Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga
6 de agosto de 2019
Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.
Este protocolo permite o isolamento perfeito, a culminação e o interrogatório de respostas transcricionais em uma linhagem celular específica de C.elegans. A principal vantagem deste protocolo é o alto nível de adaptabilidade a diferentes estágios de vida de vermes ou tipos de células específicas a serem isolados. Demonstrando o procedimento seremos eu e Nataliya Zahayko, uma técnica do nosso laboratório.
Depois de coletar os animais, centrifuá-los a 1600 vezes g por cinco minutos. Remova todos os supernascentes e resuspense os vermes em um mililitro da mídia M9. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a 1600 vezes g por cinco minutos para pelotar os vermes. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão SDS-DTT e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Os vermes agora parecem estar enrugados ao longo do corpo se vistos sob um microscópio leve.
Em seguida, adicione 800 microliters de tampão de isolamento gelado e misture movendo suavemente o tubo. Centrifugar a 13.000 vezes g e a quatro graus Celsius por um minuto para pelotar os vermes. Remova o supernatante e lave com um mililitro de tampão de isolamento.
Repita o processo de centrifugação e lavagem um total de cinco vezes, certificando-se de remover cuidadosamente o tampão de isolamento cada vez. Depois disso, adicione 100 microliters de mistura de protease de Streptomyces griseus, dissolvido em tampão de isolamento, à pelota. Incubar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, certificando-se de aplicar interrupção mecânica ao subir e descer 60 a 70 vezes com uma ponta de micropipette de 200 microliter contra a parte inferior do tubo.
Para determinar o estágio da digestão, remova de um a cinco microlitros da mistura de digestão, solte-a em um slide de vidro e inspecione-a usando um microscópio de cultura tecidual. Após cinco a sete minutos, fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e um chorume de células será facilmente visível. Pare a reação adicionando 900 microliters do meio L-15 de Leibovitz comercialmente disponível, complementado com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina.
Centrífuga a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos para pelotas fragmentos isolados e células. Lave as células pelotas mais duas vezes com mídia l-15 resfriada usando um mililitro de mídia por lavagem. Resuspenda as células pelotas em um mililitro de L-15 de mídia suplementada, e deixe no gelo por 30 minutos.
Em seguida, pegue a camada superior, que é aproximadamente 700 a 800 microliters, e transfira-a para um tubo de microcentrifuge. Use um contador celular automatizado ou hemacytómetro para medir a densidade celular de 10 a 25 microliters de células isoladas. Células centrífugas da suspensão celular isolada a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernasal e resuspenque as células pelleted em L-15 complementado médio a uma densidade celular de não mais de seis milhões de células por mililitro para evitar sobrecarregar o citómetro de fluxo. Em seguida, classifique células por expressão GFP-positive usando um citômetro de fluxo capaz de classificar amostras. As células GFP-negativas podem ser usadas como um controle para análises não específicas do tipo celular.
Depois disso, coloque as células isoladas nos poços de uma placa estéril de seis poços, coloque a placa em um recipiente plástico, adicione um lenço úmido ou papel de tecido mole para adicionar umidade às células e incubar a 20 graus Celsius. Células centrífugas da suspensão celular isolada em um tubo de microcentrifusagem sem RNase de 1,5 mililitro a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Usando uma micropipette, remova o supernascer e adicione 100 microliters de m9 médio para lavar o meio L-15.
Em seguida, centrifugar as células a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos e remover o supernasce. Repita este processo de lavagem e centrifugação três vezes maior para garantir que toda a mídia seja removida, certificando-se de remover cuidadosamente o supernatante cada vez. Em seguida, adicione um mililitro de solução de isothiocianato de fenol e guanidina às células e pipeta a suspensão para cima e para baixo cuidadosamente.
Incubar a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois disso, adicione 250 microliters de clorofórmio e inverta suavemente o tubo 15 a 20 vezes. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Centrifugar a 10.000 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos. Use uma micropipette para remover cuidadosamente o máximo possível da camada aquosa superior, certificando-se de não perturbar as camadas orgânicas inferiores. Transfira a camada inferior para um novo tubo de microcentrifuge sem 1,5 mililitros RNase.
Ao novo tubo, adicione 500 microliters de isopropanol e misture invertendo o tubo. Incubar esta solução em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifugar o tubo a 14.000 vezes g e a 25 graus Celsius por 20 minutos.
Coloque as amostras no gelo e use uma micropipette para remover o máximo de isopropanol possível. Adicione suavemente um mililitro de 70% de etanol na água dupla-destilada sem RNase ao tubo, aplicando-o ao lado do tubo. Centrifugar a 10.000 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos.
Retire a maior parte do etanol e deixe o tubo secar no gelo por três a cinco minutos. Depois disso, adicione 15 a 20 microliters de água dupla-destilada sem RNase. Use um espectótmetro a 260 nanômetros para medir a concentração e pureza do RNA.
Neste estudo, os neurônios colinérgicos unc-17:GFP positivo são extraídos e isolados da lombriga C.elegans para estudos ex vivo subsequentes. O gene unc-17 é expresso em todo o corpo C.elegans, e códigos para um transporte transmembrano de acetilcolina vesicular. A expressão deste gene pode ser observada em neurônios de cabeça, corpo médio e cauda, e projeções de neurônios.
Micrografos representativos de fluorescência de neurônios unc-17:GFP positivo após o isolamento, bem como um respectivo controle negativo de animais selvagens N2 não modificados, são mostrados aqui. As células isoladas podem permanecer vivas até três dias quando suplementadas com o meio L-15 de Leibovitz e 10% FBS. Dados representativos de qPCR de neurônios colinérgicos que expressam GFP, bem como células musculares que expressam GFP, são mostrados aqui.
Após a triagem com sucesso das células, o RNA é isolado através de um método de isothiocnato de fenol e guanidina, após o qual o CDNA foi produzido usando um kit de síntese. A expressão de genes específicos de neurônios colinérgicos, tph-1, um hidroxilase triptofano, e snb-1, um transportador de vesícula sináptica, é elevada em células isoladas unc-17:GFP. No entanto, essa expressão não está presente em células isoladas myo-3:GFP.
O inverso é verdadeiro com a expressão da transcrição da cadeia de mio-2 específica da minodeira, já que a expressão deste gene é limitada a células musculares isoladas, mas não às células colinérgicas isoladas. É importante incubar os vermes completamente. No entanto, a incubação prolongada da cutícula do verme pode resultar em morte de vermes ou estresse adicional ao animal.
Após o isolamento, as células podem ser cultivadas por um período de tempo, ou usadas para isolamento de RNA e análise de qRT-PCR. Neurônios cultivados podem ser analisados por medidas de eletroforese de grampo de remendo. Essa técnica pode facilitar a análise ex vivo de grupos específicos de células, ajudando assim a melhorar nossa compreensão das respostas específicas das células no contexto de organismos multicelulares em vários estágios de seu ciclo de vida.
Como produtos químicos como SDS e DTT são usados durante este experimento, os procedimentos gerais de segurança do laboratório devem ser seguidos durante a fabricação e o uso de buffers.
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Visão Geral
Este protocolo permite o isolamento, cultivo e análise contínuos de respostas transcricionais em uma linhagem celular específica de C.elegans. O método é adaptável a diferentes estágios de vida dos vermes ou a tipos celulares específicos a serem isolados.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Organismos Transgênicos
Antecedentes
- O isolamento de células neuronais específicas é fundamental para estudar suas funções.
- Linhas transgênicas de Caenorhabditis elegans que expressam proteína verde fluorescente facilitam esse processo.
- Estudos ex vivo em neurônios isolados podem fornecer informações sobre seu comportamento e propriedades.
- Este protocolo melhora a capacidade de estudar populações neuronais específicas.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método confiável para o isolamento de células neuronais vivas.
- Permitir o cultivo de curto prazo adicional das células isoladas.
- Facilitar diversos estudos ex vivo focados em neurônios específicos.
Métodos Utilizados
- Coleta de C.elegans transgênicos expressando GFP.
- Centrifugação dos animais coletados a 1600 vezes g durante cinco minutos.
- Ressuspendimento dos vermes em meio M9.
- Transferência da suspensão para tubos de microcentrífuga para processamento adicional.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de populações neuronais específicas.
- Adaptabilidade do protocolo a diversas fases da vida e tipos celulares.
- Potencial para análise transcricional detalhada de células isoladas.
- Melhor compreensão da função neuronal por meio de estudos ex vivo.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem direta para o isolamento de células neuronais.
- Ele abre caminhos para pesquisas adicionais sobre o comportamento e as propriedades neuronais.
- A adaptabilidade torna-o adequado para uma ampla gama de estudos em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de populações neuronais específicas de organismos modelo permite a desmistificação mecanicista na validação de alvos, vinculando perturbações genéticas a fenótipos funcionais. Essa abordagem reforça a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, fornecendo dados transcricionais quantitativos e específicos por tipo celular, que podem orientar a triagem de hipóteses. A adaptabilidade desse método ao longo dos estágios de vida e tipos celulares potencializa a continuidade translacional na modelagem pré-clínica de processos neurodegenerativos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de respostas transcritômicas específicas de células para avaliar o engajamento de alvos e a modulação de vias em populações definidas de neurônios.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho reprodutível para o isolamento de neurônios colinérgicos vivos de C. elegans para ensaios funcionais subsequentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera lisados neuronais purificados adequados para leituras baseadas em qPCR, permitindo triagem quantitativa de perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento celular por meio de FACS ou separação por microesferas magnéticas, reduzindo a variabilidade na análise ex vivo entre experimentos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao isolar neurônios implicados na disfunção relacionada ao envelhecimento, facilitando a descoberta de biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite o cultivo de curto prazo de neurônios isolados, possibilitando estudos longitudinais de alterações transcricionais ou eletrofisiológicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos iniciais, ao fornecer leituras mecanicistas de populações neuronais geneticamente definidas.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses mediante o isolamento de neurônios marcados com GFP para medir alterações na expressão gênica após perturbação.
- Triagem: Produz amostras neuronais padronizadas adequadas para ensaios transcricionais de alta sensibilidade.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de rendimento e pureza de RNA por espectrofotometria, apoiando a normalização e comparação de dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao isolar neurônios de modelos de envelhecimento para estudar vias conservadas de declínio neuronal.
- Reutilização Empresarial: Sistemas GFP com promotores adaptáveis permitem reutilização em diversos tipos neuronais e estágios de vida, aumentando a utilidade da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar alterações transcricionais a populações específicas de neurônios, melhorando a confiança no alvo.
- Valor Operacional: Permite o isolamento padronizado de células vivas utilizando técnicas de separação estabelecidas, aumentando a reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço ou interrupção do projeto ao fornecer dados funcionais precoces e específicos de tipo celular que reduzem os riscos das hipóteses sobre os alvos.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação de vias neuronais em um sistema geneticamente manipulável.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de modelos transgênicos, classificação de células ativada por fluorescência e técnicas de isolamento de RNA.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo ou sistemas de separação magnética compatíveis com amostras neuronais de pequeno volume.
- Necessita padronização dos protocolos de digestão e lavagem para garantir rendimento celular e viabilidade consistentes entre diferentes lotes.
- A adaptação a outros tipos neuronais depende da disponibilidade de linhagens específicas de promotor-GFP e da otimização das condições de dissociação.
- As limitações práticas incluem uma janela curta de viabilidade pós-isolamento e o potencial estresse decorrente das etapas de dissociação mecânica e enzimática.
