Name: Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda microinjeção de ADN em eyebuds de embriões de Xenopus laevis e imagem de arbores axonais óticos expressando GFP em girinos vivos. Este método permite estudar função génica em neurónios óticos de modelo vertebrado.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos ao touro University California College da Medicina Osteopática por apoiar a nossa pesquisa. Reconhecemos os alunos anteriores no laboratório (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) que ajudaram a implementar esta técnica de microinjeção em nosso laboratório. Estamos gratos ao Dr. Christine Holt, em cujo laboratório esta microinjeção de DNA/técnica de lipofection em embriões Xenopus foi desenvolvida pela primeira vez.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade touro Califórnia (protocolo n º TUCA003TE01X).
1. obtenção de embriões X. laevis
<ol><li>Obtenha embriões de X. laevis pelo acoplamento natural dos pares de râs adultas masculinas e fêmeas aprontado com a gonadotropina coriónica humana (HCG), pela fertilização in vitro dos ovos derramados das râs adultas fêmeas APRONTADO com HCG, ou requisitando diretamente (tabela de Materiais).</li>
	<li>
Embriões de degeleia obtidos com solução de cisteína a 2% à temperatura ambiente (tabela de materiais)16.
	<ol>
<li>Colete 50 − 100 embriões em um grande prato de Petri. Retire a solução em que os embriões se encontram decantando ou usando uma pipeta de transferência plástica. Adicionar 25 mL de solução de cisteína a 2% (0,5 g de cisteína em 25 mL ddH2o, pH a 8,0) para o prato que contém os embriões.</li>
		<li>Agitar suavemente a placa de Petri contendo os embriões na solução de cisteína até que os casacos de geléia dos embriões caem e os embriões coletam em um moita no centro do prato (5 − 10 min). Neste ponto, lentamente e delicadamente despeje a solução de cisteína em um copo de resíduos. Tome cuidado para não derramar muitos dos embriões na taça de resíduos, juntamente com a solução de cisteína.</li>
		<li>Enxágüe os embriões na placa de Petri 6x com 10% de solução modificada de Mark ' s Ringer (MMR) ou outra solução adequada (por exemplo, solução de Barth modificada, MBS), rodando o prato cada vez que a solução é substituída.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura os embriões em 10% MMR até que alcancem estágios desenvolventes 22 − 2417. Os embriões de Xenopus podem ser incubados em temperaturas entre 15 − 25 ° c. A taxa de desenvolvimento dos embriões depende da temperatura que são incubadas em17. Nota: Os embriões de Xenopus requisitados de um catálogo chegam geralmente no laboratório em estágios desenvolventes 20 − 24, assim que podem ser dejellied e injetado imediatamente.</li>
</ol>2. preparando Plasmíos de DNA e fazendo uma mistura de DNA/DOTAP
<ol><li>Construções de expressão de DNA subclone emvetores de expressãode Xenopus pCS2 + ou pCS2 + MT ou seus derivados (originalmente construídos por D. Turner e R. Rupp)5,6,7. os vetores de pCS2 + contêm um promotor modificado do citomegalovírus (CMV) que facilite a expressão de gene nas râs.</li>
	<li>Amplificar pCS2 plasmís contendo GFP e/ou genes de interesse com kits protocolo (tabela de materiais) seguindo o procedimento padrão. Na etapa de eluição final do protocolo protocolo, realize uma eluição sequencial do DNA em DDH2o para produzir uma concentração final de &gt; 1 μg/μl.</li>
	<li>Armazene todos os plasmídios pCS2 a-80 ° c até estarem prontos para realizar um experimento de microinjeção/lipofecção, ou seja, quando os embriões estão em estágios de desenvolvimento 22 − 24.</li>
	<li>Thaw DNA plasmís para ser lipofected em temperatura ambiente. Imediatamente antes da lipofection, centrifugue brevemente plasmíos de DNA. Isso impedirá que o precipitado se formate na mistura DNA/DOTAP que pode entupir a ponta da pipeta microcapilar.</li>
	<li>Combine plasmíos de DNA com o reagente de transfecção lipossomal DOTAP (tabela de materiais) em uma proporção de 1:3 (w/v)9,10. Por exemplo, transfira 2 μg de DNA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 6 μL de DOTAP, ou transfira 3 μg de DNA em um tubo de microcentrífuga e adicione 9 μL de DOTAP.</li>
	<li>Uma vez que o DNA e DOTAP são combinados, mexa suavemente o tubo de microcentrífuga para misturar a solução. A solução de DNA/DOTAP deve ficar ligeiramente opaca após a mistura.</li>
	<li>Se dois plasmídeo estão a ser lipofected em conjunto (por exemplo, pCS2-GFP com um segundo plasmídeo pCS2 contendo uma versão truncada ou de comprimento total de um gene) em neurônios óticos, primeiro Combine os dois plasmídos (após brevemente centrifugação ambos) em uma proporção de 1:1 e, em seguida, adicionar DOTAP em uma relação 1:3 (w/v). Por exemplo, combine 1 μg de pCS2-GFP com 1 μg de um segundo plasmídeo pCS2 e, em seguida, adicione 6 μL de DOTAP. Nota: Estudos mostraram que a lipofecção de dois plasmídios em oculares de embriões Xenopus nesses estágios de desenvolvimento resultará em sua coexpressão em neurônios ópticos individuais9,10.</li>
</ol>3. carregando uma agulha de microinjeção com DNA/DOTAP
<ol><li>Aperte suavemente a ponta de uma pipeta microcapilar de vidro puxado com fórceps fino (tabela de materiais).</li>
	<li>Backfill a pipeta microcapilar de vidro com óleo mineral usando um microfil tal que uma gota minúscula do óleo mineral apareça na ponta cortada da micropipeta. Encha a pipeta microcapilar no meio do óleo mineral.</li>
	<li>Carregue a pipeta microcapilar de vidro puxada que é enchida agora com o óleo mineral em um suporte apropriado da injeção conectado a um injector. Se utilizar um injector (tabela de materiais), ejecte o êmbolo a meio caminho antes de carregar a pipeta microcapilar sobre ela. Uma vez que a pipeta microcapilar é fixada firmemente ao injector, estenda o atuador na extensão cheia para confirmar que a pipeta microcapilar é unida fortemente ao injector e não se move com a extensão do atuador.</li>
	<li>Transfira uma gota de 3 μL da mistura DNA/DOTAP para uma folha quadrada de corte (1 polegada quadrada) de papel de parafina.</li>
	<li>um microscópio de dissecação estereofónico, mova a ponta da pipeta microcapilar de vidro na gota de DNA/DOTAP.</li>
	<li>Lentamente, sugar a gota de DNA/DOTAP na pipeta microcapilar de vidro usando a opção de preenchimento no aparelho de injeção. À medida que o líquido é carregado na pipeta microcapilar, a gota vai ficar menor. Devido à ligeira opacidade da solução DNA/DOTAP, o limite entre o óleo mineral e a solução DNA/DOTAP deve ser visível na pipeta microcapilar de vidro (Figura 1). Se necessário, pare de encher a pipeta microcapilar periodicamente para permitir que a pressão na pipeta microcapilar de vidro Recalibrate.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60123/60123fig01v2.jpg"> Figura 1: imagens de pipeta microcapilar. As imagens mostram uma pipeta microcapilar no aparelho de injeção, antes (a), e após (B) enchimento com DNA/DOTAP. Abra as setas, ponta do êmbolo na pipeta microcapilar (a, B). Seta fechada, linha entre o óleo mineral e o DNA/DOTAP na pipeta microcapilar preenchida (B). Barra de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60123/60123fig01v2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. microinjetando DNA/DOTAP em Eyebuds de 1 dia velho Xenopus embriões
<ol><li>Devitellinize manualmente dez embriões de Xenopus do estágio 20 − 24 com o fórceps fino em um prato de Petri de 10 milímetros enchido com o 0.1 x MMR. Segure o envelope vitelina na cintura para evitar ferir os embriões. Com fórceps em ambas as mãos esquerda e direita do experimentador, estale a bolha do envelope do vitelina e libere o embrião do envelope do vitelina. Tome cuidado para não ferir os embriões ao remover o envelope vitelina. Nota: Começando no estágio 20, os embriões de Xenopus desenvolvem um recuo ou "cintura" entre as metades anterior e posterior do embrião. Esta cintura permite uma lacuna para formar entre o envelope vitelina e o embrião nesta posição.</li>
	<li>Use uma pipeta de transferência plástica com uma ponta do corte para transferir 5 − 10 embriões devitellinized do estágio 22 − 24 a um prato de Petri de 10 milímetros enchido com o 1x MMR. Nota: A solução de sal mais elevada em 1x MMR facilita a cura de feridas da punctura que resultarão da microinjeção.</li>
	<li>o estereomicroscópio, segure um dos embriões devitellinized no prato de Petri com fórceps em cada mão, e arranje o embrião de modo que seu pólo anterior esteja apontado acima no campo de visão. Oriente o embrião para que ele está deitado lateralmente e um dos seus olhos (esquerda ou direita) está virado para cima.</li>
	<li>o estereomicroscópio, segure o embrião com a pinça na mão não dominante do experimentador e, com a mão dominante do experimentador, introduza a ponta da micropipeta de vidro no olho (do lado ventral ou dorsal, dependendo da metade do o embrião que está sendo injetado atualmente), logo abaixo da epiderme (Figura 2). Injete entre 70 − 210 nL da solução DNA/DOTAP. Isso pode ser feito em vários pulsos, dependendo do tamanho do pulso que o injector está definido para (geralmente 70 nL). Nota: O profundidade da injeção é muito importante para o lipofecção em neurônios óticos. Se a posição da ponta do microcapilar é inserida corretamente muito superficialmente no olho, em seguida, após a microinjecção, a epiderme cinzenta sobrejacente o olho vai inchar. Se a posição for muito profunda, o olho cinzento não mostrará quaisquer alterações, e a frequência de expressão de DNA em neurônios ópticos será menor.</li>
	<li>Gire o embrião ao redor e execute a mesma microinjeção no ocular no lado contralateral do embrião.</li>
	<li>Injete ambos os olhos de 6 − 10 (ou mais) embriões em cada experimento.</li>
	<li>Após a microinjeção, armazene os embriões em uma placa de Petri com 1x MMR por aproximadamente 30 minutos para facilitar a cicatrização de feridas.</li>
	<li>Após 30 min, transfira embriões injetados em uma solução de 0,1 x MMR com 0, 1% de agente clareador (Feniltiocarbamida) para reduzir a pigmentação. Cultura os embriões cobertos por aproximadamente cinco dias, até que os embriões se desenvolveram em girinos em estágios 46 − 4716.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60123/60123fig02v2.jpg"> Figura 2: demarcação da região ocular para microinjeção. Esquema (A) e fotomicrografia (B) do embrião de X. laevis em estágios de desenvolvimento 22/23 mostram a região do EyeBud que deve ser alvejada para o microinjection (Destaques vermelhos). Barra de escala = 1 mm. o painel A foi modificado de Zahn et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60123/60123fig02v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
5. imagem latente de GFP que expressa mandris axonal óticos em Tadpoles intactos, vivendo
Nota: Quando os girinos que foram lipofected com ADN alcangam estágios desenvolventes 46 − 47, estão prontos para a imagem latente.
<ol><li>Antes da imagem, os girinos devem ser anestesiados. Para anestesiar os girinos, transfira os girinos lipofected em uma solução de tricaína a 0, 2% em ddH2O em uma placa de Petri de 10 mm. Aguarde 5 − 10 min até que os girinos se tornem imóveis. Verifique se os girinos ainda estão vivos observando seus corações batendo um microscópio de dissecação estéreo.</li>
	<li>Coloc um girino anestesiado em uma câmara feito-à-medida do silicone em uma corrediça e em um selo de vidro com um COVERSLIP. O girino deve inclinar ligeiramente de modo que um lado (esquerdo ou direito) de sua cabeça seja inclinado para cima e apenas toque mal o deslizamento de tampa.</li>
	<li>Tela a metade do midbrain tectal dorsal do girino que é inclinado para cima na baixa ampliação para GFP que expressa mandris axonal óticos. Nota: Um microscópio ereto do Widefield equipado com uma iluminação do epilfuorescence e uma lente objetiva apocromático (tabela dos materiais) pode ser usado para telar para Arbors fluorescentes.</li>
	<li>Se o hemisfério tectal contiver entre um a três GFP expressando mandris axonal óticos, Capture uma z-série das imagens destes mandris usando um objetivo de longa distância de trabalho do ar do contraste 40x elevado (tabela dos materiais). Para cada mandril axonal, Capture 10 − 20 fatias da z-série em intervalos de 1,5 μm.</li>
	<li>A fim Ver os mandris do AXON no outro lado do midbrain tectal, recarregue o girino na câmara do silicone de modo que inclina ao outro lado e sele com um deslizamento de tampa. Em seguida, repita os passos 5,3 e 5,4.</li>
</ol>6. reconstrução e quantificação da morfologia do mandril axonal óptico
<ol><li>Selecione uma pilha de imagens que contenha entre um a três GFP que expressa os mandris axonal óticos.</li>
	<li>Use a ferramenta de desenho à mão livre no software de edição gráfica (tabela de materiais) para rastrear a porção de cada mandril axonal óptico visível em cada z-Slice. Traçar através das partes de cada mandril evidente em cada z-fatia criará uma projeção 2D exata do mandril. As cores diferentes podem ser usadas para traçar GFP distinto que expressa Arbors axonal óticos.</li>
	<li>Faça todas as medições morfométricas em reconstruções 2D dos mandris axonais, com referência à série z original de imagens quando necessário7. Usando o software Image J (tabela de materiais), medir parâmetros morfológicos como o número de ramificações (ou seja, número de pontas de ramificação ou pontos de ramificação), comprimento total do ramo de mandril, comprimento por ramo, comprimento e largura do mandril, forma geral do mandril (L/W relação, circularidade) e ângulo das ramificações7.</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li>
<li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo%3A+dynamics+and+modulation+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system%3A+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li>
<li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-and+C-terminal+domains+of+%CE%B2-catenin%2C+respectively%2C+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li>
<li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK-3%CE%B2+and+%CE%B1-catenin+binding+regions+of+%CE%B2-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li>
<li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number%2C+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li>
<li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li>
<li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li>
<li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li>
<li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li>
<li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li>
<li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2%CE%B4+in+developing+retina%3A+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107(2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).</li>
<li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zahn+drawings%3A+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li>
<li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li>
<li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ena%2FVASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li>
<li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290(2015).</li>
<li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste artigo, Nós demonstramos como expressar construções exógenas do ADN no único ou em números pequenos de neurônios óticos e como a imagem GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada em girinos intactos, vivos da râ X . a laevis. Também explicamos como reconstruir e quantificar a morfologia da GFP expressando mandris axonais ópticos a partir de imagens capturadas in vivo. Para expressar os plasmídios exógenos do ADN no número pequeno de neurônios óticos, nós m...

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, axônios de neurônios pré-sinápticos navegar através de diversas regiões do cérebro para alcançar suas áreas-alvo. Quando os axônios invadem seus tecidos-alvo, eles estabelecem conexões sinápticas com neurônios-alvo pós-sinápticos. Em muitos tipos de neurônios, os axônios aumentam o número e a extensão espacial das conexões sinápticas que eles podem fazer elaborando redes de ramos terminais ou mandris1. A projeção retino-tectal de girinos da rã aquática Xenopus laevis é um poderoso modelo de vertebrados para o exame de mecanismos subjacentes à arborização do AXON terminal e à conectividade sináptica2,3,4 . O GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada pode ser observado diretamente em girinos intactos, vivos de Xenopus 5,6,7,8. Para expressar a GFP isoladamente ou em conjunto com versões completas ou truncadas de genes em pequeno número de neurônios ópticos, utilizamos uma técnica envolvendo microinjeção/lipofection de DNA em oculares de embriões de um dia de idade Xenopus 9, a técnica 10. this foi desenvolvida originalmente para estudar mecanismos do pathfinding ótico do AXON em Tadpoles novos de Xenopus , e tem sido aplicada desde que nós e outro para determinar os mecanismos moleculars pilha-autônomos que subjacentes o AXON ótico arborização em Xenopus girinos5,6,7,8,9,10.
Técnicas alternativas para expressar genes exógenos em um pequeno número de neurônios ópticos foram desenvolvidas em outras espécies-modelo, bem como em X. laevis. No entanto, cada uma dessas abordagens apresenta desafios e limitações quando comparada à microinjeção de DNA/reagente de lipofection em olhos de embriões Xenopus . Em camundongos, a transgênese pode ser usada para expressar genes em um pequeno número de neurônios ópticos, mas a geração de camundongos transgênicos é dispendiosa e os camundongos transgênicos e demorados frequentemente apresentam efeitos colaterais indesejáveis11. O zebrafish transgenic que expressa genes exógenos em neurônios óticos pode igualmente ser criado injetando plasmídeos em embriões adiantados12da fase da segmentação. No entanto, este processo requer a clonagem de um promotor específico para expressar genes em um padrão de mosaico em neurônios ópticos em larvas de zebrafish12. A frequência de expressão de DNA exógeno em neurônios ópticos em zebrafish transgênico também é um pouco menor (< 30%) comparado aos girinos Xenopus que foram microinjetados com reagente de DNA/Liposomal (30 − 60%)12. No ovo o electroporation tem sido usado igualmente para expressar genes no pequeno número de neurônios óticos nos pintainhos13. Entretanto, este procedimento não caracterizou inteiramente os mecanismos que estabelecem projeções óticas porque o arborização ótico do AXON não pode ser imaged em embriões intactos, vivos do pintainho. Finalmente, vários laboratórios usaram eletroporação para transfecção genes em pequeno número de neurônios ópticos em Xenopus girinos14,15. Ainda, o electroporation exige a optimização dos equipamentos e dos protocolos (stimulator, elétrodos, padrões espaciais e temporais de pulsos da onda) Além daquele usado para o microinjection do reagente do ADN/lipofection em ocular de embriões de Xenopus .
Nós e outros usamos previamente a técnica da microinjeção/lipofection do ADN em eyebuds de embriões do Xenopus para determinar os mecanismos autônomos da sinalização da pilha que estabelecem o arborização ótico5,6 do AXON 7 anos de , 8. inicialmenteutilizamos esta abordagem para dissecar as funções da proteína do adaptador de caderina e WNT β-catenina na arborização axonal óptica em Xenopus girinos5,6. Em um estudo, nós mostramos que a ligação β-catenina à α-catenina e ao PDZ é necessária, respectivamente, para iniciar e moldar os mandris axonais ópticos in vivo5. Em um segundo relato, demonstramos que os domínios de ligação β-catenina para α-catenina e GSK-3β modulam de forma oposta os padrões de projeção dos mandris axonais ópticos ventrais6. Mais recentemente, identificamos papéis para o fator WNT, polipose adenomatosa coli (APC), na regulação das características morfológicas de mandris axonais ópticos em Xenopus girinos7. Ao coexpressar o N-terminal e os domínios centrais da APC que modulam a estabilidade da β-catenina e a organização dos microtúnios em conjunto com a GFP em neurônios ópticos individuais, determinamos papéis compartilhados e distintos para esses domínios de interação APC no número de filiais, comprimento e ângulo em mandris axonais ópticos in vivo7. Outro laboratório utilizou a técnica de microinjeção/lipofecção para determinar papéis autônomos de células para sinalização pelo receptor BDNF, TrkB, em mandris axonais ópticos em Xenopus girinos8. Este grupo mostrou que a expressão de um TrkB dominante-negativo perturbou a ramificação e a maturação sináptica em mandris óticos individuais do AXON in vivo8. Globalmente, a técnica de lipofecção no Xenopus já iluminou os papéis específicos de diferentes genes na ramificação do axão óptico no ambiente nativo.

<table><tbody><tr><td>Micropipetas de 3,5</td>" <td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 - Software G/X</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-manager (Versão 1.4)</td><td>Vale Lab</td><td></td><td>www.micro-manager.org</td></tr><tr><td>câmera CCD</td><td>Scion Corporation</td><td>CFW-1312 M</td><td></td></tr><tr><td>Chorulon (Gonadotrofina Coriônica Humana)</td><td>AtoZ Vet Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11202375001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11250-10</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800 microscópio de epifluorescência</td><td>Nikon</td><td></td><td>Objetivos: Nikon Plan Apo 20x / 0.75, Nikon Plan Fluor 40 / 0.75</td></tr><tr><td>GNU Image Manipulation Program (Versão 2.10.10)</td> <td>GIMP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator (2017 Creative Nuvem)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Versão 1.46r)</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF 34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador com adaptador universal e base de suporte</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-024-R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>3-000-025-SB</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>3-000-024-A</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Motorizado z-stage</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MFC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Injetor Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Powerpoint (Versão 15.31)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis embriões</td><td>Nasco</td><td>LM00490</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection do adn em eyebuds em embriões do laevis de xenopus e imagem latente de gfp que expressa arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de xenopus

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

A projeção Visual preliminar dos girinos da rã aquática Xenopus laevis sere como um sistema modelo excelente para estudar os mecanismos que regulam o desenvolvimento da conectividade neuronal. Durante o estabelecimento da projeção retino-tectal, os axônios óticos estendem do olho e navegam através das regiões distintas do cérebro para alcangar seu tecido do alvo, o Tectum ótico. Uma vez que os axônios óticos entram no Tectum, elaboram os mandris terminais que funcionam para aumentar o número de conexões sináptica que podem fazer com os interneurônios do alvo no Tectum. Aqui, nós descrevemos um método para expressar o ADN que codifica a proteína fluorescente verde (GFP), e o ganho-e construções do gene da perda--função, em neurônios óticos (pilhas retinal do gânglio) em embriões de Xenopus . Nós explicamos como microinjeção um reagente combinado do ADN/lipofection nos ocular de uns embriões velhos do dia tais que os genes exógenos são expressos no único ou em números pequenos de neurônios óticos. Marcando genes com GFP ou coinjetando com um plasmídeo de GFP, os mandris axonal terminais de neurônios óticos individuais com sinalização molecular alterada podem ser imaged diretamente nos cérebros de girinos intactos, vivos de Xenopus diversos dias mais tarde, e sua morfologia pode ser quantificada. Este protocolo permite a determinação de mecanismos moleculares Cell-Autonomous que fundamentam o desenvolvimento do arborização ótico do AXON in vivo.

O protocolo descrito neste artigo rende uma taxa do sucesso de 30 − 60% de embriões injetados de Xenopus que expressam GFP (sozinho ou junto com uns construtores adicionais do ADN) em um a dez mandris axonal óticos. Na Figura 3, mostramos imagens confocais representativas de GFP expressando controle e mandris axonais ópticos mutantes em girinos Xenopus intactos do nosso estudo publicado recentemente7. Para este estudo, nós clonamos dois mutantes de d...

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Neste vídeo, demonstramos como expressar construções de DNA exógeno em neurônios ópticos e como imaginar arbores axonais ópticas expressivas individuais em girinos xenopus laevis intactos e vivos. Trata-se de um procedimento simples e barato para transgênese transitória específica de células que permite a determinação da função genética autônoma celular em arbores axonais ópticas individuais, desenvolvendo-se em um sistema modelo vertebrado vivo. Demonstrando o procedimento, serei eu, Sophia Dao, Assistente de Pesquisa, e a Dra.Para começar, corte suavemente a ponta de uma pipeta micro capilar de vidro puxada com fórceps finos. Enchimento de vidro a pipeta micro capilar de vidro com óleo mineral usando um MICROFIL de tal forma que uma pequena gota de óleo mineral aparece na ponta cortada da micro pipeta. Encha a pipeta micro capilar de vidro no meio do caminho com óleo mineral.Em um injetor, ejete o êmbolo no meio do caminho e carregue a pipeta micro capilar de vidro puxada no suporte de injeção. Em seguida, estenda o êmbolo até a extensão máxima para confirmar que a pipeta micro capilar está fortemente presa ao injetor e não se move com a extensão do êmbolo. Transfira uma gota de três microliter da mistura DNA/DOTAP em uma folha quadrada de papel parafina de uma polegada.Sob um microscópio de dissecação estéreo, mova a ponta da pipeta micro capilar de vidro para a gota de DNA/DOTAP. Use a opção de preenchimento no aparelho de injeção, suga lentamente a gota de DNA/DOTAP na pipeta micro capilar de vidro. A fronteira entre o óleo mineral e a solução DNA/DOTAP é visível na pipeta micro capilar de vidro devido à ligeira opacidade da solução DNA/DOTAP.Se necessário, pare de encher a pipeta micro capilar periodicamente para permitir que a pressão na pipeta micro capilar de vidro se recalibrar. Primeiro, em uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 0,1X MMR, manualmente desvitellinize 10 estágio 20 a 24 embriões xenopus com fórceps finos. Segure o envelope vitelline na cintura para evitar ferir os embriões.Com fórceps tanto na mão esquerda quanto na direita do experimentador, estoure a bolha do envelope vitelino e solte o embrião do envelope vitelino. Tome cuidado para não ferir os embriões ao remover o envelope vitelline. Em seguida, use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta de corte para transferir de cinco a 10 estágio desvitélite 22 a 24 embriões para uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 1X MMR.Sob um microscópio estéreo, segure um dos embriões desvitellinizados na placa de Petri com fórceps e organize o embrião para que seu polo anterior seja apontado para cima no campo de visão. Em seguida, oriente o embrião para que ele esteja deitado lateralmente e um de seus botões oculares da esquerda para a direita está voltado para cima. Segure o embrião com as fórceps na mão nondominante do experimentador e com a mão dominante do experimentador, introduza a ponta da micro pipeta de vidro do lado ventral ou dorsal logo abaixo da epiderme no botão do olho.Injete entre 70 a 210 nanoliters da solução DNA/DOTAP. Em seguida, gire o embrião e realize a mesma micro injeção no outro olho no lado contralateral do embrião. Injete ambos os botões oculares de seis a 10 embriões em cada experimento.Após a micro injeção, armazene embriões em uma placa de Petri com 1X MMR por aproximadamente 30 minutos para facilitar a cicatrização da ferida. Após 30 minutos, transfira os embriões injetados com uma pipeta de transferência plástica para uma solução mmr de 0,1X com fenilthiocarbamida de agente de branqueamento de 0,001% para reduzir a pigmentação. Cubra a placa de Petri com uma tampa para cultivar os embriões por aproximadamente cinco dias até que os embriões tenham se desenvolvido em girinos nos estágios 46 a 47.Este protocolo produz uma taxa de sucesso de 30 a 60% dos embriões xenopus injetados expressando GFP em um a 10 arbores axonais ópticos. Imagens confocais representativas da GFP mostram o controle expresso e as arbores axonais ópticas mutantes nos girinos Xenopus intactos. Dois mutantes de domínio de APC, APCNTERM e APBbeta-cat foram clonados em plasmídeos pCS2.Imagens da série Z do controle GFP e arbores axonal mutantes APC foram reconstruídas. Parcelas de número de ramos, comprimento total do ramo arbor e comprimento médio do ramo confirmam diferenças observadas entre controle e mutante APC expressando arbors axonais. Gráficos de dispersão adicionais de número de ramos versus comprimento médio do ramo com linhas de regressão mostram correlação inversa entre esses parâmetros e arbores axonais ópticas expressando domínios APC.A ponta da pipeta micro capilar deve ser corretamente inserida superficialmente no broto ocular para que a epiderme cinza sobrevoando o broto do olho incha durante cada micro injeção. Este procedimento pode ser usado tanto para rotular e alterar a função genética específica em neurônios ópticos, enquanto avalia o crescimento, direcionamento e ramificação de axônios a partir desses neurônios ópticos. Esta microinjeção de DNA e técnica de lipofecção permitiram aos pesquisadores da neurobiologia do desenvolvimento estudar mecanismos moleculares autônomos celulares que regulam a arborização do axônio óptico em girinos xenopus laevis intactos e vivos.

microinjection-dna-into-eyebuds-xenopus-laevis-embryos-imaging-gfp

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática...

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Aqui apresentamos duas técnicas para manipular a expressão do gene em camundongos células ganglionares da retina (RGCs)...

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto...

Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

Xenopus ectoderma embrionário tornou-se um modelo atraente para os estudos da polaridade celular. Um ensaio é descrito, em que a distribuição subcelular de proteínas fluorescentes é avaliada em células ectoderma. Este protocolo vai ajudar abordar as questões relacionadas ao controle espacial de sinalização.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Um método para a incorporação de DNA plasmidial em células da retina de camundongos com o propósito de realizar qualquer ganho ou perda de função de...

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.

Expressão de proteínas fluorescentes em Branchiostoma lanceolatum Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

Aqui, apresentamos um protocolo para usar mapas de destino e traçadores de linhagem para direcionar injeções em blastômeros individuais que dão origem ao rim de embriões de Xenopus laevis.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Aprenda microinjeção de ADN em eyebuds de embriões de Xenopus laevis e imagem de arbores axonais óticos expressando GFP em girinos vivos. Este método permite estudar função génica em neurónios óticos de modelo vertebrado.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus (Vídeo) | JoVE Journal

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

Explorar mais vídeos