Geração de um modelo de rato de insuficiência hepática aguda, combinando 70% hepatectomia parcial e paracetamol

Insuficiência hepática aguda ou ALF é geralmente definida como desenvolvimento rápido de lesão hepática em um fígado saudável e é acompanhada por comprometimento severo de suas principais funções. O transplante de fígado ortotópico é a única cura disponível na maioria dos casos. Mas devido à escassez de doadores de fígado, a taxa de mortalidade em pacientes com ALF é muito alta.

Para estudar o potencial de abordagens terapêuticas alternativas e entender melhor a fisiopatologia da ALF, são utilizados modelos animais da doença. Muitos dos modelos ALF são baseados nos efeitos hepatotóxicos de acetaminofeno, tetraclorito de carbono, Concanavalina A, lipopolysacarídeo, D-Galactosamina e tiaacetamida. No entanto, estes têm várias deficiências, como baixa reprodutibilidade e reversibilidade, toxicidade para outros órgãos vitais, má reflexão da patologia da doença humana e variação de espécies.

Portanto, há a necessidade de um melhor sistema de modelos que seja reprodutível e permita intervalo de tempo suficiente para estudar os efeitos de uma intervenção terapêutica. No presente estudo, um modelo ALF em ratos foi criado combinando efeitos de hepatectomia parcial e hepatotoxicidade acetaminofeno. O lobo lateral mediano e esquerdo do fígado são removidos para extirpor 70% de massa hepática, e além disso, o acetaminofeno é dado para causar ALF.

O desenvolvimento da ALF no modelo tem sido caracterizado pela análise bioquímica e histológica e a reversibilidade dos danos hepáticos foi confirmada por meio do transplante de hepatócitos de ratos saudáveis sintéricos. Ratos Wistar com peso corporal na faixa de 180 a 250 gramas foram utilizados no presente estudo. As etapas a seguir descrevem o procedimento cirúrgico para indução de ALF em um rato.

O animal é anestesiado pela injeção de mistura cetamina-xylazina intraperitoneally. A anestesia completa é confirmada beliscando o dedo do pé do animal, e outros procedimentos são realizados somente quando não há reflexo do pedal. Para evitar a proficação da córnea, um baú à base de metil-celulose carboxy é aplicado em ambos os olhos.

O animal é contido no tabuleiro cirúrgico usando uma fita branca. O cabelo é removido da área cirúrgica abdominal superior direita usando um cortador elétrico. Desinfete o local cirúrgico por três esfoliantes alternados de 70% de etanol e iodo povidone usando almofadas de algodão esterilizadas em movimento circular.

A pele a ser cortada é marcada logo abaixo do esterno perpendicular ao xifoide e paralela à caixa torácica. Uma folha de cortina estéril com uma abertura de cerca de três centímetros por um centímetro é colocada sobre a pele marcada. Uma incisão transversal de cerca de dois a três centímetros é feita ao longo da linha marcada com a ajuda de um bisturi.

O acessório da pele com camada muscular subjacente nas proximidades da área incisada é suavemente removido por pontas de algodão estéreis umede. Em seguida, uma incisão transversal é feita através de camada peritoneal logo abaixo do processo xifoide. O lobo esquerdo do fígado é exposto dando uma pressão suave ao tórax com a ajuda de duas pontas de algodão umedecidas salinas.

Um laço de fio de nylon estéril é deslizado ao redor do lobo hepático exposto. O laço é cuidadosamente levado para a base do lobo com a ajuda de micro fórceps dissecando ou brotos de algodão. Com a ajuda do suporte de agulha de microcirurgia e micro fórceps, as duas extremidades do laço são amarradas, colocando o nó o mais próximo possível da base do lóbulo.

Isto é para restringir os vasos sanguíneos e reduzir o sangramento depois que o lobo hepático for removido. Dois nós adicionais estão amarrados do outro lado. O lobo amarrado é cortado logo acima do nó usando uma tesoura de microcirurgia que deixa um toco isquêmico.

Da mesma forma, o lobo mediano do fígado é levantado usando pontas de algodão. Reconheça a forma única do lobo mediano do fígado. Coloque um laço de fio de nylon sobre o lóbulo, amarre firmemente as extremidades.

Dois nós adicionais estão amarrados do outro lado e ressecram o lobo. Após a remoção dos lóbulos, o peritônio é sutura sutura absorvível 4/0 absorvível com pontos contínuos seguido de sutura da pele com sutura simples interrompida. Após o fechamento da pele, a solução de iodo povidone é aplicada ao redor do local cirúrgico.

A folha de cortina é removida e o animal é retirado da placa de cirurgia. Uma dose de antibiótico de 12 miligramas de cefotaxime em um ml de solução de glicose de 5% é dada intraperitoneal ao animal para protegê-lo do risco de infecção pós-operatória. Para alívio da dor após a cirurgia, a meloxicam analgésico, tipicamente 1 mg por kg de peso corporal é dada subcutânea ao animal, seguida de uma dose diária durante dois dias.

O animal é movido para uma gaiola de recuperação quente. O animal fica consciente dentro de 30 a 40 minutos e começa a se mover. O animal operado é mantido em isolamento até que as feridas cirúrgicas estejam completamente curadas, o que pode levar de três a quatro dias.

Para induzir ALF, 750 miligramas por kg de peso corporal de acetaminofeno e a segunda dose de meloxicam é injetada intraperitoneal 24 horas após o procedimento parcial de hepatectomia. Este regime de dose é repetido após 24 horas. Após a indução de ALF, a sobrevivência em animais foi severamente diminuída.

Para caracterizar o desenvolvimento da ALF, os animais operados foram eutanizados após segunda dose de acetaminofeno, e vários estudos bioquímicos e histológicos foram feitos. Os resultados são descritos no vídeo. O percentual de sobrevida no grupo induzido por ALF foi observado como severamente diminuído e observou-se até 80% de mortalidade dentro de 24 horas da segunda dose de acetaminofeno.

Os danos hepáticos foram aparentes em nível morfológico no grupo induzido pelo ALF e apenas 70% no grupo de hepatectomia parcial. Considerando que o grupo controle e apenas o grupo tratado de acetaminofeno apresentaram aparência saudável. Os níveis enzimáveis de alanina amino transferase, aspartate amino transferase e fosfattase alcalina foram encontrados altamente elevados no grupo induzido pela ALF em comparação com outros grupos.

A análise do perfil de expressão genética por qPCR mostrou expressão elevada de genes envolvidos na apoptose, inflamação e progressão da lesão hepática. A hematoxilina e a coloração de eosina de seções de tecido hepático revelaram principalmente hepatócitos normais no grupo controle. No grupo ALF, observou-se degeneração gordurosa macro vesicular moderada.

O tempo de protrombina e a razão normalizada internacional foram encontradas elevadas no grupo induzido pelo ALF, indicando o processo de coagulação sanguínea dificultado. A porcentagem de sobrevivência foi restaurada no grupo induzido pela ALF após o transplante de hepatócitos de ratos saudáveis sinagênicos. Níveis de soro de enzimas alanina amino transferase, aspartate amino transferase e fosfattase alcalina foram encontrados para serem restaurados em animais induzidos por ALF após o transplante celular.

Este método de induzir ALF em ratos é reprodutível, mostra boa reversibilidade e fornece uma janela de tempo adequada para testar novas terapias. Assim, este modelo pode servir como um modelo eficiente de doenças para avaliação de potenciais abordagens terapêuticas para tratar aLF.