Name: Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a rotular armadilhas extracelulares de neutrófilos em tecidos humanos e murinos embebidos em parafina usando imunofluorescência com recuperação de epítopo induzida por calor. Este método padronizado permite detectar NETs em material arquivado para estudos retrospectivos de doenças.

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Os autores não têm nada a revelar.

Os protocolos de tecidos foram aprovados pela Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlim, Alemanha (G0121/16). Os experimentos foram conduzidos de acordo com a diretiva européia 2010/63/UE sobre cuidados, bem-estar e tratamento de animais.
1. fixação, desidratação, incorporação de parafina, seccionamento, montagem de secções
<ol><li>Prepare solução de formaldeído a 2% dissolvendo o paraformaldeído em TBS (pH 7,4). Evite aquecer acima de 60 ° c. Cool para RT. a solução de formaldeído pode ser armazenada a-20 ° c.</li>
	<li>Coloc o tecido fresco (aqui: pulmão do rato) em um prato de Petri de vidro com TBS. Com um bisturi, dissecar em pedaços não superior a 20 mm x 30 mm x 3 mm de tamanho. Mergulhe a amostra em solução de formaldeído a 2% em TBS. Nota: o volume de fixador deve ser pelo menos 20x que do tecido.</li>
	<li>Fix em RT para 8 − 20 h. Transfira espécimes para TBS. Coloque em gavetas.</li>
	<li>Desidratado utilizando uma série de etanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), com cada passo com duração de 1 h.</li>
	<li>Amostras claras 2x em 100% xileno (Dimetilbenzeno), cada passo 1 h.</li>
	<li>Mergulhe em parafina 2x a 60 ° c (temperatura de derretimento 54 − 56 ° c), cada passo 1 h.</li>
	<li>Monte espécimes usando moldes de incorporação, use a parte inferior da gaveta como uma tampa.</li>
	<li>Deixe a parafina solidificar e remover os moldes de incorporação.</li>
	<li>Prepare 3 μm seções de tecido, e deixá-los flutuar em 37 ° c banho de água.</li>
	<li>Seções do flutuador na superfície da água em corrediças de vidro adesivas (tabela dos materiais).</li>
	<li>Incubar seções em corrediças de vidro durante a noite em 40 ° c para lig o tecido ao vidro.</li>
</ol>2. reidratação, recuperação de epítopo induzida por calor, coloração, montagem, análise microscópica
<ol><li>Coloc seções em corrediças de vidro nas cremalheiras e SUBMERGA-as nos meios usados para a desidratação e o esclarecimento, na ordem inversa, com cada etapa por 5 minutos: 2x 100% xylene, série do ethanol (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).</li>
	<li>Aqueça um banho de água com uma placa quente temperatura-controlada a 70 ° c. Coloc um frasco enchido com a recuperação calor-induzida do epítopo (HIER)-amortecedor (pH 9; Tabela de materiais), contendo 10% de glicerol como um tampão de temperatura, em um banho de água. Quando o buffer HIER atingiu 70 ° c, coloque o rack com slides no frasco de buffer.</li>
	<li>Incubar lâminas para 120 min a 70 ° c.</li>
	<li>Retire o jarro do banho de água e deixe esfriar a RT. enxaguar secções 3x com água desionizada e uma vez com TBS (pH 7,4).</li>
	<li>Retire cuidadosamente o líquido das lâminas entre secções com papel de filtro enrolado ou cotonete, deixando as secções hidratadas.</li>
	<li>Criar barreira em torno de seções com uma barreira hidrofóbica caneta.</li>
	<li>Incubar secções no tampão de bloqueio (1% de albumina sérica bovina [BSA], 2% de soro de burro normal, 5% de gelatina de peixe de água fria e detergentes [tabela de materiais] em TBS) em RT por 30 min para evitar ligação inespecífica.</li>
	<li>Diluir os anticorpos primários numa concentração de 1 μg/mL no bloqueio do tampão. Nota: para redes humanas e de rato, pode ser utilizada uma combinação de anticorpo de coelho contra a elastase de neutrófilos e o anticorpo de frango contra a histona 2B (tabela de materiais).</li>
	<li>Coloque os slides em uma câmara úmida. Remova o tampão de obstrução e adicione os anticorpos preliminares diluídos sem lavar às seções usando o suficiente volume para impedir a secagem. Selar câmara húmida com película de parafina e incubar durante a noite na RT.</li>
	<li>Lave as secções 3x com TBS durante 5 min cada.</li>
	<li>Prepare a solução de trabalho de anticorpos secundários no bloqueio do tampão. Para a detecção de anticorpos primários, use anticorpos secundários levantados em burro e pré-absorvidos contra proteínas séricas de várias espécies (tabela de materiais). Cubra seções de tecido com solução de trabalho de anticorpos secundários. Transferência de slides para câmara úmida, vedação com película de parafina. Incubar por 1 h em RT. Nota: o burro anti coelho conjugado a Cy2 e a galinha do anti do burro conjugado a Cy3 pode ser combinado com uma contratura do ADN.</li>
	<li>Lave as secções 3x durante 5 min cada uma com TBS, depois uma vez por 5 min com água desionizada.</li>
	<li>Cubra seções com meio de montagem (tabela de materiais) e aplique o vidro da tampa evitando a formação da bolha.</li>
	<li>Deixe a montagem solidify médio, a seguir analise a imunofluorescência usando um microscópio do largo-campo com filtros apropriados da passagem da faixa ou um microscópio confocal.</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+smears+observed+in+H%26E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BioMed Central Cell Biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking%2C+immunoreactivity%2C+and+heat+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+unmasking+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.</a> Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).</li>
<li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval%3A+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Weckbach, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midkine+drives+cardiac+inflammation+by+promoting+neutrophil+trafficking+and+NETosis+in+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).</li>
</ol>

A fonte de financiamento deste trabalho é a sociedade Max Planck. Agradecemos a Arturo Zychlinsky por ler criticamente o manuscrito e Philippe Saikali para o tecido do rato.

Com a consciência crescente do papel das redes durante a patogénese9, sua deteção no tecido dos pacientes ou dos animais experimentais está ganhando a importância crescente. Amostras de tecido embebido em parafina têm uma série de vantagens em comparação com outras preparações teciduais (por exemplo, secções de espécimes criopreservados). A preservação do tecido em amostras parafina-encaixadas é claramente superior, e uma vez encaixada, as amostras são preservadas por décadas, permitindo estudos retrógrados. Para a deteção das redes, que são estruturas filigrana, a boa conservação da amostra é uma condição prévia que governa para fora o uso do material cryopreservado, que é dano de tecido propenso devido à formação do cristal de gelo que pode dar a ascensão aos artefatos que assemelham-se morfològica Redes.
Para a preservação óptima, o tecido dos animais experimentais deve ser fixado logo após a morte, idealmente pela perfusão, para evitar a autólise. Como soluções fixative, recentemente preparadas ou recentemente descongelado do paraformaldeído em um amortecedor apropriado como o minério de TBS ou de PBS ideal. Isto é quimicamente definido em contraste com preparações de formalina utilizados para a histologia padrão, e induz menos autofluorescência tecidual. Em contraste, o tecido humano muitas vezes não é fixado diretamente após a excisão, e como fixador, normalmente uma diluição de 10% de formalina é utilizada, que contém 10% a 15% de metanol como um estabilizador para prevenir a polimerização, bem como o ácido fórmico, outros aldeídos e cetonas . Frequentemente, o tecido é armazenado neste fixador para quantidades prolongadas de tempo antes de incorporar. O resultado pode ser a autólise (dependendo do tempo entre a excisão e a fixação), e a formação excessiva de pontes de metileno devido à superfixação. A fixação do formaldehyde induz mudanças na estrutura terciária das proteínas pela formação de pontes intra e inter-molecular do metileno10. Componentes de células não proteicas como ácidos nucleicos, carboidratos e lipídios não são fixados diretamente, mas imobilizados na rede de proteínas tridimensionais. Para a rotulagem bem sucedida, as ligações de metileno têm de ser quebradas para expor os epítopos no processo de recuperação do antígeno. Isto é conseguido pelo aquecimento de seções do tecido montadas em corrediças do microscópio em um amortecedor calor-induzido apropriado da recuperação do antígeno (tampão de HIER)11. Nosso estudo anterior analisou a influência do pH e da temperatura de buffers HIER na detecção de componentes NET no tecido paraffinizado, e verificou-se que o pré-tratamento tecidual bem-sucedido para um componente, muitas vezes, é suboptimal para um segundo componente8.
Entretanto, verificou-se que o aquecimento do tecido para 70 ° c no tampão HIER em um pH de 9 é um bom compromisso para muitos componentes NET e manterá boa preservação do tecido, que é muitas vezes comprometida em temperaturas mais elevadas. Propõe-se usar o tempo de recuperação indicado como ponto de partida, mas especialmente com espécimes de arquivamento de parâmetros de fixação desconhecidos, a intensidade de coloração pode ser insatisfatória. Neste caso, a prolongação ou maior temperatura durante o procedimento de recuperação pode melhorar a eficiência de coloração. Isso também pode influenciar a coloração de histona 2B do anticorpo IgY usado em nosso protocolo. Como mostrado na Figura 1, a cromatina desdensed pode ser encontrada em neutrófilos submetidos a netosis, bem como em manchas de redes muito mais fortes com este anticorpo em comparação com cromatina em neutrófilos em repouso. Isto é provavelmente devido ao acesso restrito da molécula de 180 kDa IgY aos núcleos compactos e pode diferir após a recuperação aumentada do epítopo. Isso pode intensificar a eficiência vinculativa mesmo em áreas de cromatina condensada, o que resultará em fluorescência mais forte em núcleos normais de neutrófilos e outras células. A diferença na eficiência de coloração entre neutrófilos submetidos a netose e neutrófilos não estimulados pode ser menos pronunciada do que a descrita na Figura 1. Áreas de formação líquida ainda seriam identificadas pela colocalização de NE, H2B e DNA.
O procedimento de fixação também pode induzir autofluorescência significativa do tecido, principalmente na parte azulada/esverdeada do espectro. É importante evitar a maior parte dessa autofluorescência usando conjuntos de filtros de fluorescência de bandpass estreito adequado (amplo campo) ou configurações de detector (confocal) que correspondem ao máximo de emissão do fluorocromo usado com excitação azul, por exemplo, Cy2, Alexafluor 488. em casos extremos de autofluorescência, deve-se evitar a parte azulada/greenish do espectro. Em vez disso, os sinais de fluorescência podem ser detectados mais facilmente na parte vermelha distante do espectro (por exemplo, anticorpos secundários acoplados a Cy 5 ou Alexafluor 635), mas isso requer câmeras preto/branco sem filtro ou microscópios confocais. Desde que o olho humano é um pouco insensível além de 600 nanômetro, os sinais vermelhos distantes da fluorescência podem mal ser detectados usando oculars. Em qualquer caso, é importante usar controles negativos (por exemplo, soros não imunes/controles isotipos em vez de anticorpos primários ou omitindo anticorpos primários) para determinar os tempos de exposição adequados ou as configurações do detector.
As seções do tecido do μm 1 − 2 podem ser analisadas com os microscópios do largo-campo usando 10x ou 20x objetivos. Estas lentes fornecem uma grande profundidade focal, assim (quase) a seção inteira do tecido estará no foco. Isto pode ser usado para escanear rapidamente seções do tecido para áreas da formação líquida se são suficientemente grandes (como em Figura 1). A colocalização dos canais verde (NE), vermelho (H2B) e azul (DNA) resulta em coloração branca indicando áreas de formação líquida (Figura 1G). Para maiores ampliações, microscópios confocais ou de campo largo com desvolução são necessários. A Figura 2 mostra detalhes da amostra de apendicite humana também utilizada para a Figura 1. Na Figura 2a, a ne localiza-se em pequenos pontos (grânulos), mas uma grande proporção é extracelular, muitas vezes formando listras que se sobrepõem com H2B (Figura 2b) e DNA (Figura 2C). Essa colocalização resulta em uma sobreposição esbranquiçada indicando redes (Figura 2D). Um padrão muito semelhante pode ser encontrado na seção pulmonar de um camundongo infectado por M. tuberculosis (Figura 3).
Os espécimes aqui apresentados são caracterizados por áreas com alto grau de formação líquida que podem ser identificadas mesmo em baixa ampliação. Dependendo da densidade tecidual e respectivo estímulo, a formação líquida pode ser muito menos pronunciada, até a formação líquida de pequenos grupos de neutrófilos (para um exemplo de miocardite, ver uma publicação anterior12). Acredita-se que este protocolo vai ajudar a promover mais pesquisas sobre redes de tecidos e esperamos ajudar a desvendar os papéis não reconhecidos de redes na formação ou prevenção de doenças.

As armadilhas extracelular de neutrophil (redes) têm uma estrutura tridimensional complexa. Varredura de alta resolução-elétron-a análise microscópica revelou que consistem em fibras lisas com um diâmetro de 15 − 20 nanômetro (Chromatin) enchido com os domínios globular de > 25 nanômetro que consistem presumivelmente de uma variedade de aproximadamente 30 granulados e citoplasmáticos proteínas e peptídeos1,2. Quando gerados in vitro a partir de neutrófilos isolados, as redes podem ser identificadas por coloração de dois ou mais de seus componentes por imunofluorescência (por exemplo, histonas e elastase de neutrófilos [NE]). Em leucócito polimorfonucleares não estimulados (PMN), os histonas são situados exclusivamente no núcleo, quando o ne for contido nos grânulo. Durante a netose, ne entra no núcleo, onde processa histonas3,4. As redes são caracterizadas por colocalização de componentes, que são claramente separados em neutrófilos não estimulados. Uma vez que atualmente não existem anticorpos que detectam exclusivamente resumos específicos da net (ou seja, não reagem com neutrófilos ingênuos), detectar a colocalização de proteínas de neutrófilos em redes é a única maneira de identificar as redes.
No tecido, as redes dificilmente podem ser detectadas por manchas histológicas convencionais (por exemplo, por coloração com hematoxilina/eosina [H & E], que retrata as redes como um tinge azulado pálido difuso). Somente quando altamente abundante, as redes podem claramente ser distinguidas com a mancha de H & E, tal como nos trombos5. Uma vez que as redes são difusas por si, a estrutura do tecido tem que ser preservada de forma otimizada, então as criopreparações que são propensas a induzir artefatos congelantes são suboptimal para análise de redes no tecido. Em vez disso, a fixação de formaldeído e a incorporação de parafina mostraram preservar a estrutura líquida no poço de tecido2. (Immuno-) a inspeção histológica das seções do tecido parafina-encaixado é o método padrão para a análise patológica. Como o tecido em blocos de parafina é conservado mesmo à temperatura ambiente (RT), espécimes de tecido do trabalho diagnóstico diário podem ser comparados com espécimes que foram preparados anos atrás, com perguntas e técnicas que surgiram recentemente. As redes no tecido não foram detectadas até recentemente, e a análise detalhada da formação e da remoção líquidas durante o curso das doenças pode conduzir aos introspecções novas na patogénese. O uso de tecido embebido em parafina tem a vantagem inestimável para permitir a análise do material arquivístico e realizar estudos retrospectivos6. Inegavelmente, esses benefícios têm um custo. Antes de incorporar em parafina, o tecido tem que ser formaldeído-fixo, desidratado e aquecido acima de 50 ° c. Estes procedimentos induzem o autofluorescence do tecido assim como o mascaramento do epítopo.
Para limitar os artefatos de fixação, o tempo de fixação deve ser mantido ao mínimo, de modo que o tamanho das amostras de tecido não deve exceder uma área de 20 mm x 30 mm com ~ 3 mm de espessura. Amostras deste tamanho são completamente fixas após a incubação durante a noite em RT em formaldeído, idealmente seguido por desidratação direta e incorporação de parafina. Alternativamente, as amostras fixas podem ser armazenadas por 1 ou 2 dias em buffer. Para estudos de imunofluorescência, o fixador deve ser preparado recentemente a partir de paraformaldeído dissolvido em um tampão adequado (por exemplo, salina tamponada com fosfato [PBS] ou solução salina tampão Tris [TBS]). Durante a preparação fixativa, a temperatura deve ser mantida abaixo de 60 ° c para evitar a formação de ácido fórmico. Formalina, que é um fixador padrão para a patologia, não deve ser utilizado uma vez que contém metanol, outros aldeídos, cetonas e ácido fórmico. Estas impurezas conduzem ao mascaramento aumentado do epítopo e ao autofluorescence significativo do tecido.
Para o immunolabelling bem sucedido, o mascaramento do epítopo tem que ser revertido em um processo chamado recuperação do antígeno. As seções do tecido são heated em um amortecedor apropriado, que seja acreditado para quebrar pontes de metileno, assim que os resumos tornam-se acessíveis aos anticorpos7. Para a deteção das redes, a recuperação calor-induzida do epítopo (hier) é preferida a outros métodos tais como o uso de enzimas proteolíticas. Rotineiramente, imunomarcação de seções da parafina é realizado com um único anticorpo seguido por um anticorpo secundário peroxidase-etiquetado, que seja detectado com um substrato precipitantes. Comparado à imunofluorescência, os métodos de deteção enzima-baseados têm uma definição espacial mais baixa devido à difusão do precipitado da carcaça, e geralmente, a deteção simultânea de mais de um antígeno é limitada6.
Como atualmente não existem anticorpos que se ligam exclusivamente a redes, este protocolo é usado para rotular duas proteínas, histona 2B, que é nuclear, e elastase neutrofínica, que está localizada em grânulos. Em neutrófilos não estimulados, estas proteínas são separadas, mas são colocalizadas em neutrófilos submetidos a NETosis e em redes. A deteção simultânea de dois antígenos pode ser conseguida com dois anticorpos preliminares levantados em anfitriões diferentes e em dois anticorpos secundários espécie-específicos etiquetados com os fluorochromes diferentes. Este relatório é uma padronização de nosso protocolo previamente publicado8 e usa uma combinação de dois anticorpos comercialmente disponíveis que mancham confiantemente componentes líquidos no tecido parafina-encaixado, fresco e Archival, da origem humana e murino.

<table><tbody><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-histona 2B de frango</td><td>Abcam</td><td>ab 134211</td><td></td></tr><tr><td>gelatina de peixe de água fria</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-frango de burro, Cy3 conjugado, para rotulagem múltipla</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-165-155</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-coelho de burro, Cy2 conjugado, para rotulagem múltipla</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>711-225-152</td><td>alternativamente conjugado Cy5, 711-175-152</td></tr><tr><td>de incorporação</td><td>Roth</td><td>K116.1</td><td></td></tr><tr><td>moldes de incorporação</td><td>Sakura</td><td>4162</td><td></td></tr><tr><td>estação de incorporação</td><td>Microm</td><td>AP280</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Roth</td><td>9065.4</td><td></td></tr><tr><td>papel de filtro, enrolado</td><td>OCB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinça</td><td>Dumont</td><td>7a</td><td></td></tr><tr><td>cilindro de vidro com 20 cm de diâmetro</td><td>VWR</td><td>216-0075</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>tampão HIER pH 9</td><td>Scytek</td><td>TES999</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>incubadora (seca, até 40 > C)</td> Câmara <td>úmida MMIPP30</td><td></td> <td>Memmert</td></tr><tr><td>(caixa plástica com tampa hermética)</td> <td>Emsa</td><td>508542</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Aldrich</td><td>32.459-0</td><td></td></tr><tr><td>soro de burro normal</td><td>Merck</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>PAP-pen ImmEdge</td><td>Vector Lab</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de parafina</td><td>Microm</td><td>355S</td><td>banho-maria incluído</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>Schubert /Weiss</td><td>7020051</td><td></td></tr><tr><td>coelho anticorpo anti ELANE</td><td></td><td></td> Atlas HPA068836 <td></td></tr><tr><td>racks, frascos para lâminas de microscópio</td><td>Roth</td><td>H554.1 H552.1</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Braun</td><td>Fig.22</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus lâminas de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>J1800AMNZ</tr> placa <tr><td>quente com temperatura controlada</td><td>NeoLab</td><td>D6010</td><td></td></tr><tr><td>processador de tecidos para incorporação de parafina</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tris solução salina tamponada TBS</td><td>VWR</td><td>788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fluka</td><td>93773</td><td></td></tr><tr><td>banho-maria 37 &deg; C</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de campo amplo ou confocal</td><td>Leica</td><td>DMR, SP8</td><td></td></tr><tr><td>xileno (dimetilbenzeno)</td><td>Roth</td><td>9713.3</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Os granulócitos de neutrófilos, também chamados de leucócitos polimorfonucleares (PMN) devido ao seu núcleo lobulado, são o tipo mais abundante de leucócitos. Eles amadurecem na medula óssea e são liberados para o sangue periférico, onde circulam por cerca de 6 − 8 h; no entanto, no tecido, eles podem sobreviver por dias. Por diapedese através do endotélio, eles deixam a corrente sanguínea, entram nos tecidos e migram para o local de uma infecção após gradientes Quimiotáticos. Neutrófilos podem combater microrganismos invasores por fagocitose, degranulação e geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (Nets). Este protocolo ajudará a detectar as redes no tecido parafina-encaixado. As redes são o resultado de um processo chamado NETosis, que leva à liberação de componentes nucleares, granulados e citoplasmáticos, seja de neutrófilos vivos (NETosis vital) ou moribundos (NETosis suicida). In vitro, redes formam estruturas semelhantes à nuvem, que ocupam um espaço várias vezes maior do que as células a partir das quais eles descendem. A espinha dorsal das redes é a cromatina, à qual uma seleção de proteínas e peptídeos originários de grânulos e citoplasma estão ligados. Dessa forma, uma alta concentração local de compostos tóxicos é mantida para que as redes possam capturar e inativar uma variedade de patógenos, incluindo bactérias, fungos, vírus e parasitas, enquanto a difusão dos componentes NET altamente ativos que levam a danos em tecido vizinho é limitado. No entanto, nos últimos anos, tornou-se evidente que as redes, se geradas em abundância ou apuradas insuficientemente, têm potencial patológico variando de doenças auto-imunes a câncer. Assim, a detecção de redes em amostras de tecido pode ter significância diagnóstica, e a detecção de redes em tecido doente pode influenciar no tratamento dos pacientes. Desde que as amostras de tecido parafina-encaixadas são o espécime padrão usado para a análise patológica, procurou-se estabelecer um protocolo para a mancha fluorescente de componentes líquidos no tecido parafina-encaixado usando anticorpos comercialmente disponíveis.

Usando este protocolo, os componentes líquidos podem com sucesso ser detectados no tecido parafina-encaixado ambos da origem humana e murino. Em neutrófilos não estimulados, o H2B está localizado exclusivamente no núcleo e na elastase de neutrófilos em grânulos; Consequentemente, os seus sinais de fluorescência não se sobrepõem. Ao contrário, durante NETosis e após a formação líquida, o NE, o H2B, e o ADN colocalizam em parte. Se imaged como sinais verdes, vermelhos e azuis, áreas de colocalização são representadas como sobreposição esbranquiçada (Figura 1G, Figura 2De Figura 3D). Esta sobreposição também pode ser quantificada usando o software de análise de imagem. Pixels de sinais sobrepostos que são positivos para verde, vermelho e azul foram usados para criar uma sobreposição roxa representando áreas líquidas na Figura 1G', Figura 2D'e Figura 3D'. Algumas das células da Figura 1 e da Figura 2 têm núcleos lobulados, mas são negativas para NE. Acredita-se que estas células são granulócitos eosinófilos.
Se as secções teciduais têm uma espessura de 2 – 3 μm, elas podem ser analisadas por microscopia de campo largo usando objetivos de 10x ou 20x. Um exemplo é apresentado na Figura 1, que retrata uma seção de tecido de apendicite humana manchada para ne (verde), H2B (vermelho) e Hoechst 33342 (azul). Os painéis A, C, e e G são de uma área da seção contendo redes, enquanto os painéis B, D, F e H são de uma área diferente da mesma seção, que contém inúmeros neutrófilos (Figura 1b, ne), mas sem redes. Áreas com formação líquida maciça podem ser facilmente encontradas mesmo em ampliações baixas, uma vez que todos os três componentes NET colocalizam, muitas vezes em estruturas extracelulares stringy, que na sobreposição dos três canais aparecem como fibras extracelulares esbranquiçadas (Figura 1G ), sobreposição roxa na Figura 1G'.
Os padrões de coloração de ambas as áreas de tecido são claramente diferentes, com NE contido em grânulos (Figura 1b) e DNA em núcleos (Figura 1F). Curiosamente, a coloração para H2B é bastante fraca em áreas ricas em neutrófilos (Figura 1D) em relação ao tecido contendo líquido (Figura 1C). Isto poderia ser devido ao tamanho do anticorpo (IgY tem 180 kD comparado a 150 kD para IgG), que pode impedir a ligação à cromatina compacta em núcleos intactos, quando o acesso a H2B for facilitado se a cromatina é desdensed como é o caso nas redes (Figura 1C).
Para maior resolução, microscópios confocais ou microscópios de campo de Widefield com deconvolução devem ser usados para minimizar o desfoque fora do foco. A Figura 2 retrata uma área líquida-rica do mesmo espécime humano da apendicite. É uma projeção máxima de uma pilha confocal. NE (verde, Figura 2a) é encontrado em grânulos, mas também é abundante extracellularly, onde colocaliza com H2B (vermelho, Figura 2b) e DNA (azul, Figura 2C). A colocalização extracelular resulta em uma combinação de cores esbranquiçadas (Figura 2D). Esses pixels positivos para verde, vermelho e azul foram usados para criar uma sobreposição roxa apresentando redes na Figura 2D'.
A Figura 3 é um detalhe de uma seção central de um pulmão de camundongo infectado com Mycobacterium tuberculosis (M. TB). As condições de recuperação e coloração do antígeno são as mesmas da Figura 1 e da Figura 2. Novamente, a colocalização de todos os três componentes NET é claramente visível como áreas esbranquiçadas entre neutrófilos, que tem sido usado para criar uma camada roxa indicando redes na Figura 3D'.
A especificidade da coloração é demonstrada na Figura 1 suplementar, que retrata a coloração insignificante com anticorpos de controle, e a Figura 1a, B retrata o soro não imune do coelho (verde) e o anti-GFP IgY de frango (vermelho). Figura 1 C, D mostra a coloração com anticorpos secundários isoladamente, a combinação foi a mesma utilizada na Figura 1, Figura 2e Figura 3. A Figura 1a, C suplementar mostra uma secção de apendicite humana semelhante à Figura 1 e Figura 2. A Figura 1b suplementar, D é o tecido pulmonar do camundongo semelhante à Figura 3. O DNA é manchado com Hoechst 33342. A barra de escala representa 25 μm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig01.jpg"> Figura 1: microscopia de fluorescência de campo largo de uma secção de parafina de uma amostra de apendicite humana. Os painéis A, C, e e G descrevem uma área de tecido com redes, enquanto os painéis B, D, F e H mostram uma área diferente da mesma seção que é rica em neutrófilos, mas sem formação líquida. A coloração é contra NE (A, B; verde), H2B (C, D; vermelho), e DNA (e, F; azul). Figura 1G, H representa a sobreposição de todos os três canais. Os pixéis com uma intensidade entre 80 e 256 em todas as cores representam áreas da mancha de sobreposição para o NE, o H2B, e o ADN e são considerados ser derivados das redes ou dos neutrófilos que submetem-se a NETosis. Estes pixéis foram pseudo-colored como o roxo no painel G, onde formam uma grande área; e no painel H ', onde apenas pequenas manchas são encontradas. As imagens foram tiradas com um microscópio de grande campo usando um objetivo de 20x, e a barra de escala representa 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig01large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig02.jpg"> Figura 2: microscopia de fluorescência confocal de componentes NET em uma amostra de apendicite humana. Utilizou-se a mesma seção de tecido utilizada na Figura 1 . (A) coloração contra ne, (B) representação de H2B, e (C) HOECHST 33342 coloração de DNA. (D) a sobreposição de todos os três canais. Colocalização de todos os três sinais é de cor púrpura pseudo no painel D '. Para isso, os pixels com uma intensidade &gt; 80 em todas as três cores foram detectados usando Volocity 6,3. A área roxa retrata redes ou neutrófilos submetidos a NETosis. As imagens foram tiradas com microscopia confocal como Z-Stacks e apresentadas como projeção máxima. A barra de escala representa 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig02large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig03.jpg"> Figura 3: microscopia de fluorescência confocal de componentes NET em um pulmão de camundongo infectado com M. TB. É um detalhe da parte central de uma seção de um pulmão completo com infiltração maciça de neutrófilos. (A) coloração ne, (B) coloração H2B, e (C) coloração do DNA. (D) a sobreposição de todos os três canais. A sobreposição roxa no painel D ' indica pixels com valores de intensidade de &gt; 80 em todas as três cores indicando neutrófilos submetidos a netosis, bem como redes. As imagens foram tiradas como um Z-Stacks com um microscópio confocal e apresentadas como projeção máxima. A barra de escala representa 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig03large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Figura 1: controle de coloração com anticorpos primários não relacionados. O tecido humano (a, C) e murino (B, d) como foi utilizado para A figura 1 e A figura 2, e A Figura 3, respectivamente, foram corados com anticorpos primários não relacionados (a, b) ou sem anticorpos primários (C, d). Como os anticorpos preliminares do controle nos painéis A e B, o soro de um coelho não-imunizado e de um IgY da galinha de encontro a GFP foi aplicado. Os anticorpos secundários foram os mesmos mostrados em todas as outras manchas e também utilizados nos painéis C e D. Como esperado, em todas as condições, foi detectada coloração de fundo insignificante, ilustrando a especificidade dos anticorpos utilizados para a figura 1, Figura 2e Figura 3. As imagens foram tiradas com um microscópio confocal, DNA corado com Hoechst 33342, e a barra de escala representa 25 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115supfig01large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para baixar esta figura.</a>

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Hoje gostaríamos de mostrar-lhe variantes do protocolo comum de recuperação de antígenos induzidos pelo calor. Combina os benefícios da temperatura mais baixa para o antígeno de elastrói neutrófilo e alto valor de pH que é necessário para histones. Esta técnica permite estudar NETs, armadilhas extracelulares de neutrófilos, em tecidos de parafina tanto de camundongos quanto de homens.E também é considerado para estudar material arquivado ou estudo retrospectivo. Primeiro, coloque os slides preparados em racks e submerse-os na mídia usada para desidratação e limpeza em ordem inversa por cinco minutos cada. Em seguida, aqueça um banho de água com uma placa quente controlada pela temperatura a 70 graus Celsius.Coloque um frasco cheio de tampão de recuperação de epítope induzido pelo calor e 10% de glicerol no banho de água. Quando o buffer atingir 70 graus Celsius, coloque o rack com os slides no frasco de buffer. Incubar os slides a 70 graus Celsius por 120 minutos.Depois disso, retire o frasco do banho de água e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Enxágüe as seções resfriadas três vezes com a água ionizada e uma vez com TBS. Utilizando papel filtro enrolado ou um cotonete, remova cuidadosamente qualquer líquido entre as seções nos slides, certificando-se de deixar as seções hidratadas.Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para criar uma barreira em cada seção. Incubar a seção no buffer de bloqueio à temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a ligação inespecífica. Diluir os anticorpos primários no bloqueio de tampão a uma concentração de um micrograma por mililitro.Remova o tampão de bloqueio dos slides e adicione os anticorpos primários diluídos, certificando-se de usar um volume suficiente para evitar a secagem. Feche o recipiente úmido e incuba durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, lave as seções três vezes com TBS a cada lavagem com duração de cinco minutos.Prepare uma solução de trabalho de anticorpos secundários no bloqueio de buffer. Cubra as seções de tecidos com a solução de anticorpos secundários e transfira os slides para um recipiente úmido. Sele o recipiente úmido e incuba em temperatura ambiente por uma hora.Depois disso, lave as seções três vezes com TBS e uma vez na água com cada lavagem com duração de cinco minutos. Cubra as seções lavadas com meio de montagem e aplique vidro de cobertura, evitando a formação de bolhas. Após a solidificar o meio de montagem, use um microscópio confocal ou um microscópio de campo largo com filtros de passagem de banda apropriados para analisar a imunofluorescência.Para digitalizar as seções completas usando um scanner de slides, defina a intensidade da fluorescência usando os controles negativos e positivos. Usando a coloração de elastase neutrófilo, encontre as áreas ricas em neutrófilos e amplie essas áreas para verificar se o sinal de elastase neutrófilo é granular ou extracelular. Se o sinal for extracelular e se sobrepor com a coloração de histona e DNA, as armadilhas extracelulares neutrófilas foram obtidas.Neste estudo, os componentes NET são detectados com sucesso em tecido incorporado à parafina, tanto de origem humana quanto murina. Se as seções teciduais tiverem uma espessura entre dois a três micrômetros, elas podem ser analisadas por microscopia de campo largo usando objetivos de 10x ou 20x. Para avaliar corretamente a coloração, foram processadas amostras negativas e positivas.Uma seção representativa do tecido de apendicite humana mostra tecidos manchados para NE, H2B e Hoechst 33342. As imagens à esquerda são de uma área da seção contendo NETs, enquanto as imagens à direita são de uma área diferente da mesma seção que contém numerosos neutrófilos, mas sem NETs. Áreas com formação líquida maciça podem ser facilmente encontradas mesmo em baixas ampliações, uma vez que todos os três componentes NET são frequentemente encontrados em estruturas extracelulares.Isso aparece na sobreposição dos três canais como fibras extracelulares esbranquiçadas que podem ser quantificadas usando um software de análise de imagem para criar uma sobreposição roxa usando pixels de sinais sobrepostos que são positivos para verde, vermelho e azul. Para maior resolução, microscópios confocal ou microscópios de campo largo com desconvolução têm que ser usados para minimizar o desfoque fora de foco. Uma projeção máxima de uma pilha confocal de uma área rica em NET a partir do mesmo espécime de apendicite humana mostra que o NE é encontrado em grânulos, mas também é abundante extracelularmente onde ele se coloca com H2B e com DNA.A colocalização extracelular resulta em uma combinação de cores esbranquiçadas. Os pixels positivos para verde, vermelho e azul podem mais uma vez ser usados para criar uma sobreposição roxa apresentando NETs. Um detalhe representativo de uma seção central de um pulmão de camundongo infectado com Mycobacterium tuberculosis fornece outro exemplo da colocalização de todos os três componentes NET sendo claramente visíveis como áreas esbranquiçadas entre neutrófilos que podem ser usados para criar uma camada roxa indicando NETs.Durante o procedimento de coloração, as seções não devem ficar secas porque isso causará uma coloração falso-positiva ou um fundo alto. A análise do material arquivado pode ajudar a entender o impacto das NETs nas doenças. Como o tecido de parafina pode ter um fundo enorme, é importante ter um controle positivo e negativo que você possa distinguir entre sua coloração e o fundo.Deswaxing e desidratação devem ser realizados sob um capô de fumaça. Certifique-se de usar luvas e seu jaleco.

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