Name: Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a técnica de imunohistoquímica para detectar antígenos do vírus da raiva em tecidos fixados em formalina. Este método sensível e específico permite localizar antígenos preservando a morfologia celular e tecidual.

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Agradecemos aos laboratórios, epidemiologistas e afiliados às secretarias de saúde pública pelas submissões de amostras aos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. Os achados e conclusões deste relatório são dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. O uso de nomes comerciais e fontes comerciais são apenas para identificação e não implicam endosso pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Enquanto o protocolo IHC foi realizado em tecidos fixos de formalina, que inativam rabv se presente, protocolos de biossegurança apropriados devem ser devidamente seguidos. Todos os procedimentos de biossegurança estão descritos na Biossegurança nos Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL) 5ª Edição (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluindo o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e exigência de vacinação conforme descrito12. Além disso, deve ser seguida a contenção e manuseio adequados de produtos químicos perigosos (como formalina, AEC e xileno), (por exemplo, capuzes de fumaça).
1. Fixação formalina de tecidos
<ol><li>Coloque 3-5 mm de tecido cerebral coletado após a necropsia13 em 10% de solução de formalina tamponada fosfato (1:20 a 1:50 razão tecido/formalina) para 24-72 h. ATENÇÃO: Formalina é um fixador tóxico.</li>
	<li>Registo o peso aproximado do tecido (tamanho), o tipo de tecido (áreas cerebrais) e o volume de formalina. É importante que os laboratórios documentem e mantenham registros sobre os tempos de fixação.</li>
	<li>Para maior armazenamento de tecido após fixação de formalina e antes do processamento, coloque o tecido em 70% de etanol.</li>
</ol>2. Processamento de tecidos
<ol><li>Após a fixação da amostra, disseque o tecido para incluir as áreas cerebrais importantes, por exemplo, seções transversais do tronco cerebral, cerebelo (3 lóbulos) ou hipocampo (ambos hipocampi) cortaram de 3 a 5 mm de espessura e colocados em de processamento.</li>
	<li>Processe as fitas de tecido para infiltração de cera de parafina, embutidas em blocos de parafina e seccionadas (3 a 6 μm) em um microtome.</li>
</ol>3. Preparação de Materiais / Pratos de coloração
<ol><li>Configure o prato de coloração14 (Tabela de Materiais),conforme mostrado na Figura 1. Encha cada prato com 250 mL da solução.</li>
	<li>Preparação da solução de estoque de substrato 3-Amino-9-ethylcarbizol (AEC)<ol>
<li>Dissolva um comprimido de 20 mg de 3-amino 9-ethylcarbazole (AEC) em 5 mL de N,N, dimetilformamida usando uma pipeta de vidro. ATENÇÃO: A AEC é um cancerígeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução de estoque protease (por exemplo, Pronase) para a recuperação de antígenos<ol>
<li>Dissolva 7 mg do protease em 200 mL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação do tampão de enxaguar PBS-T<ol>
<li>Adicione 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Misture bem para formar uma solução homogênea.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Desparafinação e reidratação tecidual
<ol><li>Faça uma seção de parafina de 5 μm usando um microtome, flutue-a em um banho de água a 38 °C e colete em lâminas de vidro. Rotule os slides com uma caneta/marcador resistente ao reagente.</li>
	<li>Coloque os slides sobre uma bandeja e derreta em um forno de 55-60 °C por 1 h. Não aumente a temperatura acima de 60 °C, pois pode destruir o antígeno viral.</li>
	<li>Retire os slides do forno e desparafinar imediatamente em 3 lavagem de xileno consecutivo de 5 min cada nos pratos 1, 2 e 3.</li>
	<li>Reidratar as seções no slide por imersões sequenciais na diminuição da diluição do etanol para a água desionizada: (4 a 11 é um mergulho enxaguar) prato 4: xileno/100% etanol (1:1); prato 5: 100% etanol; prato 6: 100% etanol; prato 7: 95% etanol; prato 8: 95% etanol; prato 9: 80% etanol; prato 10: 70% etanol; prato 11: água deionizada(Figura 1. Configuração de pratos). ATENÇÃO: O xileno é um produto químico perigoso e o trabalho deve ser conduzido em um capô de fumaça.</li>
</ol>5. Recuperação de antígeno proteolítico
<ol><li>Trate slides com a protease (2,5 μg/mL de PBS) por 30 min para recuperação de antígeno proteolítico no prato 12.</li>
	<li>Em seguida, enxágue em PBS-T por 10 min (prato 13).</li>
	<li>Trate com 3% de peróxido de hidrogênio por 10 min (prato 14).</li>
	<li>Novamente, lave com PBS-T por 10 min (prato 15).</li>
</ol>6. Procedimento de coloração
<ol><li>Manuseie slides um de cada vez mantendo os slides restantes submersos no buffer (não remova todo o suporte de lâminas - mantenha os slides molhados). Remova um slide e limpe o excesso de tampão (usando uma toalha de papel) ao redor da seção tecidual, tomando cuidado para não perturbar a seção do tecido. Incubar lâminas em uma câmara de umidade, feita colocando toalhas de papel umedecidas, no banco de laboratório superior14 em temperatura ambiente com soro de cabra normal (bloqueio) por 15 minutos.</li>
	<li>Incubar com o anticorpo antirraiva primário pré-determinado ideal de diluição (1:250 diluição do soro antirrábica do camundongo, inédito) (controle positivo) e anticorpos de controle negativos à temperatura ambiente mesmo que acima (passo 6.1.) por 60 minutos sem lavagens no meio.</li>
	<li>Depois de 60 min, lave com PBS-T por 10 min (prato 16).</li>
	<li>Incubar com o anticorpo biotinilado (espécies específicas) em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 15 minutos (manuseando o mesmo que o passo 6.1.).</li>
	<li>Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).</li>
	<li>Incubar com complexo Streptavidin-HRP em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 15 minutos (manuseando o mesmo que 6.1.).</li>
	<li>Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).</li>
	<li>Incubar com substrato peroxidase, amino-etilcarbazol (AEC), em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por 10 minutos. Faça AEC pouco antes de usar. Para isso, adicione 1 mL de solução de estoque AEC a 14 mL de tampão de acetato de 0,1M, pH 5.2. Adicione 0,15 mL de 3% H2O2. Filtre a mistura pouco antes do uso (filtro de 0,45 μm). NOTA: A solução de trabalho da AEC é apenas estável por 2-3 h. A solução de estoque AEC pode ser armazenada na geladeira por períodos mais longos.</li>
	<li>Lave em água deionizada 10 min (prato 17)</li>
	<li>Contra-manchada com hematoxilina de Gill diluída 1:2 com água deionizada por 2 min (prato 18).</li>
	<li>Enxágüe o excesso de hematoxilina com enxaguação de água deionizada (prato 19 e 20).</li>
	<li>Enxágüe no prato 30 s (solução bluing) da Torneira de Scott.</li>
	<li>Lave em água deionizada 10 min (prato 22)</li>
	<li>Remova slides um de cada vez - monte com meio de montagem solúvel em água.</li>
	<li>Leia slides em um microscópio leve.</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consulation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).</li>
<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Devido à alta taxa de letalidade da raiva após o início dos sintomas, o diagnóstico de animais suspeitos para infecção por RABV é extremamente crítico para um tratamento profilático pós-exposição adequado. O diagnóstico da raiva depende principalmente de técnicas baseadas em DFA, DRIT e PCR usando tecidos frescos ou congelados. Para testes de tecidos fixos de formalina, o teste IHC fornece um método alternativo para a detecção sensível e específica do antígeno RABV. Embora os tecidos fixados em formalina tenham proteínas...

A raiva é uma encefalite progressiva aguda causada pelo sentido negativo vírus RNA pertencentes ao gênero lyssavirus1. Quase 99% de todas as mortes humanas causadas pela infecção pelo vírus da raiva (RABV), o tipo de membro do gênero, é transmitida por cães2. O diagnóstico de raiva de animais suspeitos baseia-se na detecção de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viral, n proteína) em complexo com RNA genômico (complexo de ribonucleoproteína, RNP) no tecido cerebral3. A detecção de antígeno pelo teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico da raiva4. O método utiliza material cerebral congelado fresco ou fresco, uma impressão de toque em um slide, fixação em acetona, coloração usando isothionato fluorescente comercialmente disponível (FITC) rotulados anticorpos monoclonais ou policclonais (mAbs/pAbs) e lidos pela microscopia de fluorescência5. O teste de DFA é rápido, sensível e específico para detecção de antígeno de raiva em tecido cerebral fresco. Recentemente, foi demonstrado um teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT), a técnica de imunohistoquímica modificada (IHC), que apresentou sensibilidade semelhante à DFA, mas oferece a vantagem da microscopia leve para visualização6. Embora o método de detecção utilizado no DRIT seja semelhante ao IHC, a etapa inicial utiliza tecidos frescos ou congelados para gerar impressões de toque da amostra seguidas de fixação em formalina.
IHC é uma técnica amplamente utilizada para determinar alterações histológicas e detecção de proteínas usando anticorpos específicos em tecidos fixos de formalina embutidos em blocos de parafina. IHC é um teste alternativo estabelecido para a detecção de antígenos da raiva nas seções teciduais7. A IHC tem sido particularmente utilizada para o diagnóstico de casos retrospectivos que apresentaram doenças neurológicas para determinar a carga da raiva8. Tecidos fixos de formalina embutidos em parafina preservam as proteínas para a detecção mesmo após vários anos quando armazenados à temperatura ambiente9. O tratamento formalin modifica as proteínas ao intercruzar e alterar as cadeias laterais de aminoácidos, o que pode tornar os epítoes não mais reativos contra anticorpos10. Embora o teste de IHC para detecção de antígenos da raiva envolva mAbs ou pAbs, este último é vantajoso, pois múltiplos epítopos e lyssavírus divergentes podem ser detectados11.
As etapas padrão envolvidas no IHC são a fixação formalina de tecidos, incorporação em blocos de parafina, secção de tecidos, desparafinação e hidratação, recuperação de epítopes, reatividade contra anticorpos primários e secundários e o desenvolvimento usando substratos cromogênicos. Este manuscrito descreve um relato detalhado do protocolo para diagnóstico de raiva. Para detecção de antígeno da raiva, o soro de camundongos imunizado com RABV (pAbs) gerado nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC) Atlanta, Geórgia, em combinação com anticorpos secundários anti-camundongos biotinilados são utilizados. O Abs biotinilado é detectado pela adição do complexo de peroxidase de rabanete streptavidin-horseradish (HRP), seguido pelo desenvolvimento de cores com substrato de amino-etilcarbazol.

<table><tbody><tr><td>3% de peróxido de hidrogênio</td> Marcas <td></td><td>Pharamacy</td><td>Fora da prateleira 3% H2O2</td></tr><tr><td>3-Amino-9-etilcarbazol (AEC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de acetato pH 5.2</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Formalina Tamponada 10% Fosfato Tampolado</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Certificado</td></tr><tr><td>Lamínulas Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-471</td><td>24 X 50 mm</td></tr><tr><td>Etanol 190 Prova</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 Prova</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Formulação de hematoxilina de Gill #2</td>Kit de Biotina-Estreptavidina Peroxidase <td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HistoMark seracare</td><td>71-00-18</td><td>Anticorpo Primário de Camundongo&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>Mídia de montagem</td></tr><tr><td>N,N, Dimetil formamida GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objetivo</td><td>Vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objetivo</td><td>Vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Protease, Streptomyces griseus</td></tr><tr><td>Scott's Tap Water&nbsp;</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Conjunto de manchas deslizantes</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Grau Histológico</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 imagem - microscópio</td><td>Vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Uma das principais modalidades de diagnóstico para raiva é a detecção do complexo de ribonucleoproteína viral (RNP) nas amostras de tecido infectado. Embora o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFA) ou o teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT) sejam mais comumente utilizados para a detecção de antígenos, ambos os testes requerem tecidos frescos e/ou congelados para impressões em lâminas antes da detecção de antígenos usando anticorpos. Se as amostras forem coletadas e fixadas em formalina, nenhum dos testes é ideal para a detecção de antígenos, no entanto, os testes podem ser realizados pela imunohistoquímica convencional (IHC) após a incorporação em blocos de parafina e secção. Com este método IHC, os tecidos são manchados com anticorpos antirraiva, seções são desparafinadas, antígenos recuperados por proteólise parcial ou outros métodos, e incubados com anticorpos primários e secundários. Os antígenos são manchados usando peroxidase de rabanete / amino etil carbazole e contra-manchados com hematoxilina para a visualização usando um microscópio leve. Além da detecção específica de antígenos, a fixação de formalina oferece outras vantagens como a determinação de alterações histológicas, condições relaxadas para armazenamento e transporte de amostras (sob temperaturas ambientes), capacidade de testar casos retrospectivos e maior segurança biológica através da inativação de agentes infecciosos.

A Figura 2 demonstra resultados representativos de coloração do IHC de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais testados. A Figura 2A,D,G representa amostras positivas em 200x, enquanto a Figura 2B,E,H corresponde à ampliação de 400x, respectivamente. Figura 2A-C correspondem ao tronco c...

Aqui, apresentamos um protocolo de teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina.

Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Os tecidos utilizados para a imunohistoquímica e para histopatologia diagnóstica são rotineiramente fixados em formalina tampão de fosfato de 10%. A detecção de antígeno do vírus da raiva no tecido cerebral que foi fixado em formalina apresenta um desafio único, e o teste de IHC foi encontrado como um método sensível e específico para detecção de antígenos do vírus da raiva. A principal vantagem da biópsia ou outros métodos de detecção é que os antígenos podem ser detectados em relação à morfologia tecidual e celular.Com o IHC, a localização do antígeno da raiva nos tecidos cerebrais e não cerebrais, fornece informações adicionais que não poderiam ser obtidas através de seções rotineiras de hematolina e eosina. O teste de diagnóstico da raiva é importante para o início da profilaxia pós-exposição em humanos expostos ao vírus da raiva. IHC é um dos ensaios mais comumente realizados em tecidos fixos de formalina.Com anticorpos específicos, pode ser usado para a detecção de seus respectivos patógenos. Para iniciar este procedimento, coloque de três a cinco milímetros de tecido cerebral, coletado após a necropsia, em uma solução de formalina 10% tamponada por 24 a 72 horas. Regissore o peso aproximado do tecido, o tipo de tecido e o volume de formalina.Coloque os tecidos em 70% de etanol para maior armazenamento de tecido após a fixação da formalina e antes do processamento. Após a fixação do espécime, disseque o tecido para incluir as áreas cerebrais importantes, como seções transversais do tronco cerebral, do cerebelo ou do hipocampo. Cada um, cortado para uma espessura entre três e cinco milímetros.Coloque os tecidos em fitas de processamento. Processe as fitas de tecido para infiltração de cera de parafina. Incorpore-os em blocos de parafina e seque-os em um microtome.Primeiro configure o prato de coloração conforme descrito na Figura 1 do protocolo de texto. Encha cada prato com 250 mililitros da solução preparada. Para preparar a solução de estoque de substrato AEC, use uma pipeta de vidro para dissolver um comprimido de 20 miligramas de AEC em 5 mililitros de N, N-Dimethylformamida.Para preparar a solução de estoque protease, dissolva 7 miligramas da protease em 200 mililitros de PBS. Para preparar o tampão de lavagem, adicione 100 mililitros de Tween 80 a 990 mililitros de PBS, e misture bem para formar uma solução homogênea de PBT-T. Usando um microtome, faça uma seção de 5 micrômetros de parafina.Carregue a seção em um banho de água a 38 graus Celsius e colete-a em lâminas de vidro. Rotule os slides com uma caneta resistente ao reagente. Coloque os slides sobre uma bandeja e derreta em um forno a 55 a 60 graus Celsius por uma hora.Em seguida, retire os slides do forno e desparafina-os imediatamente, usando 3 enxágues consecutivos de xileno de 5 minutos cada. Depois disso, reidratar as seções no slide por imersões sequenciais na diminuição das diluições de etanol para água desionizada, conforme descrito no protocolo de texto. Trate os slides com a protease por 30 minutos para recuperação de antígeno proteolítico, depois enxágue os slides em PBS-T por 10 minutos e trate-os com peróxido de hidrogênio de 3% por 10 minutos.Depois disso, lave os slides novamente com PBS-T por 10 minutos. Para começar, remova um slide do buffer, certificando-se de segurar apenas um slide de cada vez, enquanto os outros permanecem submersos, e use uma toalha de papel para apagar o excesso de tampão ao redor da seção de tecido. Coloque os slides em uma câmara de umidade e incubar com soro de cabra normal à temperatura ambiente por 15 minutos.Em seguida, incubar os slides na câmara de umidade com o anticorpo antirraiva primário de diluição pré-determinada ideal, e anticorpos de controle negativo, em temperatura ambiente por 60 minutos sem lavagens no meio. Depois disso, lave os slides com PBS-T por 10 minutos e incuba em uma câmara de umidade com o anticorpo biotinilado à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave os slides novamente com PBS-T por 10 minutos.Incubar os slides e a câmara de umidade com divisão de tiras e complexo HRB em temperatura ambiente por 15 minutos e lavar o PBS-T por 10 minutos. Em seguida, incubar com AEC em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 10 minutos. Lave os slides em água deionizada por 10 minutos e contra-recomponha com hematoxilyn de Gill, diluído de um a dois com água deionizada por dois minutos.Depois disso, enxágue o excesso de hematoxilina enxaguando os slides em água desionizada. Enxágüe os slides na água da torneira de Scott por 30 segundos e lave em água deionizada por 10 minutos. Remova os slides um de cada vez e monte-os com meio de montagem solúvel em água.Em seguida, use um microscópio leve para ler os slides. Neste estudo, um teste de química imunocítica é demonstrado para a detecção de antígeno do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina. Uma química imunocítica representativa resultante de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais é mostrada aqui, incluindo o tronco cerebral, as células de cerebelo e purkinje, e o hipocampo.A coloração vermelha magenta, que indica o desenvolvimento de cores usando substrato AEC contra o fundo azul contratermído, é devido à reatividade dos anticorpos contra o antígeno da raiva. Um resultado positivo na Imunohistoquímica corresponde à coloração vermelha magenta nas seções teciduais. A coloração de inclusões citoplasmáticas e inclusões granulares de tamanho variado são indicativos de amostras positivas para infecções de RABV.As amostras são consideradas negativas se não forem observadas manchas vermelhas específicas ou apenas o fundo azul, devido à hematoxilina. Além da coloração positiva, a distribuição das inclusões poderia proporcionar quantificação indireta dos níveis de antígeno da raiva na amostra, o que pode corresponder à carga viral da amostra de tecido. Independentemente dos níveis de distribuição, qualquer coloração específica classificará a amostra como positiva para detecção de antígenos RABV.Os tecidos devem ser fixados adequadamente em formalina, e evitar o congelamento dos tecidos durante esse processo. O antígeno da raiva é detectado pelo IHC, então técnicas moleculares podem ser realizadas em seções de parafina para determinar a variante Lyssavirus com base em informações de sequência de RNA. Reagentes como xileno e formalina devem ser manuseados em capuzes de fumaça.Deve-se tomar cuidado ao manusear a AEC, pois é um cancerígeno.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

Este vídeo demonstra a coloração imuno-histoquímica para detecção de antígenos do vírus da raiva no tecido cerebral de camundongos infectados. O processo inclui desparafinização e tratamento com álcool, seguido de tratamento proteolítico para aumentar a acessibilidade ao antígeno. A coloração imuno-histoquímica revela precipitados vermelhos, confirmando a presença de antígenos antirrábicos na seção tecidual.

Uma coloração imuno-histoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva

Apresentamos aqui um protocolo otimizado e detalhado para imunocoloração dupla em seções de tecido do sistema nervoso central (SNC) e linfonodo periférico (LN) de rato fixado em formalina e embebido em parafina.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Foi estabelecido um protocolo de hibridização fluorescente in situ para a detecção de um genoma do vírus de ADN persistente nas secções de tecido de modelos animais. Este protocolo permite estudar processo de infecção por codetection do genoma viral, os seus produtos de ARN, e proteínas virais ou celulares no interior das células individuais.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Novel, técnicas de compensação de tecido compatível com imunocoloração, como a imagem 3D final de órgãos com solventes limpos, permitem a visualização 3D da infecção cerebral pelo vírus da raiva e seu ambiente celular complexo. As fatias grossas, anticorpo-etiquetadas do tecido de cérebro são feitas opticamente transparentes para aumentar a profundidade da imagem latente e para permitir a análise 3D pela microscopia confocal da exploração do laser.

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.

Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa

Este RT-PCR tempo real usando a tintura intercalando de dsDNA é apropriado diagnosticar infecções do lyssavirus. O método começa com o RNA extraído da raiva suspeita de amostras ante mortem ou post-mortem, detalhando a preparação da mistura mestra, adição de RNA, configuração da máquina em tempo real e interpretação correta dos resultados.

Tempo real RT-PCR do Pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva

Apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte da raiva animal em condições de campo usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Também descrevemos outras aplicações usando o dispositivo para análise molecular e genotipagem viral.

Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido pós-morte de campo para configurações limitadas de recursos com outras aplicações moleculares

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Este protocolo demonstra o ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 desde a coleta do tecido até a interpretação dos resultados, incluindo atualizações nas sequências e formulações de primers para melhorar o desempenho do ensaio para alguns lyssavirus e lagomorfos não anti-rábicos. Também demonstramos a configuração do ensaio para um formato multiplexado LN34 de poço único (LN34M).

Diagnóstico post-mortem de raiva em animais pelo ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real LN34 atualizado e multiplexado

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a técnica de imunohistoquímica para detectar antígenos do vírus da raiva em tecidos fixados em formalina. Este método sensível e específico permite localizar antígenos preservando a morfologia celular e tecidual.

Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

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