Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus
4 de setembro de 2019
Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.
Neste vídeo, demonstramos como expressar construções de DNA exógeno em neurônios ópticos e como imaginar arbores axonais ópticas expressivas individuais em girinos xenopus laevis intactos e vivos. Trata-se de um procedimento simples e barato para transgênese transitória específica de células que permite a determinação da função genética autônoma celular em arbores axonais ópticas individuais, desenvolvendo-se em um sistema modelo vertebrado vivo. Demonstrando o procedimento, serei eu, Sophia Dao, Assistente de Pesquisa, e a Dra.
Para começar, corte suavemente a ponta de uma pipeta micro capilar de vidro puxada com fórceps finos. Enchimento de vidro a pipeta micro capilar de vidro com óleo mineral usando um MICROFIL de tal forma que uma pequena gota de óleo mineral aparece na ponta cortada da micro pipeta. Encha a pipeta micro capilar de vidro no meio do caminho com óleo mineral.
Em um injetor, ejete o êmbolo no meio do caminho e carregue a pipeta micro capilar de vidro puxada no suporte de injeção. Em seguida, estenda o êmbolo até a extensão máxima para confirmar que a pipeta micro capilar está fortemente presa ao injetor e não se move com a extensão do êmbolo. Transfira uma gota de três microliter da mistura DNA/DOTAP em uma folha quadrada de papel parafina de uma polegada.
Sob um microscópio de dissecação estéreo, mova a ponta da pipeta micro capilar de vidro para a gota de DNA/DOTAP. Use a opção de preenchimento no aparelho de injeção, suga lentamente a gota de DNA/DOTAP na pipeta micro capilar de vidro. A fronteira entre o óleo mineral e a solução DNA/DOTAP é visível na pipeta micro capilar de vidro devido à ligeira opacidade da solução DNA/DOTAP.
Se necessário, pare de encher a pipeta micro capilar periodicamente para permitir que a pressão na pipeta micro capilar de vidro se recalibrar. Primeiro, em uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 0,1X MMR, manualmente desvitellinize 10 estágio 20 a 24 embriões xenopus com fórceps finos. Segure o envelope vitelline na cintura para evitar ferir os embriões.
Com fórceps tanto na mão esquerda quanto na direita do experimentador, estoure a bolha do envelope vitelino e solte o embrião do envelope vitelino. Tome cuidado para não ferir os embriões ao remover o envelope vitelline. Em seguida, use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta de corte para transferir de cinco a 10 estágio desvitélite 22 a 24 embriões para uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 1X MMR.
Sob um microscópio estéreo, segure um dos embriões desvitellinizados na placa de Petri com fórceps e organize o embrião para que seu polo anterior seja apontado para cima no campo de visão. Em seguida, oriente o embrião para que ele esteja deitado lateralmente e um de seus botões oculares da esquerda para a direita está voltado para cima. Segure o embrião com as fórceps na mão nondominante do experimentador e com a mão dominante do experimentador, introduza a ponta da micro pipeta de vidro do lado ventral ou dorsal logo abaixo da epiderme no botão do olho.
Injete entre 70 a 210 nanoliters da solução DNA/DOTAP. Em seguida, gire o embrião e realize a mesma micro injeção no outro olho no lado contralateral do embrião. Injete ambos os botões oculares de seis a 10 embriões em cada experimento.
Após a micro injeção, armazene embriões em uma placa de Petri com 1X MMR por aproximadamente 30 minutos para facilitar a cicatrização da ferida. Após 30 minutos, transfira os embriões injetados com uma pipeta de transferência plástica para uma solução mmr de 0,1X com fenilthiocarbamida de agente de branqueamento de 0,001% para reduzir a pigmentação. Cubra a placa de Petri com uma tampa para cultivar os embriões por aproximadamente cinco dias até que os embriões tenham se desenvolvido em girinos nos estágios 46 a 47.
Este protocolo produz uma taxa de sucesso de 30 a 60% dos embriões xenopus injetados expressando GFP em um a 10 arbores axonais ópticos. Imagens confocais representativas da GFP mostram o controle expresso e as arbores axonais ópticas mutantes nos girinos Xenopus intactos. Dois mutantes de domínio de APC, APCNTERM e APBbeta-cat foram clonados em plasmídeos pCS2.
Imagens da série Z do controle GFP e arbores axonal mutantes APC foram reconstruídas. Parcelas de número de ramos, comprimento total do ramo arbor e comprimento médio do ramo confirmam diferenças observadas entre controle e mutante APC expressando arbors axonais. Gráficos de dispersão adicionais de número de ramos versus comprimento médio do ramo com linhas de regressão mostram correlação inversa entre esses parâmetros e arbores axonais ópticas expressando domínios APC.
A ponta da pipeta micro capilar deve ser corretamente inserida superficialmente no broto ocular para que a epiderme cinza sobrevoando o broto do olho incha durante cada micro injeção. Este procedimento pode ser usado tanto para rotular e alterar a função genética específica em neurônios ópticos, enquanto avalia o crescimento, direcionamento e ramificação de axônios a partir desses neurônios ópticos. Esta microinjeção de DNA e técnica de lipofecção permitiram aos pesquisadores da neurobiologia do desenvolvimento estudar mecanismos moleculares autônomos celulares que regulam a arborização do axônio óptico em girinos xenopus laevis intactos e vivos.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra a microinjeção de uma mistura de DNA/DOTAP nos olhos de embriões de Xenopus laevis com um dia de idade e a obtenção de imagens de arborizações axonais ópticas expressando GFP em girinos vivos. Este método permite o estudo da função gênica em um modelo de vertebrado.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Transgênese
Contexto
- Xenopus laevis é um organismo modelo amplamente utilizado em biologia do desenvolvimento.
- A transgênese transitória específica por célula permite o estudo da função gênica em tipos celulares específicos.
- A GFP permite a visualização de estruturas neuronais em espécimes vivos.
- Essa técnica é econômica e simples.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método para expressar DNA exógeno em neurônios ópticos.
- Visualizar arborizações axonais ópticas individuais em girinos vivos.
- Facilitar o estudo da função gênica autônoma celular.
Métodos Utilizados
- Microinjeção da mistura DNA/DOTAP em primórdios oculares embrionários.
- Uso de pipetas de capilar de vidro para injeção.
- Imageamento de neurônios que expressam GFP em girinos vivos.
- Reconstrução dos arborizações axonais ópticas no mesencéfalo tectal.
Resultados Principais
- Expressão bem-sucedida de GFP em neurônios ópticos.
- Visualização de arborizações axonais individuais em espécimes vivos.
- Demonstração da eficácia do procedimento para o estudo da função gênica.
- Estabelecimento de um método confiável para transgênese transitória em Xenopus laevis.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa em neurociência.
- Ele aprimora a compreensão da função gênica em modelos vertebardos em desenvolvimento.
- O método é acessível e reprodutível para pesquisadores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microinjeção direta de DNA nos primórdios oculares de Xenopus laevis permite manipulação genética precisa e específica por célula, além de imagens vivas da arborização axonal óptica. Essa abordagem fornece uma plataforma robusta para a análise de mecanismos moleculares autônomos celulares subjacentes à conectividade neuronal, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pesquisas sobre neurodesenvolvimento. As saídas quantitativas e a reprodutibilidade do método aumentam a confiança preditiva para triagem de portfólios e continuidade translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação da função gênica em neurônios ópticos individuais dentro de um sistema vertebrado vivo.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao isolar efeitos autônomos celulares na ramificação e direcionamento axonal.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio da visualização direta e quantificação da morfologia neuronal.
- Oferece confiança preditiva para avançar alvos no desenvolvimento neurológico na etapa de descoberta.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Prepara sistemas biológicos vivos validados para fluxos de trabalho de imagem subsequente e análise quantitativa.
- Fornece resultados reprodutíveis e quantificáveis, como número de ramificações e comprimento do arbor, para estudos comparativos.
- Permite a padronização e escalabilidade de ensaios para avaliação de construtos genéticos ou moduladores de vias.
- Apoia a triagem confiável da função gênica e dos resultados fenotípicos em um contexto vertebrado.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a doença no estudo da conectividade neuronal e desenvolvimento sináptico.
- Oferece continuidade desde descobertas iniciais de mecanismos até a validação pré-clínica de alvos no desenvolvimento neurológico.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em leituras funcionais in vivo.
- Apoia a identificação de biomarcadores translacionais por meio de imagem em tempo real da arquitetura neuronal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir estudos hipótese-dirigidos da função gênica, fenotipagem quantitativa e imagem em tempo real em um modelo vertebrado.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias no desenvolvimento neuronal.
- Triagem: Fornece sistemas prontos para ensaios e reprodutíveis para avaliação de intervenções genéticas ou farmacológicas.
- Análise: Gera dados morfológicos quantitativos para comparação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta de mecanismos com a validação pré-clínica em sistemas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para diversos estudos de função gênica e conectividade em programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neuronais.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho padronizados, escaláveis e reprodutíveis de manipulação genética e de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos in vivo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos envolvidos no desenvolvimento neural.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em microinjeção, imagem em tempo real e análise morfológica quantitativa.
- Requer acesso a equipamento de microinjeção, microscopia confocal e software de análise de imagens.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode ser necessária adaptação para outros sistemas modelo ou subtipos neuronais.
- As taxas de sucesso e produtividade são influenciadas pela proficiência técnica e manipulação de embriões.
