Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro
9 de novembro de 2019
Macrófagos, especialmente macrófagos primários, são um desafio para transfect como eles se especializam na detecção de moléculas de não-origem auto. Descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos.
chiming eletrônico Porque macrófagos se especializam em detectar moléculas de não-auto-origem, eles são particularmente difíceis de transfectar. Descrevemos um protocolo que permite transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos. A principal vantagem do nosso método é que altas taxas de transfecção são alcançadas na ausência de qualquer citotoxicidade detectável ou imunogenicidade.
Demonstrando o procedimento será Marc Herb um pós-doutor do meu laboratório. Comece descongelando todos os componentes do kit de transcrição do RNA. Vórtice os reagentes por cinco segundos e gire-os por dois segundos a 2.000 vezes g, em seguida, mantê-los no gelo até usar.
Prepare a reação de transcrição in vitro do RNA em um tubo de microcentrífuga de 0,5 microliter de acordo com as instruções do manuscrito. Vórtice do tubo e gire-o para baixo. Em seguida, incuba-lo a 37 graus Celsius por 30 minutos enquanto mistura a 400 rpm em uma batedeira térmica.
Após a incubação, adicione dois microliters de DNase I diretamente na mistura de reação. Vórtice e gire o tubo para baixo, e incuba-o na batedeira térmica por mais 15 minutos. Reserve uma alíquota de dois microliter do produto tratado com Dnase para o gel de controle e armazene-o a menos 80 graus Celsius.
Para o rejeito de polia, adicione cinco microliters de tampão de reação de polimerase polimerase de 10X e cinco microliters de polimerase polia à reação tratada com Dnase. Vórtice e gire a mistura. Em seguida, incuba-lo na batedeira térmica por 30 minutos.
Quando a reação estiver completa, pegue uma alíquota de dois microliter para o gel de controle e armazene-a a menos 80 graus Celsius. Adicione reagentes de desfosforilação 5-prime diretamente ao produto de cauda polyA de acordo com as instruções do manuscrito. Vórtice e gire o tubo e incuba-o na batedeira térmica por mais 30 minutos.
Siga a reação de desfosforilação com uma incubação de dois minutos a 80 graus Celsius, a fim de inativar a fosfatase antártica. Em seguida, purifique o mRNA transcrito in vitro usando um kit de purificação de RNA dedicado. Meça a concentração e a pureza do mRNA elucido com um espectrofotômetro microvolume.
Execute um gel de agarose desnaturing com as alíquotas coletadas anteriormente para verificar a presença de um único produto, comprimento correto da transcrição e seguimento poliA. Prepare-se para a transfecção adicionando o volume pré-calculado do tampão de transfecção mRNA menos os volumes do reagente de transfecção mRNA e do mRNA a um tubo de reação. Descongele o caldo de mRNA e misture-o suavemente girando o tubo.
Em seguida, adicione o volume pré-calculado de mRNA ao tubo de reação. Vórtice e gire para baixo a mistura de reação e o reagente de transfecção mRNA, em seguida, adicione o volume apropriado do reagente de transfecção mRNA ao tubo de mistura de reação. Vórtice do tubo e gire-o para baixo.
Em seguida, incuba-lo em temperatura ambiente por 15 minutos. Enquanto isso, substitua o meio cultural dos macrófagos por um meio de cultura quente fresco. Uma vez que a incubação da mistura de transfecção esteja completa, adicione a mistura aos poços de placa contendo os macrófagos dropwise e em um círculo do lado de fora para o meio do poço.
Para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção, balance suavemente a placa em uma direção vertical e horizontal. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos seis horas. Após a incubação, analise a eficiência de transfecção com microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou imunoblot.
A parte mais importante deste procedimento é garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção para que todos os macrófagos entrem em contato com a mesma quantidade de mRNA. Este protocolo foi usado com sucesso para gerar variantes NEMO e IKK-beta marcadas pelo MRNA para transfecção de macrófagos primários. O tamanho correto e o seguimento poliA do mRNA foram verificados por eletroforese de gel agarose.
A eficiência da transfecção foi confirmada pela geração de GFP de codificação de mRNA e pela realização da análise da citometria de fluxo. A taxa de transfecção aumentou junto com a quantidade de mRNA transfeccionado, atingindo 50 a 65% para PM e 80 a 85% para BMDM. Tanto na PM quanto no BMDM, o nível de expressão do EGFP em células transfeinadas aumentou de forma dependente de tempo e dose.
É importante ressaltar que a análise dos macrófagos propidium iodida-positivo ou anexo V-positivo confirmou que o procedimento de transfecção não induziu morte celular lístida ou apoptótica. A eficiência de transfecção das variantes nemo ou IKK-beta marcadas por MTS foram analisadas com microscopia de imunofluorescência. As taxas foram de cerca de 60% para Nemo mRNAs e 55% para iKK-beta mRNAs.
Este protocolo também foi usado para gerar mRNA codificando Cre recombinase. Transfecção de 400.000 BMDM com 400 nanogramas de Cre recombinase mRNA resultou em esgotamento quase completo da proteína Nemo após 48 horas, indicando transfecção altamente eficiente. A ausência de quantidades detectáveis de Interleucina 1 beta, Interleucina-6 e fator de necrose tumoral indicam que o procedimento de transfecção não ativa sinalização pró-inflamatória.
Nosso método relativamente simples finalmente permite expressar eficientemente proteínas mutadas ou marcadas em macrófagos primários. Isso aprofundaria substancialmente a análise das funções do macrófago no nível molecular.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a transfeção altamente eficiente de macrófagos primários murinos, incluindo macrófagos peritoneais (PM) e macrófagos derivados da medula óssea (BMDM), utilizando mRNA transcrito in vitro a partir de modelos de DNA, como plasmídeos. O método alcança altas taxas de transfeção sem induzir citotoxicidade ou imunogenicidade, superando os desafios impostos pelos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) dos macrófagos, que normalmente dificultam a entrega de ácidos nucleicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Imunologia
- Biologia molecular
Contexto
- Os macrófagos são células imunes fagocíticas equipadas com PRRs para detectar moléculas não próprias.
- Esses receptores tornam os macrófagos difíceis de transfectar, pois reconhecem e respondem a ácidos nucleicos estranhos e reagentes de transfeção.
- A transfeção frequentemente leva à ativação dos macrófagos, degradação do ácido nucleico ou morte celular.
- São necessários métodos de transfeção eficientes e não imunogênicos para estudos moleculares em macrófagos primários.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e descrever um protocolo para transfeção eficiente de mRNA em macrófagos murinos primários.
- Obter altas taxas de transfeção sem efeitos citotóxicos ou imunogênicos.
- Permitir a expressão de proteínas mutadas ou marcadas para estudos funcionais em macrófagos.
Métodos Utilizados
- Transcrição in vitro de mRNA a partir de moldes de DNA (por exemplo, plasmídeos), incluindo etapas de adição da cauda poliA e desfosforilação.
- Purificação e avaliação da qualidade de mRNA utilizando espectrofotometria e eletroforese em gel de agarose desnaturante.
- Preparação de complexos de mRNA e reagente de transfeção e adição cuidadosa aos macrófagos cultivados.
- Avaliação da eficiência de transfeção por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e imunoblotagem.
Resultados Principais
- Foram alcançadas taxas de transfeção de 50–65% para PM e de 80–85% para BMDM.
- A expressão de EGFP em células transfectadas foi dependente de tempo e dose.
- Não foi observada evidência de morte celular lítica ou apoptótica (ensaios com iodeto de propídio e anexina V).
- Não foi detectada indução de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF), indicando ausência de imunogenicidade.
- Foi demonstrada expressão eficiente de NEMO, IKK-beta e recombinase Cre com marcação FLAG.
Conclusões
- Este protocolo permite a transfeção eficiente, não tóxica e não imunogênica de mRNA em macrófagos primários.
- Facilita estudos moleculares ao permitir a expressão de proteínas exógenas, mutadas ou marcadas.
- O método aprimora a análise das funções dos macrófagos no nível molecular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A manipulação genética eficiente de macrófagos primários é um gargalo prolongado na pesquisa em imunologia e biologia celular devido à sua resistência inata à entrega de ácidos nucleicos. Este protocolo permite a transfeção de mRNA com alta eficiência e não imunogênica em macrófagos murinos primários, apoiando diretamente estudos mecanicistas e validação de alvos em modelos imunológicos relevantes para doenças. A abordagem aumenta a confiança preditiva na interface entre descoberta e pré-clínica, facilitando a investigação funcional robusta da biologia de macrófagos para tomada de decisões em portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a expressão funcional de proteínas mutadas ou marcadas em macrófagos primários para investigação de vias de sinalização.
- Auxilia na desmistificação biológica ao permitir a manipulação direta de componentes de sinalização em células imunes.
- Facilita a validação de alvos em sistemas de macrófagos fisiologicamente relevantes, sem citotoxicidade ou ativação imune confundíveis.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Prepara sistemas primários validados de macrófagos para triagem subsequente da função gênica ou modulação de vias de sinalização.
- Oferece taxas reprodutíveis e quantitativas de transfeção adequadas à padronização de ensaios e estudos comparativos.
- Permite avaliação confiável dos efeitos na expressão gênica em células imunes primárias, apoiando o desenvolvimento escalonável de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos imunológicos relevantes para doenças ao permitir a manipulação genética em macrófagos primários.
- Apóia a continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, mantendo a relevância fisiológica.
- Reduz o risco de achados artifatos devido a linhagens celulares não fisiológicas ou artefatos de ativação imunológica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica, permitindo a verificação de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas em células imunes primárias.
- Biologia da Descoberta: Apoia a manipulação orientada por hipóteses de vias de sinalização e função gênica em macrófagos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de transfeção para prontidão de ensaios e análises comparativas.
- Análises: Permite a medição da eficiência de transfeção e da expressão proteica por citometria de fluxo, microscopia e imunoblotagem.
- Pesquisa Translacional: Mantém relevância para doenças ao utilizar macrófagos primários, apoiando a validação de biomarcadores e alvos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado e amplamente aplicável para manipulação genética em modelos de células imunes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de células imunes.
- Valor Operacional: Oferece transfeção padronizada, reprodutível e escalonável em macrófagos primários.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou interromper projetos e a eficiência do capital ao permitir a validação robusta de alvos em sistemas relevantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas terapêuticos imunomoduladores.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de RNA, cultura de células primárias e técnicas de transfeção.
- Exige acesso a kits de transcrição de RNA, sistemas de purificação e instrumentação analítica (por exemplo, citometria de fluxo, microscopia).
- Exige padronização entre equipes para garantir reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode ser necessária adaptação para outros tipos celulares imunes primários ou espécies.
- A eficiência e a não imunogenicidade devem ser verificadas empiricamente para cada novo construto ou origem celular.
