Name: Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de micro-aspiração de célula única para isolar vírus gigantes de baixa abundância usando Vermamoeba vermiformis. Este método avança o isolamento viral em virologia.

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Os autores gostariam de agradecer a Jean-Pierre Baudoin e Olivier Mbarek por seus conselhos e Claire Andréani por sua ajuda em correções e modificações em inglês. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Estado francês gerida pela Agência Nacional de Investigação no âmbito do programa "Investissements d'avenir (Investimentos para o Futuro)" com a referência ANR-10-IAHU-03 (Infecção méditerranée) e por Région Provence Alpes Côte d'Azur e financiamento europeu FEDER PRIMI.

1. Cultura ameba
<ol><li>Use vermiformis de Vermamoeba (tensão CDC19) como uma sustentação da pilha.</li>
	<li>Adicione 30 mL de protease-peptone-levedura extrato-glicose médio (PYG) (Tabela 1) e 3 mL da amebae em uma concentração de 1 x 106 células / mL em um frasco de cultura de 75 cm2 células.</li>
	<li>Mantenha a cultura a 28 °C.</li>
	<li>Após 48 h, quantificar a amebae usando lâminas de contagem.</li>
	<li>Para enxaguar, colher as células a uma concentração de 1 x 106 células/mL e pelota a amebae por centrífuga a 720 x g por 10 minutos. Retire o supernatant e resuspenda a pelota no volume apropriado de meio de fome para obter 1 x 106 células/mL (Tabela 1).</li>
</ol>2. Propagação do vírus de estoque na amebae
Nota: Antes da diluição, é importante a cultura da amostra de estoque para obter bastante cultura fresca, a seguir prossiga à filtragem.
<ol><li>Use 1 x 106 da cultura da ameba no meio da inanição.</li>
	<li>Inocular a mistura de vírus emitidos a partir da solução de estoque (Faustovirus / Usurpativirus LCD7 ou Faustovirus / Clandestinovirus ST1) após o processo de co-cultura sobre o suporte celular em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01. Nota: O MOI é importante para reduzir a abundância da população viral principal e o número de pilhas contaminadas.</li>
	<li>Incubada a 30 °C até que os efeitos citopáticos (CPE) sejam induzidos, como arredondamento de amebal ou lyse, aproximadamente 10 a 14 h após a infecção.</li>
	<li>Colete a mídia e filtrar através de um filtro de 5 μm para remover detritos celulares.</li>
</ol>3. Diluição do ponto final
<ol><li>Realizar uma diluição em série (10-1 a 10-11)da amostra viral em meio de fome (Tabela 1).</li>
	<li>Inoculate 2 mL de 1 x 106 Vermamoeba vermiformis contidos em cada placa de Petri com 100 μL do inoculum da mistura.</li>
	<li>Coloque as placas de Petri em um saco plástico selado a 30 °C.</li>
	<li>Comece a observar as placas de Petri com microscopia óptica invertida em 6 h pós-infecção e verifique a morfologia celular a cada 4 a 8 h.</li>
	<li>No aparecimento do efeito citopático caracterizado por células de arredondamento, iniciar o processo de micro-aspiração de célula única.</li>
</ol>4. Micro-aspiração unicelular
<ol><li>
Prepare o anfitrião. NOTA: Esta preparação é feita para a liberação de células únicas infectadas para um suporte de células frescas.<ol>
<li>Trate a amebae na cultura com um agente antimicrobiano contendo 10 μg/mL de vancomycin, 10 μg/mL de imipenem, 20 μg/mL de ciprofloxacina, 20 μg/mL de doxiciclina e 20 μg/mL de voriconazole. Esta mistura é usada para evitar a contaminação bacteriana e fúngica. Nota: O procedimento ocorre em um banco fora da estação de segurança microbiológica. Adicione 2 mL de amebae concentrada em 1 x 106 células/mL cada uma em 15 placas de Petri. Para a adesão à ameba, incubar a cultura a 30 °C por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione a placa de Petri usada para a micro-aspiração a partir da diluição limite de acordo com os seguintes critérios: 1) ausência de qualquer contaminação visível por agentes fúngicos e bacterianos, 2) evidência de efeito citopático de amebae devido aos vírus, e 3) prelíse e fase de arredondamento da amebae (para evitar a aspiração de partículas virais).</li>
	<li>
Configure uma estação de trabalho com os seguintes materiais (ver Figura 1A,B): Micromanipulador, que permite o posicionamento microcapilar; Dispositivo manual da pressão do controle, usado para aspirar e liberar as pilhas no microcapillary; Microscópio invertido; Conecte e jogue módulos motores; Câmera; Módulo de computador para visualizar a manipulação e tirar fotos.</li>
	<li>Escolha um microcapilar (ver Figura 1C). Nota: O tamanho das células, a deformação e a adesão de suas membranas às superfícies, e a motilidade celular podem afetar o progresso suave da micro-aspiração. O diâmetro microcapilar pode ser escolhido e adaptado com precisão a tipos específicos de células, dependendo de seus tamanhos e métodos de aspiração. Um microcapilar de 20 μm de diâmetro interno foi usado para aspirar uma ameba de arredondamento (diâmetro ~10 μm). Isso permite a manutenção de uma posição interna e uma liberação fácil da célula.</li>
	<li>
Monte o sistema.
	<ol>
<li>Corrija o ângulo operacional do sistema de aperto no módulo motorizado a 45°.</li>
		<li>Realize uma instalação dupla, primeiro no sistema emocionante, e depois no microcapilar.</li>
		<li>Concentre-se nas células depois de executar algumas gotas de óleo através do microcapilar. Nota: O óleo mineral com compatibilidade biológica é fornecido pelo dispositivo.</li>
		<li>Complete a montagem seguindo as recomendações do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Células clonadas (ver Figura 2A,B). NOTA: Este procedimento é semelhante ao descrito por Fröhlich e König31.<ol>
<li>Coloque a placa de Petri contendo 2 mL de amebae infectada o microscópio.</li>
		<li>Concentre-se primeiro nas células e, em seguida, no microcapilar imerso na cultura.</li>
		<li>Escolha uma única célula arredondada e aproxime o microcapilar do micromanipulador.</li>
		<li>Exerça a aspiração suave com controle manual de pressão sobre a célula, levando-o para dentro do microcapilar. Retire a única célula da primeira amostra e libere no suporte celular e, em seguida, incuba-a a 30 °C.</li>
		<li>Realizar observações diárias com um microscópio óptico invertido para observar o aparecimento das células e monitorar o surgimento do efeito citopático.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Triagem PCR
Nota: Após a etapa 4, uma triagem sistemática por PCR é crucial para confirmar a separação. Tanto no Usurpativirus/Faustovirus quanto no Clandestinovirus/Faustovirus, o projeto e a aplicação dos sistemas específicos de primer e sonda foram feitos usando primer-BLAST online32 (Tabela 2).
<ol><li>Extrato DNA de uma parte das amostras de cultura positiva (ou seja, onde um efeito citopático é observado), usando um sistema de extração automatizado de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Use primers apropriadamente projetados. Nota: Aqui nós projetamos primers para amplificar genes do núcleo anotados como RpB2 (Faustovirus), proteína capsid principal lcd7 (usurpatvirus) e proteína capsid menor (Clandestinovirus)</li>
	<li>
Executar PCR padrão usando um termociclor.
	<ol>
<li>Realize 20 reações μL PCR com 50 μM de cada primer (Tabela 2),1x Master Mix e RNase água livre.</li>
		<li>Ative o DNA Taq polymerase por 5 min a 95 °C, em seguida, siga com 45 ciclos de desnaturação de 10 s a 95 °C, annealing das primers para 30 s em 58 °C, e extensão para 30 s em 72 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executar os produtos PCR em um gel agarose 1,5%, mancha com mancha de gel de DNA(Tabela de Materiais),e visualizar com UV.</li>
</ol>6. Produção e purificação de vírus
<ol><li>Coloque o resto da cultura da placa de Petri de volta em um pequeno frasco.</li>
	<li>Para a produção do vírus, prepare 15 frascos de 145 cm2,contendo 40 mL de vermiformese Vermamoeba em meio de fome e 5 mL do vírus isolado já transferido da placa de Petri para pequenos frascos.</li>
	<li>Trate com a mesma mistura antibiótica e antifúngica usada na etapa 4.1.</li>
	<li>Incubar a 30 °C. Observe todos os dias com microscopia óptica invertida.</li>
	<li>Após a infecção completa, piscina todos os frascos. Use um filtro de 0,45 μm para eliminar detritos.</li>
	<li>Ultracentrifuge todas as supernatantes a 50.000 x g por 45 min.</li>
	<li>Após a centrífugação, retire o supernatant de cada tubo por aspiração e resuspenda a pelota em 1 mL de soro fisiológico amortecida de fosfato (PBS).</li>
	<li>Purificar o vírus produzido com 25% de sacarose (27,5 g de sacarose em 100 mL de PBS, esterilizado por filtragem).</li>
	<li>Centrífuga 8 mL de sacarose e 2 mL da suspensão viral em 80.000 x g por 30 min. Resuspende a pelota viral em 1 mL de PBS. Guarde-o a -80 °C.</li>
</ol>7. Microscopia eletrônica negativa da coloração e da transmissão
Nota: Bou Khalil et al. publicaram anteriormente este protocolo27.
<ol><li>Deposite 5 μL da lysis supernatant na grade glow-discharged. Deixe por aproximadamente 20 min à temperatura ambiente. Nota: A descarga de brilho nos permite obter uma grade hidrofílica por aplicação de plasma.</li>
	<li>Seque a grade com cuidado e deposite uma pequena queda de 1% de molybdate de amônio por 10 s. Deixe a grade para secar por 5 min.</li>
	<li>Siga para observações de microscopia eletrônica a 200 keV.</li>
</ol>8. Caracterização do Clandestinovirus ST1 e usurpativirus LCD7
<ol><li>Caracterizar populações puras de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7 usando sequenciamento do genoma, montagem do genoma, análises de bioinformática e estudo de seu ciclo replicativo como fizemos para outros vírus10,20, 29.</li>
</ol>

<ol><li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li>
<li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Giant+Virus+in+Amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033(2003).</li>
<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum%2C+a+new+30%2C000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285(2018).</li>
<li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166(2018).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus%2C+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus%2C+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300(2016).</li>
<li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372(2018).</li>
<li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li>
<li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76(2016).</li>
<li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medusavirus%2C+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430(2019).</li>
<li>Abrahão, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749(2018).</li>
<li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faustovirus%2C+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li>
<li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaumoebavirus%2C+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278(2016).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orpheovirus+IHUMI-LCC2%3A+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779(2018).</li>
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<li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722(2017).</li>
<li>Fröhlich, J., König, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).</li>
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</ol>

Todos os autores não têm nada a divulgar.

A duração do manuseio de micro-aspiração de célula única e seu bom funcionamento é dependente do operador. As diferentes etapas do experimento requerem precisão. O uso dos componentes de micromanipulação da estação de trabalho deve estar controle constante observando o processo de micro-aspiração e a liberação da célula. O acompanhamento por observação microscópica é necessário para captura e transferência de uma célula. Um operador experiente pode levar de 1 a 2 h para isolar 10 células e retransferi-las uma a uma, depe...

Os vírus nucleocitoplasmic do ADN grande (NCLDV) são extremamente diversos, definidos por quatro famílias que infectam eucariontes1. Os primeiros vírus descritos com genomas acima de 300 kbp foram Phydcodnaviridae,incluindo paramecium bursaria chlorella vírus 1 PBCV12. O isolamento e a primeira descrição do Mimivirus mostraram que o tamanho dos vírus dobrou em termos do tamanho da partícula (450 nm) quanto do comprimento do genoma (1,2 Mb)3. Desde então, muitos vírus gigantes foram descritos, geralmente isolados usando um procedimento de cocultura de ameba. Vários vírus gigantes com diferentes morfologias e conteúdos genéticos podem ser isolados das células acanthamoeba sp., incluindo Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus e recentemente Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Paralelamente, o isolamento de Vermamoeba vermiformis permitiu o isolamento e descrição dos vírus gigantes Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus18,19,20. Outros vírus gigantes foram isolados com seus protistas hospedeiros, como cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23,e bodo saltans 24. Todos esses isolamentos foram o resultado de um número crescente de equipes trabalhando no isolamento e na introdução de atualizações de estratégia de alta de supressão25,26,27,28,como a melhoria do sistema de co-cultura com o uso de citometria de fluxo.
Em 2016, usamos uma estratégia associando cocultura e citometria de fluxo para isolar vírus gigantes27. Esta estratégia foi desenvolvida para aumentar o número de amostras inoculadas, para diversificar os protistas usados como suportes celulares e detectar rapidamente a lise do suporte celular. O sistema foi atualizado adicionando um passo suplementar para evitar a identificação preliminar da biologia molecular e detecção rápida de uma população viral desconhecida como no caso do Pacmanvirus29. Acoplamento citometria fluxo para classificação celular permitido para a separação de uma mistura de Mimivirus e Cedratvirus A1130. No entanto, mais tarde encontramos as limitações da separação e detecção dessas subpopulações virais por citometria de fluxo. Após o sequenciamento, quando montamos os genomas do Faustovirus ST125 e Faustovirus LCD7 (dados inéditos), surpreendentemente encontramos em cada montagem dois genomas suplementares de dois novos vírus não identificados em bancos de dados do genoma público. No entanto, nem a citometria de fluxo nem a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostraram que as amebaes foram infectadas por dois vírus diferentes, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Nós projetamos sistemas específicos de PCR para amplificar os marcadores faustovírus, usurpativírus e clandestinovírus, respectivamente, com base em seus genomas; nosso objetivo era ter sistemas baseados em PCR que permitissem a verificação da pureza dos vírus que estão sendo separados. No entanto, a diluição do ponto final e a citometria de fluxo não conseguiram separá-los. O isolamento dessa única população viral foi difícil porque nem a morfologia nem os elementos replicativos das populações de Clandestinovírus e Usurpativírus têm sido caracterizados. Detectamos apenas uma população viral por citometria de fluxo devido à sobreposição das duas populações (testadas após a separação efetiva). Tentamos separá-los usando uma única classificação de partículas em placas de 96 poços, mas não observamos quaisquer efeitos citopáticos, e não detectamos nem Clandestinovirus nem Usurpativirus por amplificação pcr. Finalmente, foi apenas a combinação de diluição do ponto final seguido por micro-aspiração única ameba que permitiu a separação desses dois vírus gigantes de baixa abundância de faustovírus. Este método de separação é o objeto deste artigo.

<table><tbody><tr><td>Agarose Standard</td><td>Euromedex</td><td>Unkown</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398876</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Controle as células durante o processo de microaspiração</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células Corning 150 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430825</td><td>Cultura</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células Corning 25 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430639</td><td>Cultura</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células Corning 75 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430641</td><td>Cultura</td></tr><tr><td>DFC 425C câmera</td><td>LEICA</td><td>Unkown</td><td>Observação/Monitoramento</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-S Microscópio Invertido</td><td>Nikon</td><td>Unkown</td><td>Observação/Monitoramento</td></tr><tr><td>EZ1 avançado XL</td><td>Quiagen</td><td>9001874</td><td>extração de DNA</td></tr><tr><td>Glasstic Slide 10 com Grades de Contagem</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6331000017</td><td>PCR padrão</td></tr><tr><td>Microcapilar 20 &micro; m</td><td>Eppendorf</td><td>5175 107.004</td><td>Microaspiração e liberação de células</td></tr><tr><td>Micromanipulador InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>631-0210</td><td>Posicionamento microcapilar</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9920</td><td>PCR padrão</td></tr><tr><td>Optima XPN Ultracentrífuga</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>A94469</td><td>Purificação de vírus</td></tr><tr><td>Placa de Petri 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Cultura/observação</td></tr><tr><td>Filtros de seringa estéreis 5 &micro; m</td><td>Filtração</td><td>SLSV025LS</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>SYBR verde Tipo I</td><td>Invitrogen</td><td>desconhecido</td><td>Sondas moleculares fluorescentes/citometria de fluxo</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>PCR padrão; Coloração de gel de DNA</td></tr><tr><td>Tecnai G20</td><td>FEI</td><td></td><td>Desconhecido Microscopia eletrônica</td></tr><tr><td>Tipo 70 Ti Rotor de titânio de ângulo fixo</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>337922</td><td>Tubo</td></tr><tr><td>ultra-transparente, 25 x 89 mm2</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>344058</td><td>Purificação de vírus</td></tr></tbody></table>

micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Durante o processo de cocultura de ameba, mais de um vírus pode ser isolado em um único poço. Previamente resolvemos esse problema por diluição final e/ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS) aplicada à população viral. No entanto, quando os vírus na mistura têm propriedades morfológicas semelhantes e um dos vírus se multiplica lentamente, a presença de dois vírus é descoberta na fase de montagem do genoma e os vírus não podem ser separados para maior caracterização. Para resolver este problema, desenvolvemos um procedimento de micro-aspiração de célula única que permite a separação e clonagem de vírus altamente semelhantes. No presente trabalho, apresentamos como essa estratégia alternativa nos permitiu separar as pequenas subpopulações virais de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, vírus gigantes que crescem lentamente e não levam à lúse amebal em comparação com o lytic e o rápido crescimento Faustovírus. O controle da pureza foi avaliado pela amplificação específica do gene e os vírus foram produzidos para uma caracterização mais adicional.

A micro-aspiração de célulaúnica é um processo de micromanipulação otimizado neste manuscrito (Figura 1). Esta técnica permite a captura de uma ameba arredondada e infectada (Figura 2A)e seu lançamento em uma placa nova contendo amebae não infectada (Figura 2). É um protótipo funcional que se aplica ao sistema de co-cultura e isolou com sucesso vírus gigantes não líticos. Esta abordagem foi usada pela primeira vez n...

Aqui, descrevemos um método de micro-aspiração de célula única para a separação de amebae infectada. A fim separar subpopulações virais no vermiformis de Vermamoeba contaminado por Faustoviruses e por vírus gigantes desconhecidos, nós desenvolvemos o protocolo detalhado abaixo e demonstramos sua habilidade de separar dois vírus gigantes novos low-abundance.

Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Micro-Aspiração Celular Única é um método para complementar as diferentes técnicas utilizadas no campo da microbiologia em geral e na virologia em particular. Ele poderia responder a perguntas-chave e resolver problemas encontrados durante o isolamento de vírus gigantes, separando um vírus de uma mistura viral apresentando um vírus de baixa abundância, pois foi o caso de vírus de volume de negócios, vírus clandisinal e vírus uzibati de outro, que é o Faustovírus, presente em alta abundância de qualquer maneira. A principal vantagem dessa abordagem é o uso de uma estratégia indireta.Consiste em separar e clonar o hospedeiro infectado para obter uma separação viral. Assim, este método monitora os diferentes passos desde a captura até a liberação de células e confirma o processo de classificação por observação microscópica. Finalmente, a biologia molecular é usada para confirmar a classificação e a microscopia eletrônica para observar as partículas virais separadas.Essa abordagem resolverá o grande problema da separação do vírus. É uma perspectiva para clonagem de ameba ou clonagem de protistas em geral. A pessoa que está tentando usar essa técnica pela primeira vez deve ser rigorosa e precisa ao controlar a pressão.O controle visual é essencial para confirmar a captura e a liberação de apenas uma célula. Use Vermamoeba Vermiformis, cepa CDC 19, como suporte celular. Adicione 30 mililitros de pyg médio e três mililitros da ameba em uma concentração de uma vez dez para a sexta células por mililitro em um frasco de cultura celular de 75 centímetros quadrados.Mantenha a cultura a 28 graus Celsius em uma incubadora. Após 48 horas, transfira 10 mililitros da cultura da célula ameba para um slide de contagem e coloque-o sob um microscópio para quantificar a ameba. Para enxaguar, colher 30 mililitros da cultura celular em um tubo e pelotar a ameba por centrifugação a 720 vezes G por 10 minutos.Remova o supernasce e resuspenda a pelota no volume apropriado do meio de fome para obter a concentração de uma vez 10 a sexta células por mililitro. Prepare o suporte celular com a adição de agente antimicrobiano. Em um armário de biossegurança, adicione uma vez 10 a 6 da cultura ameba em dois mililitros de meio de fome.Em seguida, inocular 100 mililitros da solução de estoque contendo a mistura de vírus na cultura amebae cell support em uma multiplicidade de infecção de 0,01. Incubar o suporte de cultura de células de ameba infectadas. Adicione 30 graus Celsius por 10 a 14 horas ou até que os efeitos citopáticos sejam induzidos, como arredondamento de amebal ou lise.Em seguida, use uma seringa para coletar a mídia e filtrar através de um filtro de cinco mícrons para remover detritos celulares. Realize uma diluição de cereais da amostra viral em meio de fome em diferentes poços. Inocular dois mililitros de uma vez 10 a o sexto Vermamoba Vermaformis contidos em cada placa de Petri com 100 mililitros da mistura inóculo.Em seguida, coloque as placas de Petri em um saco plástico vedado a 30 graus Celsius. Às seis horas após a infecção, observe as placas de Petri com microscopia óptica invertida e verifique a morfologia celular a cada quatro a oito horas. O tratamento antimicrobíário é para o suporte celular.Selecione entre os pratos de Petri os ausentes de qualquer contaminação visual por agentes fúngicos e bacterianos e com evidências de efeito citopático da ameba devido aos vírus e com pré-lise e fase de arredondamento da ameba para evitar aspiração de partículas virais. Configure uma estação de trabalho com micro manipulador, dispositivo de pressão de controle manual, microscópio invertido, módulos Plug and Play Motor, câmera e módulo de computador. Escolha um micro capilar de 20 mícrons de diâmetro interno para permitir a manutenção de uma posição interna e uma liberação fácil da célula.Fixar o ângulo de operação do sistema de aperto no módulo motorizado a 45 graus. Realize uma instalação dupla, primeiro no sistema de agarramento e depois no micro capilar. Concentre-se nas células.Para clonar células, coloque a placa de Petri contendo dois mililitros de ameba infectada sob o microscópio. Concentre-se primeiro nas células e depois no micro capilar imerso na cultura. Escolhendo célula única arredondada e aproxime o micro capilar do micromanipulador.Exerça aspiração suave com controle manual de pressão sobre a célula levando-a dentro do micro capilar Remova a célula única da primeira amostra e solte-a no suporte de cultura celular da amebae. Em seguida, incubar-lo a 30 graus Celsius. Controle cuidadosamente a pressão para ser capaz de aspirar uma única célula e controlar sua aspiração pela observação da liberação de uma única célula.Realizar observações diárias com um microscópio óptico invertido para observar o aparecimento das células e monitorar o surgimento do efeito citopático. Agora, opere um sistema de extração automatizado para extrair DNA de parte das amostras de cultura positiva onde um efeito citopático é observado. Projete primers para amplificar genes pobres anotados como RBP2 para Faustovírus, proteína capsid principal para Usurpatvirus, e proteína capsid menor para Clandestinovirus.Execute o PCR padrão usando um termociclador de acordo com o manuscrito. Realize 20 microliters de reações pcr com 50 micromolar de cada primer, 1X Master Mix e água livre de ribonuclease. Execute os produtos PCR com mancha de gel de DNA em um gel de 1,5% agarose na voltagem de 135 volts e visualize com UV. Este protocolo otimiza um processo de micromanipulação com micro aspiração unicelular.Esta técnica permite a captura de uma ameba arredondada e infectada e sua liberação em uma nova placa contendo ameba não infectada. Esta abordagem isolou com sucesso um novo vírus gigante de baixa abundância chamado Userpatvirus LCD7. Seu Userpatvirus só foi observado no clone sete com presença de DNA LCD7 do Userpatvirus e ausência de DNA Faustovírus.A microscopia eletrônica revelou o aparecimento do Clandestinovirus ST1, que tem uma morfologia icosaedral típica sem fibrilas, bem como o Usurpatvirus LCD7 com um capsídeo icosaedral de cerca de 250 nanômetros. A baixa citometria confirma a sobreposição de populações de Faustovírus e Nauvoirus. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito facilmente.O mais importante a ser lembrado ao tentar esse procedimento é a necessidade de um ritual mínimo de observações sobre o tamanho das entidades com o bom manuseio do competente da estação de trabalho e a verificação de qualquer problema de contaminação. Esta abordagem pode ser usada como uma técnica de classificação com base na morfologia celular. Atualmente é usado em nosso laboratório para a clonagem de ameba específica.Um ponto crítico dessa técnica é manter a integridade celular. Na verdade, podemos ter alguns problemas com a não observação da célula ou liberação. Isso se deve principalmente à desintegração da célula no micro capilar.Este método pode ser uma alternativa eficiente quando a telemetria de falhas e a classificação de fatos não estão disponíveis e quando limitações técnicas específicas são alcançadas. Não se esqueça que em alguns casos a célula não é liberada do micro capilar. Isso se deve, em parte, às características da amebae e à sua capacidade de adaptação e, em seguida, da membrana celular.

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Biology

Biologia

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Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

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