Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

Os tecidos utilizados para a imunohistoquímica e para histopatologia diagnóstica são rotineiramente fixados em formalina tampão de fosfato de 10%. A detecção de antígeno do vírus da raiva no tecido cerebral que foi fixado em formalina apresenta um desafio único, e o teste de IHC foi encontrado como um método sensível e específico para detecção de antígenos do vírus da raiva. A principal vantagem da biópsia ou outros métodos de detecção é que os antígenos podem ser detectados em relação à morfologia tecidual e celular.

Com o IHC, a localização do antígeno da raiva nos tecidos cerebrais e não cerebrais, fornece informações adicionais que não poderiam ser obtidas através de seções rotineiras de hematolina e eosina. O teste de diagnóstico da raiva é importante para o início da profilaxia pós-exposição em humanos expostos ao vírus da raiva. IHC é um dos ensaios mais comumente realizados em tecidos fixos de formalina.

Com anticorpos específicos, pode ser usado para a detecção de seus respectivos patógenos. Para iniciar este procedimento, coloque de três a cinco milímetros de tecido cerebral, coletado após a necropsia, em uma solução de formalina 10% tamponada por 24 a 72 horas. Regissore o peso aproximado do tecido, o tipo de tecido e o volume de formalina.

Coloque os tecidos em 70% de etanol para maior armazenamento de tecido após a fixação da formalina e antes do processamento. Após a fixação do espécime, disseque o tecido para incluir as áreas cerebrais importantes, como seções transversais do tronco cerebral, do cerebelo ou do hipocampo. Cada um, cortado para uma espessura entre três e cinco milímetros.

Coloque os tecidos em fitas de processamento. Processe as fitas de tecido para infiltração de cera de parafina. Incorpore-os em blocos de parafina e seque-os em um microtome.

Primeiro configure o prato de coloração conforme descrito na Figura 1 do protocolo de texto. Encha cada prato com 250 mililitros da solução preparada. Para preparar a solução de estoque de substrato AEC, use uma pipeta de vidro para dissolver um comprimido de 20 miligramas de AEC em 5 mililitros de N, N-Dimethylformamida.

Para preparar a solução de estoque protease, dissolva 7 miligramas da protease em 200 mililitros de PBS. Para preparar o tampão de lavagem, adicione 100 mililitros de Tween 80 a 990 mililitros de PBS, e misture bem para formar uma solução homogênea de PBT-T. Usando um microtome, faça uma seção de 5 micrômetros de parafina.

Carregue a seção em um banho de água a 38 graus Celsius e colete-a em lâminas de vidro. Rotule os slides com uma caneta resistente ao reagente. Coloque os slides sobre uma bandeja e derreta em um forno a 55 a 60 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, retire os slides do forno e desparafina-os imediatamente, usando 3 enxágues consecutivos de xileno de 5 minutos cada. Depois disso, reidratar as seções no slide por imersões sequenciais na diminuição das diluições de etanol para água desionizada, conforme descrito no protocolo de texto. Trate os slides com a protease por 30 minutos para recuperação de antígeno proteolítico, depois enxágue os slides em PBS-T por 10 minutos e trate-os com peróxido de hidrogênio de 3% por 10 minutos.

Depois disso, lave os slides novamente com PBS-T por 10 minutos. Para começar, remova um slide do buffer, certificando-se de segurar apenas um slide de cada vez, enquanto os outros permanecem submersos, e use uma toalha de papel para apagar o excesso de tampão ao redor da seção de tecido. Coloque os slides em uma câmara de umidade e incubar com soro de cabra normal à temperatura ambiente por 15 minutos.

Em seguida, incubar os slides na câmara de umidade com o anticorpo antirraiva primário de diluição pré-determinada ideal, e anticorpos de controle negativo, em temperatura ambiente por 60 minutos sem lavagens no meio. Depois disso, lave os slides com PBS-T por 10 minutos e incuba em uma câmara de umidade com o anticorpo biotinilado à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave os slides novamente com PBS-T por 10 minutos.

Incubar os slides e a câmara de umidade com divisão de tiras e complexo HRB em temperatura ambiente por 15 minutos e lavar o PBS-T por 10 minutos. Em seguida, incubar com AEC em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 10 minutos. Lave os slides em água deionizada por 10 minutos e contra-recomponha com hematoxilyn de Gill, diluído de um a dois com água deionizada por dois minutos.

Depois disso, enxágue o excesso de hematoxilina enxaguando os slides em água desionizada. Enxágüe os slides na água da torneira de Scott por 30 segundos e lave em água deionizada por 10 minutos. Remova os slides um de cada vez e monte-os com meio de montagem solúvel em água.

Em seguida, use um microscópio leve para ler os slides. Neste estudo, um teste de química imunocítica é demonstrado para a detecção de antígeno do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina. Uma química imunocítica representativa resultante de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais é mostrada aqui, incluindo o tronco cerebral, as células de cerebelo e purkinje, e o hipocampo.

A coloração vermelha magenta, que indica o desenvolvimento de cores usando substrato AEC contra o fundo azul contratermído, é devido à reatividade dos anticorpos contra o antígeno da raiva. Um resultado positivo na Imunohistoquímica corresponde à coloração vermelha magenta nas seções teciduais. A coloração de inclusões citoplasmáticas e inclusões granulares de tamanho variado são indicativos de amostras positivas para infecções de RABV.

As amostras são consideradas negativas se não forem observadas manchas vermelhas específicas ou apenas o fundo azul, devido à hematoxilina. Além da coloração positiva, a distribuição das inclusões poderia proporcionar quantificação indireta dos níveis de antígeno da raiva na amostra, o que pode corresponder à carga viral da amostra de tecido. Independentemente dos níveis de distribuição, qualquer coloração específica classificará a amostra como positiva para detecção de antígenos RABV.

Os tecidos devem ser fixados adequadamente em formalina, e evitar o congelamento dos tecidos durante esse processo. O antígeno da raiva é detectado pelo IHC, então técnicas moleculares podem ser realizadas em seções de parafina para determinar a variante Lyssavirus com base em informações de sequência de RNA. Reagentes como xileno e formalina devem ser manuseados em capuzes de fumaça.

Deve-se tomar cuidado ao manusear a AEC, pois é um cancerígeno.