Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Hoje gostaríamos de mostrar-lhe variantes do protocolo comum de recuperação de antígenos induzidos pelo calor. Combina os benefícios da temperatura mais baixa para o antígeno de elastrói neutrófilo e alto valor de pH que é necessário para histones. Esta técnica permite estudar NETs, armadilhas extracelulares de neutrófilos, em tecidos de parafina tanto de camundongos quanto de homens.

E também é considerado para estudar material arquivado ou estudo retrospectivo. Primeiro, coloque os slides preparados em racks e submerse-os na mídia usada para desidratação e limpeza em ordem inversa por cinco minutos cada. Em seguida, aqueça um banho de água com uma placa quente controlada pela temperatura a 70 graus Celsius.

Coloque um frasco cheio de tampão de recuperação de epítope induzido pelo calor e 10% de glicerol no banho de água. Quando o buffer atingir 70 graus Celsius, coloque o rack com os slides no frasco de buffer. Incubar os slides a 70 graus Celsius por 120 minutos.

Depois disso, retire o frasco do banho de água e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Enxágüe as seções resfriadas três vezes com a água ionizada e uma vez com TBS. Utilizando papel filtro enrolado ou um cotonete, remova cuidadosamente qualquer líquido entre as seções nos slides, certificando-se de deixar as seções hidratadas.

Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para criar uma barreira em cada seção. Incubar a seção no buffer de bloqueio à temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a ligação inespecífica. Diluir os anticorpos primários no bloqueio de tampão a uma concentração de um micrograma por mililitro.

Remova o tampão de bloqueio dos slides e adicione os anticorpos primários diluídos, certificando-se de usar um volume suficiente para evitar a secagem. Feche o recipiente úmido e incuba durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, lave as seções três vezes com TBS a cada lavagem com duração de cinco minutos.

Prepare uma solução de trabalho de anticorpos secundários no bloqueio de buffer. Cubra as seções de tecidos com a solução de anticorpos secundários e transfira os slides para um recipiente úmido. Sele o recipiente úmido e incuba em temperatura ambiente por uma hora.

Depois disso, lave as seções três vezes com TBS e uma vez na água com cada lavagem com duração de cinco minutos. Cubra as seções lavadas com meio de montagem e aplique vidro de cobertura, evitando a formação de bolhas. Após a solidificar o meio de montagem, use um microscópio confocal ou um microscópio de campo largo com filtros de passagem de banda apropriados para analisar a imunofluorescência.

Para digitalizar as seções completas usando um scanner de slides, defina a intensidade da fluorescência usando os controles negativos e positivos. Usando a coloração de elastase neutrófilo, encontre as áreas ricas em neutrófilos e amplie essas áreas para verificar se o sinal de elastase neutrófilo é granular ou extracelular. Se o sinal for extracelular e se sobrepor com a coloração de histona e DNA, as armadilhas extracelulares neutrófilas foram obtidas.

Neste estudo, os componentes NET são detectados com sucesso em tecido incorporado à parafina, tanto de origem humana quanto murina. Se as seções teciduais tiverem uma espessura entre dois a três micrômetros, elas podem ser analisadas por microscopia de campo largo usando objetivos de 10x ou 20x. Para avaliar corretamente a coloração, foram processadas amostras negativas e positivas.

Uma seção representativa do tecido de apendicite humana mostra tecidos manchados para NE, H2B e Hoechst 33342. As imagens à esquerda são de uma área da seção contendo NETs, enquanto as imagens à direita são de uma área diferente da mesma seção que contém numerosos neutrófilos, mas sem NETs. Áreas com formação líquida maciça podem ser facilmente encontradas mesmo em baixas ampliações, uma vez que todos os três componentes NET são frequentemente encontrados em estruturas extracelulares.

Isso aparece na sobreposição dos três canais como fibras extracelulares esbranquiçadas que podem ser quantificadas usando um software de análise de imagem para criar uma sobreposição roxa usando pixels de sinais sobrepostos que são positivos para verde, vermelho e azul. Para maior resolução, microscópios confocal ou microscópios de campo largo com desconvolução têm que ser usados para minimizar o desfoque fora de foco. Uma projeção máxima de uma pilha confocal de uma área rica em NET a partir do mesmo espécime de apendicite humana mostra que o NE é encontrado em grânulos, mas também é abundante extracelularmente onde ele se coloca com H2B e com DNA.

A colocalização extracelular resulta em uma combinação de cores esbranquiçadas. Os pixels positivos para verde, vermelho e azul podem mais uma vez ser usados para criar uma sobreposição roxa apresentando NETs. Um detalhe representativo de uma seção central de um pulmão de camundongo infectado com Mycobacterium tuberculosis fornece outro exemplo da colocalização de todos os três componentes NET sendo claramente visíveis como áreas esbranquiçadas entre neutrófilos que podem ser usados para criar uma camada roxa indicando NETs.

Durante o procedimento de coloração, as seções não devem ficar secas porque isso causará uma coloração falso-positiva ou um fundo alto. A análise do material arquivado pode ajudar a entender o impacto das NETs nas doenças. Como o tecido de parafina pode ter um fundo enorme, é importante ter um controle positivo e negativo que você possa distinguir entre sua coloração e o fundo.

Deswaxing e desidratação devem ser realizados sob um capô de fumaça. Certifique-se de usar luvas e seu jaleco.