamida, 2-AB</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de coleta de 96 poços</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa filtrante de 96 poços</td><td>Pol</td><td>0,45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>Placa monolítica de 96 poços</td><td>BIA Separações</td> Rotor de placa de 96 poços <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formato de amônio</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação constante / balancim</td><td>Zhicheng instrumento analítico manufacturing co., Ltd, China</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Escada de calibração de dextrano / coluna de glicopeptídeo</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>Coluna</td><td></td>BEH</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dissódico</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fornos elétricos</td><td>Tester instruments Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technology Co., Ltd, America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Kit de rotulagem</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de baixa temperatura</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de baixa temperatura</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manifold 96 poços</td><td>placa Watts tecnologia Co., Ltd, China</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de água pura</td><td>Millipore Co., Ltd, América</td><td>Vantagem A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Testador de PH</td><td>Sartorius Co., Ltd, Alemanha</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>4672100, 0.5-10&mu; l & 10-100&mu; l & 20-200&mu; l & 1000&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F enzima</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN)</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de transferência de líquido</td><td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, América</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de temperatura ultrabaixa</td><td>Thermo Co., Ltd, América</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia líquida de ultra-desempenho</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de</td><td>vácuo Watts technology Co., Ltd, China</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de volatilização / secador</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemanha</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos Co. do verificador</td> <td>do banho-maria</td>, Ltd <td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>Balança de pesagem</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de imunoglobulina g n-glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics é uma nova subespecialidade em pesquisa do sistema de omics que oferece um potencial significativo na descoberta de biomarcadores de última geração para a suscetibilidade à doença, descoberta de alvos de medicamentos e medicina de precisão. Os glicanos alternativos de IgG Nforam relatados em diversas doenças crônicas comuns e sugeridos ter o grande potencial em aplicações clínicas (isto é, biomarcadores para o diagnóstico e a predição das doenças). Os igg n-glicanos são amplamente caracterizados usando o método de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho (UPLC). A UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e alta precisão quantitativa relativa. Além disso, a estrutura do IgG N-glicano é claramente separada, e a composição glicana e a abundância relativa no plasma são caracterizadas.

Como mostrado na Figura 1,IgG N-glicanos foram analisados em 24 picos iniciais de glicoglicemia IgG (GPs) com base no pico de posição e tempo de retenção. As estruturas N-glicanestão disponíveis através da detecção de espectrometria de massa de acordo com um estudo anterior ( Tabela1)15. Para garantir que os resultados fossem comparáveis, foi aplicada normalização total da área, na qual a quantidade d...

A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Cromatografia líquida de ultra-desempenho é tecnologia estabelecida para análise precisa do IgG n-glycan Devido à sua sensibilidade parece ser e tem capacidade de fornecer uma informação específica de glicano Este método é fácil de usar e tem um número de diferentes custos relativamente baixos de incrementos, alta reprodutibilidade A capacidade de isômeros glicanos. As medidas de proteína no plasma podem ser atraentes. na medicina.também associado ao IgG na base glicose e tal e biológico contendo a população. Você sabe que o estado impuro é usado para testar IgG em glicanes. Na verdade, pode testar n-glicanos de proteína.Isso é necessário em uma proteína transversal de dois estados puros pode ser aplicado à proteína O processo experimental or é relativamente simples enquanto o processo experimental precisa ser padronizado. O processo experimental de ponta a ponta leva três dias para funcionar, e as etapas experimentais precisam ser memorizadas para dominar as habilidades experimentais. Para preparar as amostras, descongele a amostra de plasma congelado.Em seguida, centrífuga a 80 vezes G por 10 minutos. Deixe a placa monolítica proteína G em temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira 100 micrômetros de amostra para cada poço da placa de coleta de dois mililitros.Adicione água ultra pura como uma amostra de controle. Diluir as amostras com um X PBS por um a sete volumes por relação de volume. Limpe uma placa de filtro de polipropolen hidrofílico de 0,45 míclica com 200 microliters de água ultra pura.Repita a limpeza duas vezes adicionais. Transfira as amostras diluídas para a placa do filtro e filtre as amostras na placa coletiva usando uma bomba de vácuo com pressão de 266,6 a 399,9 Pascals. Para preparar as placas monolíticas da proteína G, primeiro descarte o tampão de armazenamento.Limpe as placas monolíticas com dois mililitros de água ultra pura, dois mililitros de um X PBS, um mililitro de ácido fórmico molar de 0,17, dois mililitros de 10 X PBS, e dois mililitros de um X PBS sequencialmente. Remova o seguinte líquido usando uma bomba de vácuo. Utilizando um tubo multicanal, transfira as amostras filtradas para a placa monolitosa de proteína G para ligação e limpeza de IgG.Em seguida, adicione dois mililitros de um X PBS para limpar as placas monolíticas. Remova o PBS usando uma bomba de vácuo e repita a limpeza duas vezes adicionais. Illute IgG com um mililitro de ácido fórmico molar de 0,17, e filtrar as amostras na placa de coleta por bomba de vácuo.Em seguida, adicione 170 microliters de um bicarbonato de amônio molar na placa de coleta. Detecte a concentração de IgG usando um espectetômetro de absorção no comprimento de onda ideal de 280 nanômetros. Coloque o IgG extraído em um forno para secar a 60 graus Celsius por três horas.Determine a quantidade a ser observada de acordo com sua concentração, conforme descrito no manuscrito, e preserve-a em menos 80 graus Celsius. Reúna o IgG seco e armazene produtos químicos incluindo 1,33% SDS, 4% IgePal e 5% PBS à temperatura ambiente. Prepare a enzima F indoglycosidase diluindo 250 unidades de enzima com 250 microliters de água ultra pura.Para desnaturar o IgG, adicione 30 microliters de 1,33% SDS e misture por vórtice. Transfira a amostra para um forno Celsius de 65 graus por 10 minutos. Em seguida, retire-o do forno e deixe esfriar por 15 minutos.Adicione 10 microliters de 4% IgePal na mesma amostra e coloque-o em uma incubadora de agitação por cinco minutos. Adicione 20 microliters de cinco X PBS e 30 a 35 microliters de 0,1 hidróxido de sódio molar para regular o pH a 8,0, e misture por vórtice. Adicione quatro microliters de enzima Endoglycosidase F, e misture por vórtice.Em seguida, incubar por 18 a 20 horas em um banho de água de 37 graus Celsius. No dia seguinte, coloque os gylcans soltos em um forno a 60 graus Celsius para secar por duas horas e meia a três horas. Salve os glicanos de liberação a menos 80 graus Celsius até uma nova medição.Prepare o reagente de rotulagem de amino benzimida com 24,5 microliters de DMSO, 10,5 microliters de ácido acético, 0,7 miligramas de dois amino benzimida e seis miligramas de cianoboroidido de sódio. Em seguida, em uma sala escura, rotule os glicanos adicionando 35 microliters de dois reagentes de rotulagem amino benzimida. Transfira os glcans rotulados para um oscilador por cinco minutos e, em seguida, transfira-o para o forno por três horas a 65 graus Celsius.Depois disso, transfira para temperatura ambiente por 30 minutos. O IgG n-glycase, vamos rotulá-lo com a fim de ser detectado pela detectagem fluorescente de estado impuro. Pré-tree uma placa de filtro GHP de 0,2 mícrons com 200 microliters de 70% de etanol, 200 microliters de água ultra pura e 200 microliters de 96% aceto nitrito a quatro graus Celsius.Em seguida, remova o resíduo usando uma bomba de vácuo. Para purificar os dois glimices rotulados de amino benzimida, adicione 700 microlitadores de 100% acetonitrilo à amostra e transfira-o para uma incubadora de agitação por cinco minutos. Centrifugar a 134 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Transfira o supernassente para uma placa de filtro GHP de 0,2 mícrons por dois minutos e remova o filtrado usando o vácuo. Lave os dois amino benzimídeos rotulados de glycan com 200 microlitres de 96% de acetonitrilo a quatro graus Celsius, e remova o filtrado usando uma bomba de vácuo de cinco a seis vezes. Illute dois amino benzimida rotulado glycan com 100 microliters de água ultra pura três vezes.Transfira os dois amino benzímidas rotulados glicocano em um forno para secar a 60 graus Celsius por três horas e meia. Salve os n-glicocanos rotulados a menos 80 graus Celsius até uma nova medição. Primeiro, abra o software para controlar as fases móveis.Lave os instrumentos UPLC com 50% de solvente B e 50% de solvente C na vazão de 0,2 mililitros por minuto durante 30 minutos. Em seguida, lave com 25% de solvente A e 75% solvente B a uma vazão de 0,2 mililitros por minuto durante 20 minutos. Em seguida, adicione uma taxa de fluxo de 0,4 mililitros por minuto.Dissolva os n-glicanos rotulados com 25 microliters de uma mistura de 100% de acetonitrilo e água ultra pura em uma proporção de volume de dois a um. Em seguida, centrífugas a 134 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, e use um tubo seco para carregar 10 microlitadores da supernênite nos instrumentos UPLC. Separe os n-glicanos rotulados à taxa de fluxo de 0,4 mililitros por minuto com um gradiente linear de 75% a 62% de acetonitrilo por 25 minutos.Em seguida, execute uma análise da coluna de glycopeptida escada de calibração Dexteran em um UPLC a 60 graus Celsius. Detecte fluorescentes n-glicanos em citação X e comprimentos de onda de emissão de 330 nanômetros e 420 nanômetros, respectivamente. Como mostrado nesta figura, os n-glycanos IgG foram analisados em 24 picos iniciais de glicocano IgG com base na posição de pico e tempo de retenção.As estruturas n-glycan estão disponíveis em 24 tipos através da detecção de espectrometria de massa. Para acotoar a repetibilidade e estabilidade do método, a amostra padrão foi testada em paralelo seis vezes. Os picos glicanos com proporções relativamente pequenas apresentaram altos erros de medição de mais de 10% de coeficiente de variação.Na peça e importante para se formar a uma estrutura IgG n-glycan, especialmente para o estabelecimento do terminal Portanto, em vez de 3,3 IgG n-glycase encontrado é fundamental nesta a importância do IgG. Os glicanos são conhecidos por serem diferentes. Com os desenvolvimentos da protomica glican, combinados em glicanos para explorar informações para isso, pode ser usado como potencial para o diagnóstico atual.Após esse desenvolvimento de técnica, ele fornece uma nova maneira de explorar o

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Medicine

Medicina

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