Name: Tom basal biaxial e teste passivo do sistema reprodutivo murino usando um Miografo de pressão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a realizar testes biaxiais de tom basal e passivo em órgãos reprodutivos murinos usando um miografo de pressão. Esta técnica preserva a geometria do órgão e permite analisar as contribuições das células musculares lisas e da matriz extracelular.

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O trabalho foi financiado pela concessão do prêmio da carreira de NSF #1751050.

O protocolo fornecido neste artigo apresenta um método para determinar as propriedades mecânicas da vagina Murina e colo do útero. As propriedades mecânicas analisadas neste protocolo incluem as condições de Tom passivo e basal dos órgãos. As condições de Tom passivo e basal são induzidas alterando o ambiente bioquímico em que o órgão está submerso. Para este protocolo, a mídia envolvida no teste basal contém cálcio. Testar a condição basal do Tom permite a isolação da contribuição mecânica da pilha de músculo liso dentr...

A parede vaginal é composta de quatro camadas, o epitélio, o propria do lamina, os muscularis, e o adventitia. O epitélio é composto principalmente de células epiteliais. O própria do lamina tem uma grande quantidade de fibras elásticas e fibrilar do colagénio. Os muscularis também são compostos de fibras de elastina e colágeno, mas tem uma quantidade aumentada de células musculares lisas. A adventícia é composta por elastina, colágeno e fibroblastos, embora em concentrações reduzidas em comparação com as camadas anteriores. As células musculares lisas são de interesse para grupos de pesquisa biomecânica motivados como desempenham um papel na natureza contrátil dos órgãos. Como tal, quantificar a fração da área da célula muscular lisa e a organização é fundamental para a compreensão da função mecânica. As investigações precedentes sugerem que o índice liso do músculo dentro da parede vaginal esteja organizado primeiramente no eixo circunferencial e longitudinal. A análise histológica sugere que a fração da área do músculo liso é de aproximadamente 35% para as secções proximal e distal da parede1.
O colo do útero é uma estrutura altamente colagenosa, que até recentemente, foi pensado para ter o conteúdo mínimodecélulas musculares lisas 2,3. Estudos recentes, no entanto, sugeriram que as células musculares lisas podem ter uma maior abundância e papel no colo do útero4,5. O colo do útero exibe um gradiente de células musculares lisas. O sistema operacional interno contém 50-60% de células musculares lisas, onde o sistema operacional externo contém apenas 10%. Os estudos do rato, entretanto, relatam o cerviz para ser compor de 10-15% pilhas de músculo liso e 85-90% tecido conexivo fibroso sem menção de diferenças regionais6,7,8. Dado que o modelo do rato difere do modelo humano freqüentemente relatado, umas investigações mais adicionais a respeito da cerviz do rato são precisadas.
O objetivo deste protocolo foi elucidar as propriedades mecânicas da vagina e colo uterino murino. Isto foi conseguido usando um dispositivo do miógrafo da pressão que permita a avaliação de propriedades mecânicas nas direções circunferenciais e axiais simultaneamente ao manter interações nativas da pilha-matriz e a geometria do órgão. Os órgãos foram montados em duas cânulas personalizadas e fixadas com seda 6-0 suturas. Os testes de pressão-diâmetro foram realizados em torno do estiramento axial fisiológico estimado para determinar a complacência e a moduli tangente9. Testes de força-comprimento foram conduzidos para confirmar o estiramento axial estimado e para garantir que as propriedades mecânicas fossem quantificadas na faixa fisiológica. O protocolo experimental foi realizado na vagina Murina não-grávida e no colo do útero aos 4-6 meses de idade em estro.
O protocolo é dividido em duas seções principais do teste mecânico: tom básico e teste passivo. Um tom basal é definido como a constrição parcial basal das células musculares lisas, mesmo nas ausências de estimulação local, hormonal e neural externa10. Esta natureza contrátil basal da vagina e colo do útero produz comportamentos mecânicos característicos que são então medidos pelo sistema de miografia de pressão. As propriedades passivas são avaliadas pela remoção do cálcio intercelular que mantém o estado basal de contração, resultando no relaxamento das células musculares lisas. No estado passivo, as fibras de colágeno e elastina fornecem as contribuições dominantes para as características mecânicas dos órgãos.
O modelo murino é usado extensivamente para estudar patologias na saúde reprodutiva das mulheres. O mouse oferece várias vantagens para quantificar as relações evolutivas entre ECM e propriedades mecânicas dentro do sistema reprodutivo11,12,13,14. Estas vantagens incluem ciclos estral curtos e bem caracterizados, custo relativamente baixo, facilidade de manuseio e um tempo gestacional relativamente curto15. Além disso, o genoma de camundongos laboratoriais é bem mapeado e os camundongos geneticamente modificados são ferramentas valiosas para testar hipóteses mecanísticas16,17,18.
Os sistemas de miografia de pressão disponíveis comercialmente são amplamente utilizados para quantificar as respostas mecânicas de vários tecidos e órgãos. Algumas estruturas notáveis analisadas no sistema de miografo de pressão incluem as artérias elásticas19,20,21,22, veias e enxertos vasculares de engenharia tecidual23,24, o esôfago25, e os grandes intestinos26. A tecnologia do miógrafo da pressão permite a avaliação simultânea das propriedades nas direções axiais e circunferenciais ao manter as interações nativas do Cell-ECM e na geometria in vivo. Apesar do uso extensivo de sistemas do miógrafo na mecânica macia do tecido e do órgão, um protocolo que utiliza a tecnologia do miógrafo da pressão não tinha sido desenvolvido previamente para o vagina e a cerviz. Investigações anteriores sobre as propriedades mecânicas da vagina e do colo do útero foram avaliadas uniaxialmente27,28. Estes órgãos, entretanto, experimentam o carregamento multiaxial dentro do corpo29,30, assim quantificando sua resposta mecânica biaxial é importante.
Além disso, o trabalho recente sugere que as células musculares lisas podem desempenhar um papel potencial nas patologias dos tecidos moles5,28,31,32. Isto fornece uma outra atração de utilizar a tecnologia do miógrafo da pressão, porque preserva as interações nativas da pilha-matriz, assim permitindo o delineamento da contribuição que as pilhas de músculo lisas jogam em fisiológico e fisiopatológico Condições. Nisto, nós propor um protocolo para quantificar as propriedades mecânicas multiaxial do vagina e da cerviz o tom básico e as circunstâncias passivas.

<table><tbody><tr><td>Cateter 2F</td><td>Cateter Millar</td><td>SPR-320</td><td>para medir a pressão cervical</td></tr><tr><td>6-0 Sutura</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td>laços de sutura maiores</td></tr><tr><td>CaCl2 (anidro)</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td>Concentração de HBSS: 140 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2-2H20</td><td>Fischer químico</td><td>BDH9224-1KG</td><<td>br/> Concentração de KRB: 3,68 g/L</td></tr><tr><td>Dextrose (D-glicose)</td><td>VWR</td><td>101172-434</td><td>Concentração de HBSS: 1000 mg/mL Concentração de KRB: 19,8 g/L</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>fórceps curvo</td></tr><tr><td>Dumont SS Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11203-25</td><td>fórceps retos</td></tr><tr><td>Eclipse</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>microscópio usado para imagens</td></tr><tr><td>Medidor de vazão</td><td>dinamarquês MyoTechnologies</td>Medidor de vazão <td>161FM</td><td>dentro do aparelho de teste</td></tr><tr><td>Transdutor de força - 110P</td><td>Dinamarquês MyoTechnologies</td><td>100079</td><td>transdutor de força</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>SciJava</td><td>ImageJ1</td><td>usado para medir o volume</td></tr><tr><td>Caixas de instrumentos</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>20830-00</td><td>invólucro para segurar ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>97061-566</td><td>Concentração de HBSS: 400 mg/mL Concentração de KRB: 3,5 g/L</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>G-Biosciences</td><td>71003-454</td><td>Concentração de HBSS: 60 mg/mL</td></tr><tr><td>de MgCl2</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td> Concentração de KRB: 1,14 g/L</td></tr><tr><td>de MgCl2-6H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9244-500G</td><td>Concentração de HBSS: 100 mg/mL</td></tr><tr><td>MgSO4-7H20</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>Concentração de HBSS: 48 mg/mL</td></tr><tr>Programa de <td>6278402</td><td>da Microsoft</td> <td>do Excel Mircosoft</td><td>usado para a planilha</td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anidro dibásico)</td><td>VWR</td><td>97061-588</td><td>Concentração de HBSS: 48 mg/mL Concentração de KRB: 1,44 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td>Concentração de HBSS: 8000 mg/mL Concentração de KRB: 70,1 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>97062-460</td><td>Concentração de HBSS: 350 mg/mL Concentração de KRB: 21,0 g/L</td></tr><tr><td>Sistemas de miógrafo de pressão</td><td>MyoTechnologies dinamarqueses</td><td>110P e 120CP</td><td>Sistema de miógrafo de pressão: prorgram, dispositivo de canulação, e unidade controladora</td></tr><tr><td>Transdutor de pressão</td><td>Dinamarquês MyoTechnologies</td><td>100106</td><td>transdutor de pressão</td></tr><tr><td>Estudante Dumont #5 Fórceps Fine</td><td>Science Tools</td><td>91150-20</td><td>pinça reta</td></tr><tr><td>Estudante Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>micro-tesoura</td></tr><tr><td>Corante de tecido</td><td>Bradley Products</td><td>1101-3</td><td>tinta para medir in vivo estiramento</td></tr><tr><td>Transdutor de ultrassom</td><td>FujiFilm Visual Sonics</td><td>LZ-550</td><td>transdutor de ultrassom usado; 256 elementos, frequência central de 40 MHz</td></tr><tr><td>VEVO2100</td><td>FujiFilm Visual Sonics</td><td>VS-20035</td><td>ultrassom usado para imagens de imagens</td></tr><tr><td>Wagner Tesouras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14069-12</td><td>tesouras maiores</td></tr></tbody></table>

tom basal biaxial e teste passivo do sistema reprodutivo murino usando um miografo de pressão

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

Os órgãos reprodutivos femininos, especificamente a vagina e o colo do útero, são compostos por vários componentes celulares e uma matriz extracelular única (ECM). Células musculares lisas exibem uma função contrátil dentro das paredes vaginal e cervical. Dependendo do ambiente bioquímico e da distensão mecânica das paredes dos órgãos, as células musculares lisas alteram as condições contráctil. A contribuição das células musculares lisas em condições fisiológicas iniciais é classificada como um tom basal. Mais especificamente, um tom basal é a constrição parcial basal das células musculares lisas na ausência de estimulação hormonal e neural. Além disso, o ECM fornece o apoio estrutural para as paredes e as funções do órgão como um reservatório para pistas bioquímicas. Essas pistas bioquímicas são vitais para várias funções de órgãos, como incitar o crescimento e manter a homeostase. A ECM de cada órgão é composta principalmente de fibras colágenas (principalmente colágeno tipos I, III e V), fibras elásticas e glicosaminoglicanos/proteoglicanos. A composição e organização do ECM determinam as propriedades mecânicas de cada órgão. Uma mudança na composição do ECM pode conduzir ao desenvolvimento de patologias reprodutivas, tais como o prolapso pélvico do órgão ou o remodelamento cervical prematuro. Além disso, as alterações na microestrutura e rigidez da ECM podem alterar a atividade e o fenótipo da célula muscular lisa, resultando na perda da força contrátil.
Neste trabalho, os protocolos relatados são usados para avaliar o Tom basal e as propriedades mecânicas passivas da vagina e da cerviz murino nonpregnant em 4-6 meses da idade no estro. Os órgãos foram montados em um miógrafo de pressão comercialmente disponível e os testes do pressão-diâmetro e da força-comprimento foram executados. São incluídos dados de amostra e técnicas de análise de dados para a caracterização mecânica dos órgãos reprodutivos. Essas informações podem ser úteis para a construção de modelos matemáticos e racionalmente projetar intervenções terapêuticas para as patologias de saúde das mulheres.

A análise bem sucedida das propriedades mecânicas dos órgãos reprodutivos femininos depende da dissecção, canulação e teste de órgãos apropriados. É imperativo explante os chifres uterinos para a vagina sem quaisquer defeitos (Figura 1). Dependendo do tipo de órgão, o tamanho da cânula variará (Figura 2). A canulação deve ser feita para que o órgão não se mova durante o experimento, mas também não danifique a parede do órgão durante o procedimento (Figura 3</stro...

Este protocolo utilizou um sistema de miografo de pressão disponível comercialmente para realizar testes miográficos de pressão na vagina e colo do útero murino. Utilizando meios com e sem cálcio, as contribuições do tom básico das pilhas de músculo liso (SMC) e da matriz extracelular passiva (ECM) foram isoladas para os órgãos circunstâncias physiological estimadas.

Tom basal biaxial e teste passivo do sistema reprodutivo murino usando um Miografo de pressão

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). ...

Este protocolo investiga as propriedades mecânicas biaxiais dos órgãos reprodutivos que elucidam a contribuição das células musculares lisas e da matriz passiva. Esta técnica mantém a geometria dos órgãos e a célula muscular lisa nativa para interações matriciais permitindo a sujeição do órgão a uma gama fisiológica de pressões e extensões axiais. Investigar a função biaxial do órgão sob cargas fisiologicamente relevantes pode auxiliar na melhor compreensão da etiologia das patologias reprodutivas.Testar biaxalmente o colo uterino e a vagina fornece uma visão dos campos da saúde da mulher e da biomecânica. Métodos semelhantes são utilizados para estudar vasos sanguíneos, esôfago e intestinos grossos. Ao trabalhar com um novo órgão, pode levar tempo para finalizar os detalhes técnicos, como como melhor suturar o tecido ou como determinar o comprimento descarregado.Para coletar o sistema reprodutivo do animal experimental, coloque o rato em uma almofada absorvente sob um microscópio dissecando e use pinças angulares e tesouras para levantar a pele ao redor do abdômen. Faça uma incisão inicial na base do abdômen acima do osso púbico raso o suficiente para não perfurar a parede muscular abdominal e continuar a incisão superiormente em direção à caixa torácica e profundamente através dos músculos abdominais. Depois de remover a gordura superficial e cortar cuidadosamente a sífise púbica, use pinças retas para agarrar a bexiga para criar tensão e usar dissecção contundente para separar o tecido circundante da vagina.Em seguida, corte a base do sistema reprodutivo para remover os tecidos da cavidade corporal. Depois de determinar o tamanho adequado da cânula para o sistema colhido, monte o lado cervical na porção transdutor de força do dispositivo de cannula e monte a extremidade oposta do órgão na porção de micrômetro do dispositivo. Em seguida, aperte ambas as extremidades com suturas.Para encontrar o comprimento descarregado do tecido montado, primeiro estique o órgão para que a parede não esteja em tensão. Para a vagina, observe as ranhuras na parede vaginal. Para o colo do útero, corte imediatamente abaixo dos pontos de tinta localizados acima e abaixo da marca do colo do útero central.Use pinças para medir o comprimento do sistema da sutura à sutura e aumentar a pressão do sistema de miógrafo de zero a 10 milímetros de mercúrio em um milímetro de incrementos de mercúrio. A pressão em que o órgão não está mais colapsado pode ser determinada como o maior salto no diâmetro externo a uma determinada pressão. Após o registro da pressão e do diâmetro externo, observe esses dados como o primeiro ponto em que o órgão não está colapsado e zerar a força.Para encontrar o trecho in vivo experimental, ajuste o órgão ao comprimento in vivo estimado enquanto estiver na pressão descarregada e clique para avaliar os valores de pressão versus força para os valores de pressão que vão desde a pressão descarregada até a pressão máxima. Em seguida, clique em parar e salvar o arquivo. Para pré-condicionamento de diâmetro de pressão, coloque a pressão a zero milímetros de mercúrio, o comprimento até o comprimento experimental in vivo, e o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo.Execute uma sequência que leva a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima mais a pressão descarregada, segure por 30 segundos e retorne a zero milímetros de mercúrio com um período adicional de 30 segundos de espera. Depois de repetir esta sequência para um total de cinco ciclos, clique em parar e salvar o arquivo. Para o pré-condicionamento do comprimento da força, digite 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada tanto para as pressões de entrada quanto para saída e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo.Clique em iniciar e ajustar o comprimento para mais 2% de comprimento in vivo e volte para menos 2% a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Repita a extensão axial para um total de cinco ciclos antes de clicar em parar e salvar o arquivo. Para o teste de diâmetro de pressão do comprimento in vivo, clique em iniciar e ajustar o órgão ao comprimento in vivo, ajuste a pressão para zero milímetros de mercúrio e ajuste o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo.Aumente a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima antes de reduzir a pressão para zero milímetros de mercúrio com um período de ressartura de 20 segundos. Em seguida, repita o teste por cinco ciclos antes de parar o sistema e salvar os dados. Para o teste de comprimento de força de 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada, ajuste a pressão para 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo.Após o início do clique, estique o órgão para mais 2% do comprimento in vivo e volte para menos 2% do comprimento in vivo a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Em seguida, repita o teste para um total de três ciclos antes de parar o sistema e salvar os dados. Após o último teste, remova o meio de teste KRB e lave o órgão com meio KRB livre de cálcio.Após a lavagem, incubar o órgão com uma solução KRB fresca sem cálcio complementada com dois EGTA milimôlares por 30 minutos antes de substituir a solução de tratamento por KRB fresco sem cálcio. Na conclusão do teste do tom basal, para pré-condicionamento de diâmetro de pressão, clique no início e defina a pressão a zero milímetros de mercúrio, o comprimento como o comprimento in vivo estimado, e o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo. Comece a executar uma sequência que leva a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima e de volta a zero milímetros de mercúrio.Repita este processo através de cinco ciclos com um tempo de espera de 30 segundos. Para o pré-condicionamento do comprimento da força, ajuste o órgão ao comprimento in vivo e digite manualmente a pressão descarregada para ambas as pressões. Clique em iniciar e definir o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio e a pressão para 1/3 do máximo.Estique o órgão até mais 2% e recue até menos 2% de estiramento a 10 micrômetros por segundo e repita o ciclo por um total de cinco vezes. Para testes de diâmetro de pressão, com o órgão a menos 2% do comprimento in vivo experimentalmente determinado e a pressão a zero milímetros de mercúrio, clique em iniciar e aumentar a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima e volte para zero milímetros de mercúrio. Segure os zero milímetros de mercúrio passo por 20 segundos e repita o ciclo cinco vezes.Para o teste de comprimento de força, ajuste a pressão em uma pressão nominal e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo. Estique o órgão até mais 2% do comprimento in vivo e volte para menos 2% do comprimento in vivo a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Após um total de três ciclos, salve os dados e repita o teste de comprimento de força para 1/3 da pressão máxima, 2/3 da pressão máxima e na pressão máxima.Para uma análise bem sucedida das propriedades mecânicas dos órgãos reprodutivos femininos, é imperativo explantar os chifres uterinos para a vagina sem defeitos. Dependendo do tipo de órgão, o tamanho da cânula vai variar. A canulação deve ser realizada para que o órgão não possa se mover durante o experimento, mas sem danificar a parede do órgão durante o procedimento.O sistema de miógrafo de pressão pode ser usado para monitorar vários aspectos do órgão, pois ele passa por testes mecânicos e o sistema de ultrassom pode ser usado para medir a espessura dos órgãos no estado descarregado com e sem tom basal. Após testes mecânicos, o moduli tangente pode ser calculado para as direções circunferenciais e axiais. Tanto o teste de tom basal quanto os testes passivos produzem propriedades mecânicas fundamentais do trato reprodutivo com e sem a contribuição contratil das células musculares lisas.O dimensionamento entre os órgãos requer alguns ajustes nos protocolos, pois o colo uterino e a vagina experimentam diferentes cargas in vivo. É fundamental realizar a dissecção rapidamente para manter a viabilidade das células musculares lisas, mas cuidadosamente para não perfurar o órgão desejado. Experimentos de ângulo de abertura que medem a cepa residual do órgão podem ser realizados após procedimentos de teste mecânico, bem como vários ensaios histológicos e bioquímicos.Após seu desenvolvimento e investigação da contribuição basal de células musculares lisas, esta técnica também permite avaliar a resposta contratil máxima do músculo liso do sistema reprodutivo sob cargas fisiologicamente relevantes.

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