Name: Reação aperfeiçoada de Griess para a determinação UV-VIS e nu-olho do Primaquine anti-malarial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda o método colorimétrico de Griess para detecção rápida de primaquina em urina e soro humano. Esta técnica simples oferece alternativa econômica ao HPLC tradicional para estudos farmacocinéticos.

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Os autores reconhecem a concessão do start-up da Universidade de Guangzhou da medicina chinesa e do projeto de treinamento da pesquisa científica da juventude de GZUCM (2019QNPY06). Nós igualmente reconhecemos o centro médico da pesquisa de Lingnan da Universidade de Guangzhou da medicina chinesa para o apoio em facilidades.

1. síntese de AZOs coloridos
<ol><li>Em um balão de fundo redondo de 25 mL (RBF), dissolva anilina (0,1 mmol) e bisfosfato de primaquina (45,5 mg, 0,1 mmol) em 10 mL de solução de H3po4 (5% v/v). Põr o RBF sobre um banho de gelo, adicione uma barra do stir com o tamanho apropriado na solução, e põr o RBF sobre uma placa do stir. Nota: Para a síntese de azo 3G (Figura 2), utilizar 0,2 mmol de primaquina bisfosfato.</li>
	<li>Dissolver NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) em 1 ml de água arrefecida e, em seguida, adicionar à mistura de reacção Dropwise. Retire o banho de gelo e mantenha a mistura de reacção agitada à temperatura ambiente.</li>
	<li>Monitore a reação com uma placa de cromatografia em camada fina (TLC) revestida com gel de sílica. Use uma mistura de diclorometano (DCM)/metanol (MeOH) (Vol/Vol = 5:1) como o eluente para TLC. O produto azo exibe manchas coloridas na placa TLC, que é fácil de distinguir por olhos nus. Pare a reação quando os pontos de PMQ desaparecem no TLC.</li>
	<li>Ajuste a mistura de reacção ao pH > 10 por NaOH (2 M) num banho de gelo. Use um funil de separação de 50 mL para extrair a mistura 3 vezes com 20 mL de acetato de etilo para cada um, combine e concentre a fase orgânica vácuo usando um evaporador rotativo. Nota: Antes da extração, ajuste o valor de pH das soluções de reação acima de 10. Isso pode manter a amina primária como sua forma não-ionizada, facilitando assim a extração.</li>
	<li>Purificar os resíduos por cromatografia flash com gel de sílica de fase reversa pressão normal, usando MeOH/H2o como o eluente. Seque a solução do produto através da liofilização para dar produtos azo desejados. Nota: A mesma reação também pode ser realizada em soluções de HCl diluídas (0,2 M).</li>
</ol>2. medições de UV-VIS e cálculo teórico
<ol><li>Dissolver azo puro (50 μM) em água destilada ou em 5% H3po4 solução (pH 1,1), respectivamente. Grave os espectros de absorção UV-VIS (250-700 nm) num espectrofotômetro à temperatura ambiente (25 ° c). Exporte os dados como arquivos. xls/. xlsx para análise posterior.</li>
	<li>
Realize todos os cálculos teóricos para o próprio PMQ e produtos azo usando o programa Gaussian 16. Use a teoria funcional da densidade dependente do tempo (TD-DFT) com um jogo da base 6-31G. Inclua efeitos do solvente pelo formalismo polarizadas do modelo do continuum (PCM) usando a água.
	<ol>
<li>Use software (por exemplo, ChemDraw Office) para desenhar as estruturas e, em seguida, salvar a estrutura como um arquivo de entrada Gaussian (. gif).</li>
		<li>Abra o arquivo GIF com Gauss View e clique no botão calcular. Selecione configuração de cálculo Gaussian, opt + freqe Ground State-DFT-B3LYP-6-31G; em seguida, clique em Submit. A otimização de geometria gerará um arquivo. log.</li>
		<li>Seguindo o procedimento acima, use Gauss View para abrir este arquivo de log. Clique em calcular-configuração de cálculo Gaussian e selecione energia e td-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-singlet somente. Em seguida, submeter. O cálculo de energia gerará outro arquivo de log e um arquivo de cubo.</li>
		<li>Use Gauss View para abrir o arquivo de log a partir do cálculo de energia. Clique em Results-UV/VIS para ver a absorção prevista.</li>
		<li>Use Gauss View para abrir o arquivo de cubo. Clique em resultados e selecione superfície e contornos-ações de superfície e nova superfície para ver as órbitas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compare os resultados da medida experimental e do cálculo Gaussian. Calcule o erro percentual entre os valores calculados e medidos, de acordo com a equação a seguir.               Erro = | (WMax Cal.-wMaxexper.) /WMaxexper. | × 100% onde WMax Cal. representa o comprimento de onda máximo da absorvância do cálculo teórico e do exper de WMax . representa o comprimento de onda do resultado experimental.</li>
</ol>3. determinação do PMQ
<ol><li>Medição de pmq usando uma placa 96-well (Figura 5)
	<ol>
<li>Dissolver 4-methoxyaniline em 0,2 M HCl para uma solução de anilina de 200 mM, R1. Dissolver o nitrito de sódio em água destilada para obter uma solução de 5 mM, R2. Mantenha todas as soluções na geladeira a 4 ° c antes de usar.</li>
		<li>Adicione 100 μL de R1 em uma placa 96-well, e adicione 50 μL do PMQ que contem a amostra na placa para misturar com o R1. Em seguida, adicione 50 μL de R2 na placa. Misture as soluções através de pipetagem repetida.</li>
		<li>Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, grave a absorvância UV-Vis a 504 nm. Repita 3x para cada teste.  O produto do azo é estável com exposição clara do quarto; Não é necessário manter a placa a obscuridade.</li>
		<li>Exporte os dados como arquivos. xls/. xlsx para análise posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Curva de calibração para medição direta de PMQ em amostra de urina
	<ol>
<li>Prepare soluções de PMQ usando urina sintética com concentrações de PMQ em 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM, respectivamente.</li>
		<li>Adicione 100 μL de R1 em uma placa 96-well, e adicione 50 μL da solução da urina de PMQ para misturar com o R1. Em seguida, adicione 50 μL de R2 à mistura acima. Misture as soluções através de pipetagem repetida. Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, grave a absorvância UV-Vis a 504 nm.</li>
		<li>Gerar uma curva de calibração com base na absorvência I504 e concentrações de pmq. Use os valores dos poços sem o PMQ como um espaço em branco e subtraia os valores em branco de todos os testes antes do processamento de dados.</li>
		<li>Realize um ajuste linear para gerar as equações lineares como y = ax + b, onde y é a intensidade da absorvência em 504 nm, X é a concentração de pmq, a é a inclinação, e b é o intercepto y da linha linear.</li>
	</ol></li>
	<li>Curva da calibração para a medida direta de PMQ em uma amostra humana do soro
	<ol>
<li>Prepare soluções de PMQ usando soro humano com concentrações de PMQ em 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM respectivamente.</li>
		<li>Adicione 100 μL de R1 em uma placa 96-well e adicione 50 μL da solução do soro de PMQ para misturar com o R1. Adicione 50 μL de R2 à mistura acima e misture as soluções por pipetagem repetida. Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, grave a absorvância UV-Vis a 504 nm. Exporte os dados como arquivo. xls/. xlsx para análise posterior.</li>
		<li>Gerar uma curva de calibração com base na absorvência I504 e concentrações de pmq. Use os valores dos poços sem o PMQ como um espaço em branco e subtraia os valores em branco de todos os testes antes do processamento de dados.</li>
		<li>Realize um ajuste linear para gerar as equações lineares como y = ax + b, onde y é a intensidade da absorvência em 504 nm, X é a concentração de pmq, a é a inclinação, e b é o intercepto y da linha linear.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de PMQ do soro
	<ol>
<li>Adicione uma certa quantidade de PMQ no soro humano para simular o soro contendo PMQ. Para a extração de PMQ, adicione 6 mL de mistura de acetato de etila/hexano (7:1 v/v) em 2 mL de soro contendo PMQ em um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de solução de hidróxido de sódio (2 M) ao sistema de extracção. Agitar violentamente o tubo usando um misturador Vortex para 30 s. colete a camada orgânica e concentre-a usando um evaporador rotativo vácuo.</li>
		<li>Redissolva o resíduo com 200 μL de água destilada e remova os componentes lipídicos insolúveis por filtração através de uma membrana em forma de disco com tamanho de poros de 220 nm. Use a solução final para o teste.</li>
	</ol></li>
	<li>Determine o PMQ do soro com extração
	<ol>
<li>Siga as etapas 3,2 ou 3,3 para gerar a curva de calibração para PMQ em água destilada. Extraia o pmq de soros contendo pmq de acordo com a etapa 3,4.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de R1 e 50 μL de solução de PMQ em uma placa de 96 poços. Adicione 50 μL de R2 à mistura acima, e misture as soluções por pipetagem repetida.</li>
		<li>Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 min e grave a absorvância UV-Vis a 504 nm. Use os poços com R1 e R2 mas sem PMQ como controles. Exporte os dados como arquivos. xls/. xlsx para análise posterior.</li>
		<li>Subtrair os valores de controle dos valores de absorbância I504 para cada teste e, em seguida, use o resultado para cálculos de concentração de acordo com a equação do forro da curva de calibração. Nota: O limite de detecção (LOD) para PMQ em todos os casos pode ser calculado de acordo com um método padrão22. O cálculo baseou-se na função de calibração: LOD = 3,3 × SD/b, onde SD é o desvio padrão do espaço em branco e b é a inclinação da linha de regressão</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+in+vivax+malaria%3A+an+update+and+review+on+management+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues.</a> Malar Journal. 10, 351(2011).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Artemisinin-Piperaquine+Mass+Drug+Administration+With+or+Without+Primaquine+Dramatically+Reduces+Malaria+in+a+Highly+Endemic+Region+of+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa.</a> Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).</li>
<li>Pavic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+hybrids+as+promising+antimycobacterial+and+antimalarial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents.</a> European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).</li>
<li>McQueen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+cellular+localization+of+a+fluorescent+probe+of+the+antimalarial+8-aminoquinoline+primaquine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).</li>
<li>Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine%3A+the+risks+and+the+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Primaquine: the risks and the benefits.</a> Malaria Journal. 13 (1), 418(2014).</li>
<li>Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+primaquine-induced+haemolysis+in+G6PD+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Beutler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective.</a> Blood. 111 (1), 16-24 (2008).</li>
<li>Endoh, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+determination+of+pamaquine%2C+primaquine+and+carboxy+primaquine+in+calf+plasma+using+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).</li>
<li>Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+determination+of+primaquine+and+carboxyprimaquine+concentrations+in+plasma+and+blood+cells+in+Plasmodium+vivax+malaria+cases+following+chronic+dosage+with+primaquine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Applications%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).</li>
<li>Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantitation+of+chloroquine+and+primaquine+by+UPLC-DAD+and+comparison+with+a+HPLC-DAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method.</a> Malaria Journal. 14, 29(2015).</li>
<li>Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+illicit+drugs+in+human+urine+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).</li>
<li>Erni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+high-performance+liquid+chromatography+in+the+pharmaceutical+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry.</a> Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nitrite+and+nitrate+in+biological+fluids+by+assays+based+on+the+Griess+reaction%3A+Appraisal+of+the+Griess+reaction+in+the+l-arginine%2Fnitric+oxide+area+of+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research.</a> Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).</li>
<li>Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+a+known+gelator+scaffold+for+nitrite+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection.</a> Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).</li>
<li>Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+with+pendant+diazo-coupling+functionality+for+colorimetric+detection+of+nitrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).</li>
<li>Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Griess+reaction-based+paper+strip+for+colorimetric%2Ffluorescent%2FSERS+triple+sensing+of+nitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+colorimetric+detection+of+hydroxyl+radicals+based+on+a+modified+Griess+test%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test.</a> Talanta. 195, 152-157 (2019).</li>
<li>Pang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo-responsive+macroscopic+switch+constructed+using+a+chiral+azo-calix%5B4%5Darene+functionalized+silicon+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface.</a> Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).</li>
<li>Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+naked-eye+ratiometric+and+colorimetric+receptor+for+anions+based+on+azo+dye+featuring+with+benzimidazole+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit.</a> Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Liu, F., Lou, J., Hristov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray+responsive+nanoparticles+with+triggered+release+of+nitrite%2C+a+precursor+of+reactive+nitrogen+species%2C+for+enhanced+cancer+radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization.</a> Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+Griess+reaction+on+the+important+anti-malarial+drug+primaquine+and+its+application+for+drug+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).</li>
<li>Shrivastava, A., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+determination+of+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation+of+the+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Chronicles+of+Young+Scientists%22%5BJournal%5D)">Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods.</a> Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Nós descrevemos um método colorimétrico para a quantificação conveniente de PMQ. É potencialmente o método de corrente mais simples e rentável. Mais importante, este método oferece permite a medição de PMQ com base no olho nu sem usar nenhum equipamento.
A reação aperfeiçoada de Griess para a deteção de PMQ pode gerar um azo da cor vermelha com uma absorção máxima em 504 nanômetro. A influência potencial da absorção UV-VIS de biomoléculas endógenas é limitada, fazendo assim o método prometedor...

O pmq é uma das mais importantes drogas antimaláricas, ele funciona não apenas como um schizontocida tecidual para prevenir a recidiva, mas também como um gametocitocide para interromper a transmissão da doença1,2,3,4. A hemólise intravascular é um dos efeitos colaterais relacionados ao PMQ, que se torna extremamente grave naqueles deficientes em G6PD. Sabe-se que a desordem genética de G6PD é distribuída no mundo inteiro com uma freqüência do gene entre 3-30% em áreas endêmicas da malária. A gravidade da fraqueza do pmq depende do grau de deficiência de G6PD, bem como da dose e da duração da exposição ao pmq5,6. Para reduzir o risco, a OMS recomendou uma dose única baixa (0,25 mg base/kg) de PMQ para o tratamento da malária. No entanto, isso ainda é desafiado pelas variações na sensibilidade do fármaco do paciente5,7. A monitorização da dose é necessária para avaliar a farmacocinética após a administração de PMQ, que pode efetuar o ajuste posológico para um tratamento bem-sucedido com toxicidade limitada.
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é a técnica mais utilizada para a determinação clínica do PMQ. Endoh et al. relataram um sistema de HPLC com detector de UV para quantificação sérica de PMQ usando uma coluna de gel de polímero C-188. Em seu sistema, as proteínas do soro foram precipitadas primeiramente com acetonitrile, e então o PMQ no sobrenadante foi separado para a HPLC. A curva de calibração foi linear sobre a faixa de concentração de 0,01-1,0 μg/mL8. Outro método baseado em uma HPLC de fase reversa com detecção de UV a 254 nm foi relatado para a quantificação de PMQ e seus principais metabólitos9. A curva de calibração para PMQ foi linear na faixa entre 0,025-100 μg/mL. Uma extração líquida-líquida adicional com hexano misto e acetato de etila como fase orgânica foi utilizada para a separação do PMQ com recuperação percentual alcançada para 89%9. Mais recentemente, Miranda et al. desenvolveram um método UPLC com detecção de UV a 260 nm para análise de PMQ em formulações de comprimidos com limite de detecção a 3 μg/mL10.
Embora os métodos da HPLC apresentem a sensibilidade prometedora na determinação da droga e a sensibilidade pode mais ser melhorada se o HPLC é equipado com um espectrómetro maciço, há ainda algumas desvantagens. As medidas diretas da droga em líquidos biológicos são geralmente inacessíveis pela HPLC, desde que muitas biomoléculas podem extremamente influenciar a análise. Extrações adicionais são necessárias para remover moléculas endógenas antes daanálise de HPLC11,12. Além disso, a deteção de PMQ por um detector HPLC-UV é executada tipicamente em seu comprimento de onda máximo da absorção (260 nanômetro).; no entanto, existem muitas moléculas endógenas em fluidos biológicos com uma forte absorvência a 260 nm (por exemplo, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos e pigmentos urocromo), interferindo assim com a detecção de UV do PMQ. Há a necessidade de desenvolver métodos simples e rentáveis para a determinação do PMQ com sensibilidade e seletividade razoáveis.
A reação de Griess foi apresentada pela primeira vez em 1879 como um teste colorimétrico para a detecção de nitrito13,14,15,16. Recentemente, esta reação tem sido extensivamente explorada para detectar não só nitrito, mas também outras moléculas biologicamente relevantes17,18,19,20. Nós temos relatado previamente o primeiro estudo sistemático de uma reação inesperada de Griess com PMQ (Figura 1). Neste sistema, o pmq é capaz de formar e coloridos quando acoplado com anilinas substituídas na presença de íons nitrito condições ácidas. Descobrimos ainda que a cor dos e variou de amarelo a azul ao aumentar o efeito de doação de elétrons do substituente nas anilinas21. Um método colorimétrico baseado na absorção UV-VIS para a quantificação de PMQ foi desenvolvido com a reação aperfeiçoada entre o 4-methoxyaniline e o PMQ. Este método demonstrou grande potencial para detecção sensível e seletiva de PMQ em fluidos biorelevantes. Aqui, pretendemos descrever os procedimentos detalhados para a determinação do PMQ com base nessa estratégia colorimétrica.

<table><tbody><tr><td>4-Metoxianilina</td><td>Aladdin</td><td>K1709027</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dimetoxianilina</td><td>Heowns</td><td>10154207</td><td></td></tr><tr><td>3,4-Dimetoxianilina</td><td>Bidepharm</td><td>BD21914</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilanilina</td><td>Adamas-beta</td><td>P1414526</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroanilina</td><td>Macklin</td><td>C10191447</td><td></td></tr><tr><td>96-poços, Flat Botton</td><td>Labserv</td><td></td><td></td>310109008</tr><tr><td>Gaussian@16 software</td><td>Gaussian, Inc</td><td></td><td>Versão: x86-64 habilitado para SSE4_2 / Linux</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>GCRF</td><td>20180902</td><td></td></tr><tr><td>esboço de Marvin (software)</td> <td>Edição gratuita CHEMAXON</td><td></td><td>: 15.6.29</td></tr><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>Macklin</td><td>C10112815</td><td></td></tr><tr><td>Primaquina bisifosfato</td><td>3A Produtos Químicos</td><td></td><td></td>Nitrito de</tr><tr><td>sódio</td> CEBK200054 <td>Alfa Aesar</td><td>5006K18R</td><td></td></tr><tr><td>Sulfonamidas</td><td>TCI (shanghai)</td> <td>GCPLO-BP</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX Leitor de placas</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>fornecido com o software SkanIt 4.1</td></tr></tbody></table>

reação aperfeiçoada de griess para a determinação uv-vis e nu-olho do primaquine anti-malarial

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

A primaquina (PMQ), uma importante droga antimalarial, tem sido recomendada pela Organização Mundial de saúde (OMS) para o tratamento de infecções que ameaçam a vida causadas por P. vivax e ovale. No entanto, o PMQ tem efeitos adversos indesejados que levam à hemólise aguda em pacientes com deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD). Há uma necessidade de desenvolver métodos simples e confiáveis para a determinação do PMQ com o objetivo de monitoramento de dosagem. No início de 2019, temos relatado uma abordagem baseada em UV-VIS e olho nu para quantificação colorimétrica PMQ. A detecção foi baseada em uma reação de Griess-like entre o PMQ e as anilinas, que podem gerar produtos azo coloridos. O limite de detecção para a medição direta de PMQ em urina sintética está na faixa de nanomolar. Além disso, este método mostrou o grande potencial para a quantificação de PMQ das amostras humanas do soro em concentrações clìnica relevantes. Neste protocolo, descreveremos os detalhes técnicos sobre as sínteses e caracterização de produtos azo coloridos, a preparação do reagente e os procedimentos para determinação do PMQ.

Para otimizar as condições de reação (Figura 2), várias anilinas foram usadas para o casal com pmq através da reação de Griess. Nós alcançamos uma série de e com cores diferentes. Verificou-se que anilinas com um elétron doar substituente pode causar uma mudança de vermelho no espectro de absorção UV-VIS. Os cálculos teóricos foram realizados por meio da teoria funcional da densidade dependente do tempo (TD-DFT). Conforme apresentado na Figura 2a, o resultado do...

Este protocolo descreve um método colorimétrico novo para a deteção antimaláricos do primaquina (pmq) em urinas sintéticos e em serums humanos.

Reação aperfeiçoada de Griess para a determinação UV-VIS e nu-olho do Primaquine anti-malarial

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

Primaquine é uma conhecida droga antimalária. A determinação da primaquina em fluidos biológicos é frequentemente necessária para avaliar a farmacocinética. Atualmente, as principais técnicas para a determinação primaquine são baseadas no HPLC.Os procedimentos do HPLC podem ser bastante complicados e demorados. Portanto, este método oferece uma maneira simples de detecção rápida de Primaquine. Este método Griess é potencialmente a maneira mais simples e econômica para a quantificação primaquine.Além disso, este método pode oferecer possibilidades de detecção de Primaquine a olho nu sem a necessidade de qualquer equipamento. Além de amostras de soro e urina, este método também poderia ser usado para determinar quantitativamente primaquina em formulações farmacêuticas, por exemplo, a determinação de Primaquine em comprimidos para o controle de qualidade de fabricação. Demonstrando o procedimento estarão a Srta. Wu Yalan e Wu Shengjun, duas alunas de pós-graduação do meu laboratório.Comece dissolvendo 0,1 mililitros de anilina e bifosfato primaquine em 10 mililitros de solução de ácido fosfórico de 5% em um frasco de fundo marrom de 25 mililitros. Coloque o frasco em um banho de gelo,

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Research

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Medicine

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Este vídeo demonstra um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo envolvendo eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum marcados e opsonizados por monócitos. A citometria de fluxo identifica fluorescência em monócitos, confirmando a identificação bem-sucedida de eritrócitos opsonizados por meio de fagocitose.

Um ensaio para quantificar a fagocitose mediada por anticorpos de eritrócitos infectados por parasitas

O vídeo demonstra um ensaio baseado em células para detectar a imunoglobulina G anti-aquaporina-4 usando um biochip contendo células não transfectadas e células transfectadas que expressam aquaporina-4. Este método tem aplicações no diagnóstico de distúrbios do espectro da neuromielite óptica, confirmados por forte fluorescência verde no biochip.

Um ensaio para detectar imunoglobulina G anti-aquaporina-4 sérica

Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Expressão de proteínas da malária em sistemas baseados em células permanece um desafio. Nós demonstramos dois sistemas de célula livre expressão de passo e um passo IVT (em tradução vitro) para expressar proteínas recombinantes rhoptry malária a partir de células HeLa. Nós usamos um sistema de purificação baseado afinidade Ni-resina para purificar as proteínas rhoptry.

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Reagentes de detecção robustos são cada vez mais necessários para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico da malária. Uma sonda de irídio (III) foi projetada para emitir sinal luminescente de longa duração na presença de um biomarcador de proteína da malária rico em histidina. A detecção da proteína em solução ou imobilizada em uma partícula magnética oferece flexibilidade na aplicação.

Iridium (III) luminescentes Sonda para detecção da proteína maláricos Biomarker proteína rica em histidina-II

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Neste manuscrito, são apresentados métodos de oxidação periodato e reticulação de glutaraldeído para imobilização covalente de anticorpos em discos de papel. A atividade de ligação dos anticorpos imobilizados foi avaliada. Com base nesses resultados, um método de reticulação de glutaraldeído foi usado para desenvolver um novo imunoensaio baseado em papel para detecção de imunoglobulina G (IgG).

A ligação covalente de anticorpos para celulose discos de papel e suas aplicações em visível a olho nu colorimétricos imunoensaios

Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de Plasmodium falciparum em infectados aquosas glóbulos vermelhos usando um espectrômetro infravermelho de reflexão total atenuada e análise multivariada de dados.

Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

Descrevemos uma abordagem de molécula única para medições de afinidade antígeno-anticorpos usando fotometria em massa (MP). O protocolo baseado em MP é rápido, preciso, usa uma quantidade muito pequena de material, e não requer modificação de proteína.

Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Este protocolo descreve um ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche para detectar esporozoítos de glândulas salivares em mosquitos. Usando anticorpos monoclonais facilmente disponíveis, o método permite a detecção econômica e de alto rendimento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. O método é adequado para pesquisas de transmissão da malária, incluindo pesquisas vetoriais.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

Aprenda o método colorimétrico de Griess para detecção rápida de primaquina em urina e soro humano. Esta técnica simples oferece alternativa econômica ao HPLC tradicional para estudos farmacocinéticos.

Reação aperfeiçoada de Griess para a determinação UV-VIS e nu-olho do Primaquine anti-malarial

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