Name: Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a induzir diferenciação nas linhagens celulares epiteliais mamárias murinas HC11 e EpH4 usando fatores de crescimento específicos. Este método permite estudar a relação entre diferenciação e transformação neoplásica em cultura tridimensional.

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A linha celular HC11 foi gentilmente fornecida pelo Dr. D. Medina (Houston, TX). Os autores são gratos ao Dr. Andrew Craig da Queen's University por muitos reagentes e sugestões valiosas. As células EpH4 foram um presente do Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick prestou excelente assistência técnica para estudos culturais 3D.
A assistência financeira do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), da Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontário Chapter), da Canadian Breast Cancer Research Alliance , os Centros de Excelência de Ontário, a Ação contra o Câncer de Mama Kingston (BCAK) e o fundo de legado Clare Nelson através de subsídios à LR são reconhecidos com gratidão. Be recebeu apoio de subvenção da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. A PTG é apoiada por um presidente de pesquisa do Canadá, Fundação Canadense para Inovação, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN foi apoiado por uma estudante do Terry Fox Training Program em Pesquisa Transdisciplinar de Câncer da NCIC, um prêmio de pós-graduação (QGA), e um Prêmio Reitor da Queen's University. Mg foi apoiado por bolsas de pós-doutorado do Programa de Câncer de Mama do Exército dos EUA, do Ministério da Pesquisa e Inovação da Província de Ontário e do Comitê de Pesquisa Consultiva da Universidade da Rainha. A VH foi apoiada por uma bolsa de doutorado da CBCF e uma bolsa de pós-doutorado do Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research em parceria com a CIHR. Hanad Adan foi o destinatário de uma estudante de verão da NSERC. BS foi apoiado por um prêmio de pós-graduação da Queen's University.

1. Plating HC11 Células
<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar usando técnicas estéreis prepare uma garrafa com 50 mL de meio celular HC11: RPMI-1640 com soro bovino 10% fetal (FBS), 5 μg/mL insulina e 10 ng/mL EGF (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Prato aproximadamente 400.000 células por 3 cm Placa de petri: Passe duas placas de Petri de 10 cm e 50% em vinte pratos de 3 cm no meio HC11. As células devem estar bem espalhadas, mas a secagem deve ser evitada.<ol>
<li>Aspirar o meio em um frasco usando uma bomba de vácuo.</li>
		<li>Adicione 250 μL de trippsina (ver Tabela de Materiais) por placa de 10 cm. Redemoinho e bata a placa das laterais, mantendo-a horizontal para espalhar a trippsina e desalojar as células anexadas</li>
		<li>Observe em fase de contraste microscopia com um objetivo de 4x para garantir que as células tenham começado a se desprender das bordas antes de encanar.</li>
		<li>Aspirar aproximadamente 1,5 mL de HC11 médio em uma pipeta pastelde estéril de 9 polegadas e esguichar-a verticalmente contra as células. Gire a placa de Petri enquanto esguicha para desalojar todas as células. Você deve trabalhar rápido para evitar a secagem das células.</li>
		<li>Transfira todas as células para a garrafa com o meio HC11 e redemoinho.</li>
		<li>Pipette 2 mL de suspensão celular em cada prato petri de 3 cm. Aça os pratos de Petri em sentido cruzado para se espalhar uniformemente. Coloque as células em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia seguinte, ou quando as células são ~90-100% confluentes, aspiram o meio, e substituam-no por meio por FBS e insulina, mas sem EGF.</li>
</ol>2. Indução de diferenciação, monitoramento e quantitação de células HC11
<ol><li>Depois de cultivar as células em média sem EGF por 24 h, adicione o meio de diferenciação (meio QUADRIL) a dez placas de 3 cm: RPMI-1640 complementado com 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortisona (ver Tabela de Materiais),5 μg/mL Insulin e 5 μg/mL Pactrolin (ver Tabela de Materiais) por até 10 dias.</li>
	<li>Mantenha as outras dez placas de 3 cm como controles: Mude para um meio com 10% de FBS e 5 μg/mL insulina sem EGF e HIP.</li>
	<li>Mude o meio a cada 2 a 3 dias para células e controles tratados com QUADRIL. Pipette o meio cuidadosamente para garantir que as células não se desapegom.</li>
	<li>Para monitorar a diferenciação (ou seja, a formação de cúpulas), observe as células microscopia de contraste de fase (Figura 1A, painel esquerdo). Se as células estiverem expressando proteína de fluorescência verde (GFP), observe microscopia de fluorescência (excitação = 485/20; emissão = 530/25; ampliação 240x; 20x objetiva) (Figura 1A, painel direito).</li>
	<li>Para quantificar o grau de diferenciação, extrair proteínas de uma placa de Petri cada uma das células e controles tratados com QUADRIL, uma vez por dia por um total de 10 dias e sondar manchas ocidentais para β-caseína (ver Tabela de Materiais)(Figura 1B).<ol>
<li>Raspe as células no gelo com soro lona tampão de fosfato frio de 1,5 mL (PBS) em um tubo de centrífuga de plástico de 1,8 ml.</li>
		<li>Pelotas as células a 350 x g, 1 min, 4 °C.</li>
		<li>Lave rapidamente a pelota 2x com PBS gelado. Escorra qualquer resíduo.</li>
		<li>Faça um tampão de lise: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 μg/mL aprotinina, 10 μg/mL leupeptin1. Adicione 100 μL por 3 cm placa petri.</li>
		<li>Esclareça o lysato por centrífuga em 10.000 x g por 10 min no frio.</li>
		<li>Determine a concentração de proteínas (ver Tabela de Materiais)e carregue 10-20 μg de proteína de cada amostra para um gel de poliacrilamida-SDS 10%.</li>
		<li>Eletroforese por 15 h a 45 V, ou a 100 V por ~2-2,5 h.</li>
		<li>Transfira para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF usando um aparelho de transferência de eletrocoagulante (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Bloqueie com 5% de albumina de soro bovino (BSA) em soro fixo tris com 0,1% Tween-20 (TBST).</li>
		<li>Adicione o anticorpo primário, a cabra anti-β-casein diluída 1:2.000 ou mouse anti-β actin diluído 1:1.000 (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Lave 3x com TBST, 5 min cada vez.</li>
		<li>Adicione o anticorpo secundário, peroxidase de rabanete (HRP) ligado ao burro anti-cabra diluído 1:2.500, ou anticorpo anti-rato ligado ao HRP diluído 1:10.000.</li>
		<li>Lave 3x com TBST, 5 min cada vez.</li>
		<li>Adicione reagentes eCL à membrana de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Revestimento e Crescimento 3D de Células EpH4 em Matriz EHS
NOTA: A matriz é líquida a temperaturas <10 °C e sólida a temperaturas acima. Loja a -80 °C. Descongele a 4 °C na noite anterior ao uso. Pré-esfrie as placas de cultura do tecido e as pontas de pipeta a -20 °C antes de manusear e manter as pontas de matriz, placas e pipette no gelo para evitar que se solidifique.
<ol><li>Cultivar células EpH4 em 2D em rpmi-1640 médio com 10% FBS e 5 μg/mL insulina (EGF não é necessário).</li>
	<li>Prepare o meio de crescimento EpH4 complementado com 10% (v/v, 3.500 μL) ou 20% (v/v 2.000 μL) em dois tubos cônicos de 50 mL. Mantenha o gelo até estar pronto para usar.</li>
	<li>Cubra 10 poços (1 cm2 cada) de uma placa de 24 poços com 150 μL de matriz não diluída. Espalhe a matriz usando uma dica de pipeta. Evite criar bolhas. Toque delicadamente nas laterais da placa enquanto a segura horizontalmente para garantir que a matriz seja distribuída uniformemente pela parte inferior do poço.</li>
	<li>Incubar a placa de 24 poços a 37 °C por 1h para permitir que a matriz se solidifique.</li>
	<li>Experimente as células EpH4 como descrito acima para as células HC11 e conte-as com um hemocímetro. Transfira 5 x 104 células por poço para um tubo de centrífuga círica cínica estéril de 1,5 mL e gire a 250 x g por 5 min.</li>
	<li>Atribua cuidadosamente o meio e coloque o tubo no gelo.</li>
	<li>Resuspender as células em 350 μL do meio de crescimento EpH4 complementado com matriz de 20% usando uma ponta de tubulata de 1 mL, mantendo o tubo cônico no gelo. Evite bolhas. É importante garantir uma suspensão de uma única célula.</li>
	<li>Uma vez que a matriz de camada inferior tenha se solidificado (a matriz deve parecer translúcida e mais leve em cores em comparação com o revestimento inicial dos poços), adicione os 350 μL de suspensão celular a cada poço revestido e coloque em uma incubadora de CO2 a 37 °C para ~1h para permitir que a camada matricial de 20% se solidifique.<ol>
<li>Observe as células microscopicamente em contraste de fase com um objetivo 4x. Células únicas devem ser visíveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo matriz de 10% em cima dos 350 μL de células suspensas em matriz de 20%. Incubar a 37 °C.</li>
</ol>4. Indução de diferenciação de células EpH4 cultivadas em 3D (Figura 2)
NOTA: Além da diferenciação, as células EpH4 também podem sofrer tubulogênese quando estimuladas com HGF (fator de crescimento hepatocito) na cultura 3D. Os crescimentos tubulares podem ser vistos após 10 dias de estimulação hip e HGF.
<ol><li>Comece a indução de diferenciação das células EpH4 1 dia após o revestimento na matriz. Remova cuidadosamente 150 μL do meio superior contendo matriz de 10% dos poços usando uma ponta de pipeta de plástico. Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo QUADRIL e matriz de 10%.</li>
	<li>Substitua o meio matrix-HIP de 10% a cada 2 dias por até 10 dias. Cresça células de controle no mesmo meio de matriz de 10% sem quadril.</li>
	<li>Monitore a formação da mamografia em contraste de fase(Figura 3A,painel inferior).</li>
</ol>5. Indução de tubulogênese de células EpH4 cultivadas em 3D (Figura 3A e 3C)
<ol><li>Prepare 24 placas de poço e células EpH4 para crescimento em matriz conforme detalhado nas etapas 3.1-3.9. No dia seguinte ao revestimento das células na matriz, remova 150 μL de médio EpH4 contendo 10% de matriz dos poços usando uma ponta de pipeta de plástico. Adicione 200 μL de médio EpH4 contendo 10% de matriz, QUADRIL e 20 ng/mL HGF (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Substitua o meio matriz/QUADRIL/HGF de 10% a cada 2 dias por até 12 a 14 dias.</li>
	<li>Monitorar a formação de túbulos microscopicamente usando um objetivo de 20x ou 40x (Figura 3A, painel direito).</li>
</ol>6. Quantitação da Diferenciação: Loteamento Ocidental para β-casein
<ol><li>Cuidadosamente pipette fora do meio 10% matrix-HIP dos poços. Enxágüe a camada matricial de 20% 2x com 350 μL de PBS gelado. Os esferoides ainda devem estar presentes na camada matricial.</li>
	<li>Adicione 700-1.000 μL de PBS gelado com 1 mM ácido etilenodiaminatetratetracético (EDTA) diretamente nos poços. Retire delicadamente a camada inferior da matriz de 100% do poço com uma ponta de pipeta para recuperar esferoides presentes nessa camada. Agite suavemente por 30 min a 4°C.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente a suspensão esferoide para um tubo cônico. Enxágüe os poços com ~500 μL de PBS-EDTA para recuperar quaisquer esferoides restantes nos poços e adicionar ao tubo cônico.</li>
	<li>Rocha no gelo por mais 30 min. Certifique-se de que a matriz se dissolveu completamente. Se os aglomerados de matriz visíveis forem vistos, adicione mais PBS-EDTA ou agite mais.</li>
	<li>Centrífuga a solução para pelotas os esferoides em 350 x g por 5 min.</li>
	<li>Aspirar o supernatant, lise os esferoides em tampão de lise gelada, e sonda para β-caseína, cyclin D1 e p120RasGAP por manchas ocidentais como na etapa 2.5 acimade 16. Como anticorpos primários, use cabra anti-β-casein diluída 1:2.000, o coelho anti-ciclina D1 diluído 1:2.000, e o rato anti-p120 diluído 1:2.000. Para anticorpos secundários, use o burro anti-cabra ligado ao HRP diluído 1:2.500, o burro ligado ao HRP anti-coelho diluído 1:2.500, e o anti-rato ligado ao HRP diluído 1:10.000.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos para divulgar.

As células HC11 são idealmente adequadas para o estudo da diferenciação em conjunto com a transformação neoplástica. Uma vantagem adicional é que as células HC11 são facilmente infectáveis com vetores retrovirais baseados em Mo-MLV para expressar uma variedade de genes. Em nossas mãos, as células EpH4 eram mais difíceis de infectar com os mesmos vetores retrovirais do que o HC112.
Contato celular-celular e prisão de crescimento são pré-requisitos fundamentais para difer...

Em tecidos normais ou tumores, as células têm extensas oportunidades de adesão aos seus vizinhos em uma organização tridimensional, e isso é imitado na cultura pelo crescimento celular de alta densidade. A adesão celular-célula é mediada principalmente através de receptores de cadherina, que definem arquitetura celular e tecidual. Curiosamente, foi demonstrado recentemente que os cadherins também desempenham um papel poderoso na transdução de sinais, especialmente na sinalização de sobrevivência1. Paradoxalmente, alguns desses sinais de adesão celular-célula emanando de cadherins foram recentemente encontrados para serem compartilhados tanto pela diferenciação quanto pela neoplasia2. Aqui, descrevemos métodos de indução e avaliação da diferenciação em dois tipos representativos de linhas celulares epiteliais do peito do camundongo, HC11 e EpH4.
A linha de células epiteliais do camundongo HC11 pode fornecer um modelo útil para o estudo da diferenciação celular epitelial. As células HC11 são uma linha celular derivada comma-1D, originária da glândula mamária de um rato Balb/c grávidamédia 3. Em contraste com outros clones derivados COMMA-1D, o clone do HC11 não tem exigência para matriz extracelular exógena adicionada ou cocultivo com outros tipos de células para a indução in vitro do gene de β-casein endógeno por hormônios lactogênicos3. Esta linha celular tem sido amplamente utilizada em estudos de diferenciação porque manteve características importantes do epitélio mamário normal: as células HC11 podem reconstituir parcialmente o epitélio ductal em uma almofada de gordura mamária limpa4. Além disso, eles podem diferenciar em uma cultura bidimensional (2D) quando cultivadas para confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico na presença de um esteroide como h ydrocortisona ou Dexamethasone, além de Insulin e Prolactin (meio HIP) sem fator de crescimento epidérmico (EGF), um inibidor de diferenciação5,6,7. Nessas condições, as células HC11 produzem proteínas lácteas, como β-caseína e WAP, que são detectáveis pela coagulação ocidental dentro de 4 dias após a indução. Ao mesmo tempo, uma parte das células HC11 forma estruturas rudimentares de glândulas mamárias denominadas "cúpulas" de forma estocástica. As cúpulas são visíveis de 4 a 5 dias após a indução e aumentam gradualmente de tamanho até o dia 10, concomitantes com um aumento na produção de β-casein8. Curiosamente, as células HC11 possuem mutantes p539, e, portanto, representam um estado préneoplástico. Por essa razão, o modelo HC11 é ideal para estudar redes de sinalização de diferenciação em conjunto com a neoplasia no mesmo sistema celular.
As células EpH4, um derivado das células IM-2, são uma linha celular não tumorigênica originalmente derivada de células epiteliais de glândula mamárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida10. As células EpH4 formam monocamadas epiteliais contínuas na cultura 2D, mas não se diferenciam em estruturas semelhantes a glandular10,11. No entanto, após o crescimento 3D em um material composto por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma do camundongo EHS12 (matriz, matriz ou Matrigel, ver Tabela de Materiais),além de estimulação com quadril, as células EpH4 podem recapitular os estágios iniciais da diferenciação da glândula mamária. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides (também chamados de mamografias) que exibem polaridade apical-basal e um lúmen oco, e são capazes de produzir as proteínas do leite β-caseína e WAP, semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes. Ao contrário das células HC11, que são indiferenciadas, e algumas expressam marcadores mesenquimicos13,as células EpH4 exibem uma morfologia puramente luminal14. As células EpH4 também foram relatadas para produzir proteínas leiteres na cultura 2D através da estimulação com dexametasona, insulina e prolactina15. No entanto, essa abordagem impede o estudo de efeitos regulatórios que imitam o microambiente da glândula mamária na cultura 3D.

<table><tbody><tr><td>30% de acrilamida / 0,8% de solução Bis</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-ciclina D1</td><td>anticorpo coelho, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-p120</td><td>camundongo, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; camundongo com anticorpos de actina</td><td>, tecnologia de sinalização celular</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; cabra do anticorpo da caseína</td><td>, biotecnologia de Santa Cruz</td><td>sc-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>tampão da lise</td></tr><tr><td>Solução do ácido de Bicinchoninic Sigma</td><td></td><td>B9643-1L-KC</td><td></td></tr><tr><td>Albumina do soro bovino</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Pureza da determinação da proteína</td></tr><tr><td>Carcaça ocidental de ECL</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Determinação de proteína</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Meio para Células HC11 Soro</td></tr><tr><td>de bezerro fetal</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>Meio de Cultura de Células</td></tr><tr><td>Cabra - Anti Coelho-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hepatócitos Fator de Crescimento recombinante</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Cavalo de Cultura de Células</td></tr><tr><td>Anti-Mouse HRP</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Insulina média</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP</td></tr><tr><td>Medium Laminar-flow hood</td><td>BioGard Hood</td><td></td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Lysis</td></tr><tr><td>Buffer Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td> <td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr>Reagente <td></td> ocidental de Mowiol 4-88 de Santa Cruz <td>sc-8360</td> de <td>Santa Cruz</td>da <td>Anti-cabra HRP do rato</td></tr><tr><td></td><td>, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>que colore</td></tr><tr><td>o microscópio confocal do Multi-fotão</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>bio</td><td>tampão</td>Na4P207 Sigma 125F-0262 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>da lise da loja SOV850Tampão de lise</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Nikon câmera digital</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulose</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher Microscópio de</td> contraste de fase <td>de coloração</td>científico <td>30525-89-4</td></tr><tr><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td><td>Cultura</td></tr><tr><td>de células Fluoreto de fenilmetilsufonil</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Tampão de lise</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolactina</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Médio</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Célula Meio de cultura</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos-24 bem</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de Transferência de Cultura de Células</td><td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Bio Shop</td><td>TRA222.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese em gel verítico</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blotting</td></tr></tbody></table>

diferenciação das células epiteliais do peito do camundongo hc11 e eph4

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins desempenham um papel importante na regulação da diferenciação celular, bem como da neoplasia. Aqui descrevemos as origens e métodos da indução da diferenciação de duas linhas de células epiteliais do peito de camundongo, HC11 e EpH4, e seu uso para estudar estágios complementares de desenvolvimento de glândulas mamárias e transformação neoplástica.
A linha de células epiteliais do camundongo HC11 originou-se da glândula mamária de um rato Balb/c grávida. Diferencia-se quando cultivado à confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico em meio contendo soro fetal de bezerro e ydrocortisona H, insulin e Prolactin (meio QUADRIL). Nessas condições, as células HC11 produzem as proteínas de β-caseína e soroácido soro (WAP), semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes, e formam estruturas rudimentares de glândulam mamárias denominadas "cúpulas".
A linha celular EpH4 foi derivada de células epiteliais de glândula samárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida. Ao contrário do HC11, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente em esferoides (também chamados de mamografias) quando cultivadas condições tridimensionais (3D) de crescimento no meio HIP. As células são trippsinizadas, suspensas em uma matriz de 20% composta por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma de camundongos Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), banhadas em cima de uma camada de matriz concentrada que reveste uma placa de Petri de plástico ou placa multiwell, e coberta com uma camada de 10% de matricial contendo meio HIP. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides ocos que exibem polaridade apical-basal, um lúmen oco, e produzem β-caseína e WAP.
Utilizando essas técnicas, nossos resultados demonstraram que a intensidade do sinal cadherin/Rac é fundamental para a diferenciação das células HC11. Embora rac1 seja necessário para diferenciação e baixos níveis de RacV12 ativado aumentam a diferenciação, altos níveis de RacV12 bloqueiam diferenciação ao induzir neoplasia. Em contraste, as células EpH4 representam um estágio anterior na diferenciação epitelial mamária, que é inibida por níveis ainda baixos de RacV12.

Há muito se sabe que a diferenciação de células epiteliais e adipócitos requer confluência e engajamento de cadherins2. Nós e outros demonstramos que a adesão celular-célula e o engajamento de E- ou N-cadherin e cadherin-11, como ocorre com a confluência das células cultivadas, desencadeia um aumento dramático na atividade do pequeno GTPases Rac e da proteína de controle da divisão celular 42 (Cdc42), e esse processo leva à ativação de citocinas familiares interleucinas-6 (IL6) e Stat3 (transdutor...

Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

As células HC11 e EpH4 são linhas de células epiteliais de mama do rato que podem se diferenciar na cultura. Ao mesmo tempo, essas células podem ser transformadas por uma série de oncogenes. Essas células são ideais para o estudo da inter-relação entre diferenciação e transformação neoplásica.Essas técnicas podem ser usadas em estudos de transdução de sinais para descobrir alvos para a terapia do câncer. Por exemplo, o pequeno GTPase Rac e outras moléculas podem desencadear a transformação de células epiteliais mamárias quando expressas em níveis elevados, mas surpreendentemente em níveis baixos, elas podem induzir diferenciação. Outros transdutores de sinal podem se comportar de maneira semelhante.Os princípios podem se aplicar a outros tipos de diferenciação, bem como onde a confluência celular desempenha um papel importante, por exemplo, a diferenciação de adipócitos ou miotubes. Alguém que execute essa técnica pela primeira vez deve ter em mente que o revestimento das células HC11 é importante. Isso porque o contato celular-celular é importante para a diferenciação.Outro ponto a ser observado é que a extração adequada de células EpH4 da matriz é fundamental para a quantitação proteica, pois quaisquer resíduos afetarão a determinação da proteína. A demonstração visual deste método é útil porque alguns detalhes do protocolo são difíceis de descrever no papel. Comece preparando uma garrafa de 50 mililitros de meio celular HC11 de acordo com as instruções do manuscrito.Para emplacar as células, aspire o meio a partir de cinco placas petri 50% confluentes de seis centímetros e lave as células com aproximadamente 1,8 mililitros de trippsina usando uma pipeta Pasteur plugada de algodão de nove polegadas estéril. Em seguida, adicione 200 microliters de trippsina por placa e gire a placa para desalojar as células anexadas. Observe as células em fase de microscopia de contraste com um objetivo 4X para garantir que elas começaram a se desalojar.Em seguida, aspire aproximadamente 1,5 mililitros de meio HC11 com uma pipeta Pasteur estéril de nove polegadas e esguichar verticalmente contra as células enquanto gira o prato certificando-se de evitar respingos. Transfira todas as células para a garrafa com meio HC11 e redemoinho para dispersar uniformemente na garrafa. Em seguida, aliquot a suspensão celular em 20 placas de Petri de três centímetros, pipetando dois mililitros de células por prato.Balance as placas de Petri para espalhar as células e incuba-las a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, quando as células estiverem 90 a 100% confluentes, aspire o meio e substitua-o por médio por FBS, mas sem EGF. Depois de cultivar as células em médio sem EGF por 24 horas, adicione o meio de diferenciação a 10 pratos e cresça as células por até 10 dias mantendo os outros 10 pratos como controles.Troque o meio a cada dois ou três dias com células tratadas e controladas pelo HIP. Para monitorar a diferenciação, observe as células com microscopia de contraste de fase. Use microscopia de fluorescência se as células estiverem expressando proteína fluorescente verde.Além disso, quantifique o grau de diferenciação extraindo proteínas das células tratadas e controladas pelo HIP uma vez por dia e realizando a análise do Western Blot. Reúna e coloque o meio de crescimento EpH4, a matriz EHS, e dois tubos cônicos de 50 mililitros no gelo. Prechill as placas de cultura tecidual com pontas de pipeta a menos 20 graus Celsius e prepare o meio de crescimento EpH4 complementado com matriz de 10 ou 20% em dois tubos cônicos de 50 mililitros e mantê-los no gelo até estar pronto para usar.Depois de recuperar as placas de cultura de tecido pré-estilhaçadas a menos 20 graus Celsius, cubra 10 poços da placa de 24 poços com 150 microliters de matriz não diluída espalhando a matriz com uma pipeta. Evite criar bolhas ao espalhar a matriz. Em seguida, bata suavemente nas laterais da placa e incubar a placa a 37 graus Celsius durante uma hora para permitir que a matriz se solidifique.Enquanto isso, prepare-se para a diferenciação, experimentando as células EpH4, bem como descrito anteriormente e garantindo suspensões de células únicas após a ressuspensão de células experimentpsinizadas. Em seguida, conte as células em suspensão com um hemótmetro. Transfira cinco vezes 10 para as quatro células por poço para um tubo de centrífuga cônica estéril de 1,5 mililitro e gire-os a 250 vezes g por cinco minutos.Aspire cuidadosamente o meio supernante e coloque o tubo no gelo. Use uma ponta de pipeta de um mililitro para resuspensar as células em 350 microliters de meio de crescimento EpH4 complementados com matriz de 20%, mantendo os tubos no gelo certificando-se de evitar bolhas. Uma vez que a camada inferior tenha se solidificado, adicione os 350 microliters de suspensão celular a cada poço revestido e coloque-o em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora para permitir que a camada de matriz de 20% se solidifique.Observe as células com microscopia de contraste de fase para garantir que as células únicas sejam visíveis. Em seguida, adicione 200 microliters de meio EpH4 com matriz de 10% em cima e incubar a placa a 37 graus Celsius. Comece a indução de diferenciação um dia depois de emplacar as células na matriz.Remova cuidadosamente 150 microliters de meio de matriz superior de 10% e adicione 200 microliters de meio EpH4 contendo HIP e matriz de 10% e para controles adicione um meio de matriz de 10% sem HIP. Substitua o meio a cada dois dias por até 10 dias monitorando a formação da mamografia por microscopia de contraste de fase. Para quantificar a diferenciação, pipeta cuidadosamente fora do meio HIP de matriz de 10% dos poços e enxágue a camada de matriz de 20% com 350 microliters de PBS gelado.Em seguida, adicione 70 a 100 microliters de PBS gelado com um EDTA milimola diretamente nos poços e desprende suavemente a camada inferior de matriz de 100% com uma ponta de pipeta. Agite a placa suavemente a quatro graus Celsius por 30 minutos. Transfira cuidadosamente a suspensão esféide para um tubo cônico e enxágue os poços com 500 microliters de PBS EDTA para recuperar quaisquer esferoides restantes.Balance o tubo no gelo por mais 30 minutos, certificando-se de que a matriz se dissolve totalmente. Se forem vistas aglomerações de matriz visível, adicione mais PBS EDTA ou agite mais tempo. Centrifugar a solução a 350 vezes g para pellet os esferoides.Em seguida, aspire o supernasciente, lise os esferoides, e teste as células para beta-caseína, cíclin D1 e p120RasGAP por manchas ocidentais. Há uma dependência impressionante da diferenciação sobre a força do sinal Rac nas células HC11. Enquanto crac1 endógeno é necessário para diferenciação e baixos níveis de RacV12 ativados mutacionáriamente causam um aumento na capacidade de diferenciação, altos níveis de RacV12 desencadeiam um bloco de diferenciação e induzem neoplasia.Quando as propriedades de diferenciação das células EpH4 foram exploradas em uma cultura de matriz 3D, descobriu-se que a produção de beta-caseína atingiu o pico de oito a dez dias e a expressão cyclin D1 foi máxima em quatro a seis dias após a estimulação do QUADRIL. Para determinar o posicionamento de células individuais, elas foram manchadas com DAPI e imagens com microscopia confocal. A morte celular interna e a formação de lúmens ocos foram observadas nas mammosféricas, enquanto a adição de HGF resultou na formação de estruturas tubulares.Alguém que execute essa técnica pela primeira vez deve ter em mente que o revestimento das células HC11 é importante. Também a extração adequada das células EpH4 da matriz é fundamental para a quantitação proteica, pois quaisquer resíduos afetarão a determinação da proteína. Esta técnica pode ser usada para investigar outros transdutores de sinal que podem se comportar de forma semelhante.Se houver mutações de driver em um câncer, então sua inibição completa não será necessária, uma vez que baixos níveis restantes realmente induziriam a diferenciação.

differentiation-of-mouse-breast-epithelial-hc11-and-eph4-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

HC11 lactogênica diferenciação pode ser caracterizada pela formação de estruturas de cúpula referido como mammospheres. As estruturas podem ser enumerados por microscopia de contraste de fase para ajudar a quantificar a diferenciação lactogênese.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

Um método simples é descrita para analisar os efeitos da fibroblastos de tecido em associadas células epiteliais. A combinação deste método eo tridimensional de cultura de tecido pode facilitar a análise das células após o isolamento a partir de 3D. A técnica é aplicável a células de diferentes potencial maligno, permitindo estudo sistemático dos efeitos de estroma associado ao tumor em células tumorais.

Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

Um método para processar o material de descarte mamária humana cirúrgico é descrito. Tecido transformado, sob a forma de Organóides, podem ser armazenadas congeladas indefinidamente ou colocadas em cultura para crescimento a longo prazo. Este método permite a análise experimental da biologia celular epitelial humana normal, e os efeitos das perturbações exógenas.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Nos últimos anos, a formação de células germinativas, utilizando métodos de cultura in vitro tem sido demonstrada utilizando vários tipos diferentes de células estaminais somáticas. Este artigo irá apresentar visualmente a diferenciação de células-tronco derivadas de células de rato recém-nascidos oócito-como iniciais.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Um modelo ideal para estudar a biologia de células-tronco adultas é o folículo piloso de camundongo. Aqui apresentamos um protocolo para isolar diferentes populações de folículos pilosos, células-tronco e queratinócitos epidérmicos, empregando digestão enzimática da pele dorsal de camundongos seguida de análise FACS.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Os organóides da próstata do rato representam um contexto prometedor para avaliar os mecanismos que regulam a diferenciação. Este artigo descreve uma abordagem melhorada para estabelecer organóides da próstata e introduz métodos para (1) coletar lysato de proteína de organóides e (2) corrigir e manchar organóides para microscopia confocal de montagem inteira.

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

O presente estudo relata um protocolo mais fácil, que economiza tempo e é econômico para isolar e cultivar com eficiência células epiteliais mamárias humanas primárias (HMECs) a partir de pequenas quantidades de tecido mamário. Este protocolo é adequado para produzir rapidamente HMECs primários, tanto para aplicações laboratoriais quanto clínicas.

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Aprenda a induzir diferenciação nas linhagens celulares epiteliais mamárias murinas HC11 e EpH4 usando fatores de crescimento específicos. Este método permite estudar a relação entre diferenciação e transformação neoplásica em cultura tridimensional.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

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