Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

Métodos baseados na microscopia de força atômica possibilitam caracterizar processos biomoleculares na escala nano com resolução química ou estrutural morfológica, finalmente abrindo uma nova janela frontal de observação sobre biologia. Métodos de molécula única permitem sondar sistemas altamente heterogêneos, uma característica que é particularmente relevante para a compreensão da agregação de proteínas. Combinando moléculas únicas com abordagens traseiras, podemos obter informações fundamentais sobre o comportamento das proteínas, suas ligações com doenças humanas e projetar intervenções farmacológicas que podem ser bem sucedidas.

Além disso, este método pode ser aplicado com sucesso para estudar as propriedades químicas e estruturais dos biomateriais para a entrega de medicamentos, aplicações e outros fins biotecnológicos. Pode ser desafiador inicialmente definir os parâmetros AFM corretos para alta resolução e é fácil configurar seu AFM enquanto mede seus agregados de fibrilar. 30 minutos antes da imagem AFM, ligue o sistema AFM e clique em configurar e sondar.

Na janela de alteração da sonda, clique ao lado para preparar o estágio de foco Z. Desligue o interruptor de feixe AFM se estiver ligado e desbloqueie as fechaduras do rabo de pomba. Desconecte a cabeça do sistema e na janela de mudança da sonda, clique em seguida.

Monte o cantilever AFM no suporte da sonda. Conecte a cabeça ao sistema e bloqueie as travas do rabo de pomba. Ligue o interruptor de raio laser AFM e na janela de mudança da sonda, clique em seguida.

Na janela pop up, clique em não se o tipo cantilever não mudou e ajuste os botões de alinhamento óptico para encontrar o cantilever. Ajuste o foco no cantilever e clique em seguida. Na janela pop-up, clique em sim se o foco estiver no cantilever.

Use os botões de raio laser de detecção para posicionar o raio laser no final do cantilever. Use os botões de feixe laser desviados para maximizar o sinal total medido pelo diodo fotográfico de quatro quadrantes a pelo menos mais de um volt. Na janela de mudança da sonda, clique em seguida e feche.

Depois de esperar 15 minutos para que o cantilever atinja a estabilidade térmica, reajuste a posição do raio laser desviado no diodo fotográfico sensível da posição, se necessário. Clique em NCM sweep, selecione a amplitude desejada de oscilação, clique na fase de uso e clique em auto. Sintonize a cantilever perto do máximo de sua primeira ressonância livre de oscilação para aproximadamente 300 kilohertz para um cantilever com uma constante de mola de 40 newtons por metro.

Coloque a amostra no suporte da amostra. Clique na área de digitalização e defina a resolução entre 256 por 256 e 1024 por 1024 pixels e, em seguida, defina o tamanho da varredura e o número do pixel. Defina a taxa de digitalização para 0,3 para um hertz para uma área de varredura de um a cinco por cinco micrômetros ao quadrado.

Concentre a visão óptica na amostra e clique na abordagem para se aproximar da superfície da amostra. Em seguida, clique em levantar 100 micrômetros para levantar a ponta AFM 100 micrômetros acima da superfície da amostra e clique em expandir na imagem óptica da amostra. Clique na barra de estágio de foco para focar a visão na superfície da amostra e use as setas para se mover na região da amostra de interesse.

Clique na abordagem para engajar a superfície e clique na varredura da linha para verificar se a ponta está seguindo bem a superfície. Ajuste o ponto de ajuste conforme necessário. Em seguida, clique na varredura para começar a imagem da superfície da amostra, mantendo um regime constante de mudança de fase não excedendo delta 20 durante a imagem para evitar uma grande força de imagem e manter a consistência entre amostras independentes.

Para imagens de nanoespectroscopia ir, 30 a 60 minutos antes da análise, ligue o sistema AFM IR e o laser IR. Abra o software incorporado para controlar o instrumento e clique no arquivo e novo para abrir um novo arquivo nano IR. Clique em inicializar para iniciar o sistema AFM IR e abrir a tampa do instrumento.

Monte uma sonda revestida de ouro de silicone com um raio nominal de 30 nanômetros e uma constante de mola de 0,2 newtons por metro no sistema AFM IR para medir a amostra no modo de contato. Clique em carregar na seção sonda AFM e em seguida. Use o foco em setas de sonda para focar a câmera no cantilever e use a ponta para mirar para colocar a mira no final do cantilever.

Gire os botões que controlam a posição do laser de detecção para posicionar o laser no final do cantilever. Gire os botões laser para detectar e maximizar a soma medida pelo diodo fotográfico de quatro quadrantes a um valor superior a três volts. Gire o botão de deflexão para ajustar a deflexão cantilever para menos um volt e clique em seguida.

Em seguida, feche a tampa do instrumento. Use o foco em setas de sonda para focar a câmera na amostra e ponta para mirar setas para mover-se na região de interesse da amostra. Clique em seguida e engaje.

Na janela do microscópio, selecione altura para morfologia, amplitude dois para a absorção de IR e frequência PLL para mapear a ponta para amostrar ressonância de contato. Na seção de varredura AFM, defina os parâmetros como demonstrado para a imagem AFM e clique em digitalizar para adquirir um mapa de morfologia. Quando o mapeamento da morfologia estiver concluído, na janela do microscópio, clique no mapa de altura para posicionar a sonda na parte superior de um agregado.

Na seção nano IR, clique em iniciar IR para iluminar a amostra com o laser IR. Para focar o laser infravermelho no cantilever, clique em otimizar e digite 1655 centímetros para o número de ondas. Clique em adicionar e digitalizar para determinar a posição do laser IR e clique na atualização e tudo bem para alinhar sua posição com o cantilever.

Na seção geral, digite um número de ondas para o qual se espera uma alta absorção no campo relativo e desative a opção de filtro de passe de banda. Clique em iniciar ir, em seguida, verifique a leitura do medidor e o FFT da resposta cantilever. Na janela FFT, mova o cursor verde para ler a frequência de ressonância do cantilever.

Um valor típico da FFT da ressonância dos cantilevers é de cerca de 200 kilohertz. Digite o valor de frequência de ressonância gerada na seção geral no campo central de frequência e use uma janela de frequência de 50 quilohertz. Clique na janela de sintonia de pulso laser para selecionar o modo aprimorado de ressonância e definir uma taxa de pulso de 222 kilohertz, uma faixa de melodia de 50 kilohertz e um ciclo de serviço a laser de 5%Clique para varrer a pulsação do laser.

Use o cursor para ajustar o pulso laser à frequência da resposta mecânica da expansão térmica da amostra absorvendo a luz IR. Em seguida, selecione o loop bloqueado de fase para monitorar a ressonância de contato entre a amostra e a ponta e clique em zero. Para outras propriedades químicas na escala nano, rastreie a ressonância de contato durante a aquisição de espectros para garantir que o espectro amostral não seja afetado pelo superaquecimento e amolecimento.

Selecione ativar para rastrear a amostra para a ressonância de contato de ponta e selecione um ganho integral de 0,5 e um ganho proporcional de 10, em seguida, clique em OK. Na janela de otimização, clique no comprimento de onda e escaneie para localizar o laser IR para pelo menos três números de ondas correspondentes às principais bandas de absorção da amostra e para pelo menos um número de ondas para cada chip do laser. Clique em ferramentas, calibração de fundo ir e novo, e defina os números de ondas entre 1200 e 1800 centímetros. Defina os fundos como médio para um, o ciclo de trabalho de 5% e a velocidade de varredura para 100 centímetros ao quadrado.

Clique em adquirir para medir o fundo do laser IR para normalização do espectro localizado em escala nano medido, salve o arquivo e feche a janela. Nas configurações de espectro de RI, selecione uma resolução de espectro IR entre um e quatro centímetros e um número de co-médias de pelo menos 64 vezes. Em seguida, clique em adquirir para medir um espectro de IR localizado em nano escala na faixa de proteína.

Para adquirir um mapa químico resolvido em escala nano, selecione 1655 centímetros e imagens de RI e clique em digitalizar na janela de varredura AFM. Quando o mapeamento estiver concluído, salve as medidas. Em seguida, use o software de processamento de imagem AFM incorporado para analisar os mapas adquiridos de morfologia, ressonância de contato e química e espectros localizados em escala nano.

É um passo crítico para obter uma solução monomérica altamente pura, pois a presença de espécies agregadas pode resultar em baixa reprodutibilidade da cinética e introduzir artefatos em suas medições. Um fator fundamental para o estudo com sucesso de amostras biológicas com alta heterogeneidade é a posição correta dos substratos sólidos. A deposição de spray microfluido pode ser explorada em vez de manual, a fim de preservar a arquitetura da amostra e a heterogeneidade.

Esses métodos abrem caminho para desvendar a estrutura química e as propriedades das biomoléculas individuais e suas interações no ambiente fisiológico e líquido nativo.