Tom basal biaxial e teste passivo do sistema reprodutivo murino usando um Miografo de pressão
13 de agosto de 2019
Este protocolo utilizou um sistema de miografo de pressão disponível comercialmente para realizar testes miográficos de pressão na vagina e colo do útero murino. Utilizando meios com e sem cálcio, as contribuições do tom básico das pilhas de músculo liso (SMC) e da matriz extracelular passiva (ECM) foram isoladas para os órgãos circunstâncias physiological estimadas.
Este protocolo investiga as propriedades mecânicas biaxiais dos órgãos reprodutivos que elucidam a contribuição das células musculares lisas e da matriz passiva. Esta técnica mantém a geometria dos órgãos e a célula muscular lisa nativa para interações matriciais permitindo a sujeição do órgão a uma gama fisiológica de pressões e extensões axiais. Investigar a função biaxial do órgão sob cargas fisiologicamente relevantes pode auxiliar na melhor compreensão da etiologia das patologias reprodutivas.
Testar biaxalmente o colo uterino e a vagina fornece uma visão dos campos da saúde da mulher e da biomecânica. Métodos semelhantes são utilizados para estudar vasos sanguíneos, esôfago e intestinos grossos. Ao trabalhar com um novo órgão, pode levar tempo para finalizar os detalhes técnicos, como como melhor suturar o tecido ou como determinar o comprimento descarregado.
Para coletar o sistema reprodutivo do animal experimental, coloque o rato em uma almofada absorvente sob um microscópio dissecando e use pinças angulares e tesouras para levantar a pele ao redor do abdômen. Faça uma incisão inicial na base do abdômen acima do osso púbico raso o suficiente para não perfurar a parede muscular abdominal e continuar a incisão superiormente em direção à caixa torácica e profundamente através dos músculos abdominais. Depois de remover a gordura superficial e cortar cuidadosamente a sífise púbica, use pinças retas para agarrar a bexiga para criar tensão e usar dissecção contundente para separar o tecido circundante da vagina.
Em seguida, corte a base do sistema reprodutivo para remover os tecidos da cavidade corporal. Depois de determinar o tamanho adequado da cânula para o sistema colhido, monte o lado cervical na porção transdutor de força do dispositivo de cannula e monte a extremidade oposta do órgão na porção de micrômetro do dispositivo. Em seguida, aperte ambas as extremidades com suturas.
Para encontrar o comprimento descarregado do tecido montado, primeiro estique o órgão para que a parede não esteja em tensão. Para a vagina, observe as ranhuras na parede vaginal. Para o colo do útero, corte imediatamente abaixo dos pontos de tinta localizados acima e abaixo da marca do colo do útero central.
Use pinças para medir o comprimento do sistema da sutura à sutura e aumentar a pressão do sistema de miógrafo de zero a 10 milímetros de mercúrio em um milímetro de incrementos de mercúrio. A pressão em que o órgão não está mais colapsado pode ser determinada como o maior salto no diâmetro externo a uma determinada pressão. Após o registro da pressão e do diâmetro externo, observe esses dados como o primeiro ponto em que o órgão não está colapsado e zerar a força.
Para encontrar o trecho in vivo experimental, ajuste o órgão ao comprimento in vivo estimado enquanto estiver na pressão descarregada e clique para avaliar os valores de pressão versus força para os valores de pressão que vão desde a pressão descarregada até a pressão máxima. Em seguida, clique em parar e salvar o arquivo. Para pré-condicionamento de diâmetro de pressão, coloque a pressão a zero milímetros de mercúrio, o comprimento até o comprimento experimental in vivo, e o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo.
Execute uma sequência que leva a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima mais a pressão descarregada, segure por 30 segundos e retorne a zero milímetros de mercúrio com um período adicional de 30 segundos de espera. Depois de repetir esta sequência para um total de cinco ciclos, clique em parar e salvar o arquivo. Para o pré-condicionamento do comprimento da força, digite 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada tanto para as pressões de entrada quanto para saída e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo.
Clique em iniciar e ajustar o comprimento para mais 2% de comprimento in vivo e volte para menos 2% a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Repita a extensão axial para um total de cinco ciclos antes de clicar em parar e salvar o arquivo. Para o teste de diâmetro de pressão do comprimento in vivo, clique em iniciar e ajustar o órgão ao comprimento in vivo, ajuste a pressão para zero milímetros de mercúrio e ajuste o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo.
Aumente a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima antes de reduzir a pressão para zero milímetros de mercúrio com um período de ressartura de 20 segundos. Em seguida, repita o teste por cinco ciclos antes de parar o sistema e salvar os dados. Para o teste de comprimento de força de 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada, ajuste a pressão para 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo.
Após o início do clique, estique o órgão para mais 2% do comprimento in vivo e volte para menos 2% do comprimento in vivo a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Em seguida, repita o teste para um total de três ciclos antes de parar o sistema e salvar os dados. Após o último teste, remova o meio de teste KRB e lave o órgão com meio KRB livre de cálcio.
Após a lavagem, incubar o órgão com uma solução KRB fresca sem cálcio complementada com dois EGTA milimôlares por 30 minutos antes de substituir a solução de tratamento por KRB fresco sem cálcio. Na conclusão do teste do tom basal, para pré-condicionamento de diâmetro de pressão, clique no início e defina a pressão a zero milímetros de mercúrio, o comprimento como o comprimento in vivo estimado, e o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo. Comece a executar uma sequência que leva a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima e de volta a zero milímetros de mercúrio.
Repita este processo através de cinco ciclos com um tempo de espera de 30 segundos. Para o pré-condicionamento do comprimento da força, ajuste o órgão ao comprimento in vivo e digite manualmente a pressão descarregada para ambas as pressões. Clique em iniciar e definir o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio e a pressão para 1/3 do máximo.
Estique o órgão até mais 2% e recue até menos 2% de estiramento a 10 micrômetros por segundo e repita o ciclo por um total de cinco vezes. Para testes de diâmetro de pressão, com o órgão a menos 2% do comprimento in vivo experimentalmente determinado e a pressão a zero milímetros de mercúrio, clique em iniciar e aumentar a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima e volte para zero milímetros de mercúrio. Segure os zero milímetros de mercúrio passo por 20 segundos e repita o ciclo cinco vezes.
Para o teste de comprimento de força, ajuste a pressão em uma pressão nominal e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo. Estique o órgão até mais 2% do comprimento in vivo e volte para menos 2% do comprimento in vivo a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Após um total de três ciclos, salve os dados e repita o teste de comprimento de força para 1/3 da pressão máxima, 2/3 da pressão máxima e na pressão máxima.
Para uma análise bem sucedida das propriedades mecânicas dos órgãos reprodutivos femininos, é imperativo explantar os chifres uterinos para a vagina sem defeitos. Dependendo do tipo de órgão, o tamanho da cânula vai variar. A canulação deve ser realizada para que o órgão não possa se mover durante o experimento, mas sem danificar a parede do órgão durante o procedimento.
O sistema de miógrafo de pressão pode ser usado para monitorar vários aspectos do órgão, pois ele passa por testes mecânicos e o sistema de ultrassom pode ser usado para medir a espessura dos órgãos no estado descarregado com e sem tom basal. Após testes mecânicos, o moduli tangente pode ser calculado para as direções circunferenciais e axiais. Tanto o teste de tom basal quanto os testes passivos produzem propriedades mecânicas fundamentais do trato reprodutivo com e sem a contribuição contratil das células musculares lisas.
O dimensionamento entre os órgãos requer alguns ajustes nos protocolos, pois o colo uterino e a vagina experimentam diferentes cargas in vivo. É fundamental realizar a dissecção rapidamente para manter a viabilidade das células musculares lisas, mas cuidadosamente para não perfurar o órgão desejado. Experimentos de ângulo de abertura que medem a cepa residual do órgão podem ser realizados após procedimentos de teste mecânico, bem como vários ensaios histológicos e bioquímicos.
Após seu desenvolvimento e investigação da contribuição basal de células musculares lisas, esta técnica também permite avaliar a resposta contratil máxima do músculo liso do sistema reprodutivo sob cargas fisiologicamente relevantes.
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Visão Geral
Este protocolo investiga as propriedades mecânicas biaxiais dos órgãos reprodutivos, com foco nas contribuições das células musculares lisas e da matriz extracelular passiva. A técnica preserva a geometria do órgão e as interações nativas, permitindo testes sob condições fisiologicamente relevantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biomecânica
- Saúde da Mulher
- Fisiologia Reprodutiva
Contexto
- Compreender as propriedades mecânicas dos órgãos reprodutivos é fundamental para a saúde da mulher.
- Investigar as contribuições das células musculares lisas pode elucidar as patologias reprodutivas.
- Métodos de teste biaxial são comumente utilizados em diversos estudos biológicos.
- Detalhes técnicos são essenciais para medições precisas em estudos de novos órgãos.
Objetivo do Estudo
- Elucidar as propriedades mecânicas do colo do útero e da vagina.
- Isolar os efeitos das células musculares lisas e da matriz extracelular.
- Aprimorar a compreensão da função dos órgãos reprodutivos sob condições fisiológicas.
Métodos Utilizados
- Teste de miógrafo de pressão em vagina e colo do útero de camundongo.
- Uso de meios com e sem cálcio para avaliar contribuições.
- Manutenção da geometria do órgão durante os testes.
- Aplicação de pressão fisiológica e extensões axiais.
Resultados Principais
- Conhecimentos sobre o comportamento mecânico dos órgãos reprodutivos.
- Identificação dos papéis das células musculares lisas e da matriz extracelular.
- Implicações potenciais para a compreensão de patologias reprodutivas.
- Comparação com metodologias semelhantes em estudos de outros órgãos.
Conclusões
- Os testes biaxiais fornecem informações valiosas sobre a saúde da mulher.
- Compreender a mecânica dos órgãos pode orientar abordagens clínicas para problemas reprodutivos.
- É necessário um aperfeiçoamento adicional das técnicas para novos estudos de órgãos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação das propriedades mecânicas biaxiais de órgãos reprodutivos permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos em saúde da mulher, isolando as contribuições do músculo liso e da matriz extracelular. Esta abordagem reforça a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao quantificar o tônus basal e a mecânica passiva sob cargas fisiologicamente relevantes. A metodologia auxilia no alinhamento de biomarcadores translacionais para distúrbios do assoalho pélvico e insuficiência cervical por meio de fenotipagem biomecânica quantitativa e reprodutível.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição do tônus basal como a constrição parcial de células musculares lisas na ausência de estímulo hormonal e neural.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos ao dissociar a atividade das células contráteis da mecânica passiva da matriz, utilizando meios livres de cálcio e suplementados com EGTA.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar alterações induzidas pela matriz extracelular no fenótipo da musculatura lisa que se correlacionam com a perda de força contrátil em patologias reprodutivas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream ao estabelecer o comprimento descarregado e os parâmetros de alongamento in vivo por meio da montagem em micrósio de pressão.
- Saídas Quantitativas: Gera medições de pressão-diâmetro e força-comprimento que permitem a padronização e a reprodutibilidade em ensaios de fenotipagem mecânica.
- Reutilização da Plataforma: Facilita a avaliação escalável dos efeitos de compostos sobre a mecânica dos tecidos por meio de ciclos de pré-condicionamento e rampas escalonadas de pressão/comprimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela alterações fisiopatológicas da MEC associadas ao prolapso de órgãos pélvicos e ao remodelamento prematuro do colo uterino por meio da análise da composição de colágeno e elastina.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao associar alterações na rigidez microestrutural a mudanças no fenótipo do músculo liso e à disfunção contrátil.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de avançar/não avançar ao quantificar como as alterações na rigidez da MEC modulam a atividade do músculo liso e a integridade mecânica em nível de órgão.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra à biologia de descoberta por meio da testagem de hipóteses sobre as interações entre músculo liso e matriz, à triagem por meio de fenotipagem mecânica padronizada e à pesquisa translacional ao permitir continuidade pré-clínica alinhada a biomarcadores para indicações em saúde da mulher.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao medir como o ambiente bioquímico e a distensão mecânica alteram as condições contráteis do músculo liso em estados fisiológicos basais.
- Triagem: Garante prontidão do ensaio por meio de pré-condicionamento pressão-diâmetro com gradiente de 1,5 mmHg/s e ciclagem força-comprimento a uma taxa de 10 µm/s para estabilizar a resposta do tecido.
- Análises: Fornece cálculos de módulos tangentes nas direções circunferencial e axial, permitindo comparação quantitativa das contribuições mecânicas passivas e contráteis ativas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao avaliar como alterações na microestrutura da matriz extracelular afetam o fenótipo do músculo liso e a geração de força em modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de fenotipagem biomecânica aplicável a sistemas de órgãos vasculares, gastrointestinais e reprodutivos sob carregamento biaxial fisiológico.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar o tônus basal do músculo liso das contribuições passivas da MEC utilizando meios modulados por cálcio.
- Valor Operacional: Garante padronização mediante a determinação do comprimento sem carga por meio de sulcos na parede vaginal ou pontos de tinta no colo uterino e detecção do ponto de colapso com pressão zero.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos implicados em patologias reprodutivas impulsionadas por fatores biomecânicos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao quantificar como alterações na composição da MEC (colágeno I/III/V, elastina, GAGs) modificam a rigidez do órgão e a mecanotransdução celular.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em dissecação de tecidos, cânulação e técnicas de sutura para manter a geometria e viabilidade do órgão.
- Depende de instrumentação com micrógrafo de pressão capaz de controle biaxial da pressão (0-10 mmHg) e do comprimento axial (±2% in vivo).
- Requer padronização entre equipes dos protocolos de comprimento sem carga e ciclos de pré-condicionamento (5x diâmetro sob pressão, 5x força-comprimento) para estabelecimento reprodutível da linha de base.
- Envolve considerações de adaptação para escalonamento específico do órgão, devido às diferentes cargas in vivo entre colo do útero e vagina.
- Limitado pelas restrições de viabilidade tecidual, que exigem dissecação rápida para preservar a função das células musculares lisas, evitando ao mesmo tempo danos à parede durante a cânulação.
