Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Micro-Aspiração Celular Única é um método para complementar as diferentes técnicas utilizadas no campo da microbiologia em geral e na virologia em particular. Ele poderia responder a perguntas-chave e resolver problemas encontrados durante o isolamento de vírus gigantes, separando um vírus de uma mistura viral apresentando um vírus de baixa abundância, pois foi o caso de vírus de volume de negócios, vírus clandisinal e vírus uzibati de outro, que é o Faustovírus, presente em alta abundância de qualquer maneira. A principal vantagem dessa abordagem é o uso de uma estratégia indireta.

Consiste em separar e clonar o hospedeiro infectado para obter uma separação viral. Assim, este método monitora os diferentes passos desde a captura até a liberação de células e confirma o processo de classificação por observação microscópica. Finalmente, a biologia molecular é usada para confirmar a classificação e a microscopia eletrônica para observar as partículas virais separadas.

Essa abordagem resolverá o grande problema da separação do vírus. É uma perspectiva para clonagem de ameba ou clonagem de protistas em geral. A pessoa que está tentando usar essa técnica pela primeira vez deve ser rigorosa e precisa ao controlar a pressão.

O controle visual é essencial para confirmar a captura e a liberação de apenas uma célula. Use Vermamoeba Vermiformis, cepa CDC 19, como suporte celular. Adicione 30 mililitros de pyg médio e três mililitros da ameba em uma concentração de uma vez dez para a sexta células por mililitro em um frasco de cultura celular de 75 centímetros quadrados.

Mantenha a cultura a 28 graus Celsius em uma incubadora. Após 48 horas, transfira 10 mililitros da cultura da célula ameba para um slide de contagem e coloque-o sob um microscópio para quantificar a ameba. Para enxaguar, colher 30 mililitros da cultura celular em um tubo e pelotar a ameba por centrifugação a 720 vezes G por 10 minutos.

Remova o supernasce e resuspenda a pelota no volume apropriado do meio de fome para obter a concentração de uma vez 10 a sexta células por mililitro. Prepare o suporte celular com a adição de agente antimicrobiano. Em um armário de biossegurança, adicione uma vez 10 a 6 da cultura ameba em dois mililitros de meio de fome.

Em seguida, inocular 100 mililitros da solução de estoque contendo a mistura de vírus na cultura amebae cell support em uma multiplicidade de infecção de 0,01. Incubar o suporte de cultura de células de ameba infectadas. Adicione 30 graus Celsius por 10 a 14 horas ou até que os efeitos citopáticos sejam induzidos, como arredondamento de amebal ou lise.

Em seguida, use uma seringa para coletar a mídia e filtrar através de um filtro de cinco mícrons para remover detritos celulares. Realize uma diluição de cereais da amostra viral em meio de fome em diferentes poços. Inocular dois mililitros de uma vez 10 a o sexto Vermamoba Vermaformis contidos em cada placa de Petri com 100 mililitros da mistura inóculo.

Em seguida, coloque as placas de Petri em um saco plástico vedado a 30 graus Celsius. Às seis horas após a infecção, observe as placas de Petri com microscopia óptica invertida e verifique a morfologia celular a cada quatro a oito horas. O tratamento antimicrobíário é para o suporte celular.

Selecione entre os pratos de Petri os ausentes de qualquer contaminação visual por agentes fúngicos e bacterianos e com evidências de efeito citopático da ameba devido aos vírus e com pré-lise e fase de arredondamento da ameba para evitar aspiração de partículas virais. Configure uma estação de trabalho com micro manipulador, dispositivo de pressão de controle manual, microscópio invertido, módulos Plug and Play Motor, câmera e módulo de computador. Escolha um micro capilar de 20 mícrons de diâmetro interno para permitir a manutenção de uma posição interna e uma liberação fácil da célula.

Fixar o ângulo de operação do sistema de aperto no módulo motorizado a 45 graus. Realize uma instalação dupla, primeiro no sistema de agarramento e depois no micro capilar. Concentre-se nas células.

Para clonar células, coloque a placa de Petri contendo dois mililitros de ameba infectada sob o microscópio. Concentre-se primeiro nas células e depois no micro capilar imerso na cultura. Escolhendo célula única arredondada e aproxime o micro capilar do micromanipulador.

Exerça aspiração suave com controle manual de pressão sobre a célula levando-a dentro do micro capilar Remova a célula única da primeira amostra e solte-a no suporte de cultura celular da amebae. Em seguida, incubar-lo a 30 graus Celsius. Controle cuidadosamente a pressão para ser capaz de aspirar uma única célula e controlar sua aspiração pela observação da liberação de uma única célula.

Realizar observações diárias com um microscópio óptico invertido para observar o aparecimento das células e monitorar o surgimento do efeito citopático. Agora, opere um sistema de extração automatizado para extrair DNA de parte das amostras de cultura positiva onde um efeito citopático é observado. Projete primers para amplificar genes pobres anotados como RBP2 para Faustovírus, proteína capsid principal para Usurpatvirus, e proteína capsid menor para Clandestinovirus.

Execute o PCR padrão usando um termociclador de acordo com o manuscrito. Realize 20 microliters de reações pcr com 50 micromolar de cada primer, 1X Master Mix e água livre de ribonuclease. Execute os produtos PCR com mancha de gel de DNA em um gel de 1,5% agarose na voltagem de 135 volts e visualize com UV. Este protocolo otimiza um processo de micromanipulação com micro aspiração unicelular.

Esta técnica permite a captura de uma ameba arredondada e infectada e sua liberação em uma nova placa contendo ameba não infectada. Esta abordagem isolou com sucesso um novo vírus gigante de baixa abundância chamado Userpatvirus LCD7. Seu Userpatvirus só foi observado no clone sete com presença de DNA LCD7 do Userpatvirus e ausência de DNA Faustovírus.

A microscopia eletrônica revelou o aparecimento do Clandestinovirus ST1, que tem uma morfologia icosaedral típica sem fibrilas, bem como o Usurpatvirus LCD7 com um capsídeo icosaedral de cerca de 250 nanômetros. A baixa citometria confirma a sobreposição de populações de Faustovírus e Nauvoirus. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito facilmente.

O mais importante a ser lembrado ao tentar esse procedimento é a necessidade de um ritual mínimo de observações sobre o tamanho das entidades com o bom manuseio do competente da estação de trabalho e a verificação de qualquer problema de contaminação. Esta abordagem pode ser usada como uma técnica de classificação com base na morfologia celular. Atualmente é usado em nosso laboratório para a clonagem de ameba específica.

Um ponto crítico dessa técnica é manter a integridade celular. Na verdade, podemos ter alguns problemas com a não observação da célula ou liberação. Isso se deve principalmente à desintegração da célula no micro capilar.

Este método pode ser uma alternativa eficiente quando a telemetria de falhas e a classificação de fatos não estão disponíveis e quando limitações técnicas específicas são alcançadas. Não se esqueça que em alguns casos a célula não é liberada do micro capilar. Isso se deve, em parte, às características da amebae e à sua capacidade de adaptação e, em seguida, da membrana celular.