Preparação média para o cultivo de microrganismos condições estritamente anaeróbicas/anóxicas
15 de agosto de 2019
Como os organismos anaeróbios obrigam são incapazes de crescer em cima da exposição de oxigênio, o uso de técnicas de cultivo anaeróbicos é indispensável. Aqui, demonstramos um método simples e efetivo para cultivar uma cultura mista derivada de uma usina de biogás a partir da preparação de mídia para o gás e quantificação de ácidos graxos voláteis.
Em contraste com organismos aeróbicos, microrganismos estritamente anaeróbicos requerem a ausência de oxigênio. Como o oxigênio é onipresente no ar, reter condições livres de oxigênio durante o cultivo é um pré-requisito para a cultura anaeróbica. A técnica aplicada representa um método simples e barato para fornecer condições anoxidas para cultivar uma população microbiana mista na cultura líquida.
Essa técnica também pode ser aplicada para o cultivo de culturas puras. No entanto, para microrganismos altamente sensíveis ao oxigênio, este procedimento pode não ser aplicável. Comece pesando ingredientes médios em um frasco apropriado, e dissolvendo-os com metade do volume de água destilada.
Em seguida, adicione mililitro do indicador REDOX, seguido de vitaminas na solução de elemento de rastreamento. Ajuste o pH de acordo com as exigências do organismo e leve o volume final para 1 litro com água destilada. A cor do indicador REDOX é dependente de pH, e pode exigir algum tempo para se ajustar.
Encha frascos de soro de 120 mililitros com 50 mililitros de médio e, em seguida, incuba-os em um banho de água de 100 graus Celsius por 20 a 30 minutos, para reduzir a solubilidade do oxigênio na fase líquida. Lave o espaço da cabeça com nitrogênio. Cuide da ventilação adequada da sala ao trabalhar com nitrogênio.
Feche os frascos com septa de borracha butyl e conserte as tampas de alumínio. Em seguida, adicione 0,1 mililitros de agente redutor a cada frasco, para reduzir ainda mais o potencial REDOX. E autoclave os frascos por 20 minutos a 121 graus Celsius.
Uma autoclave certificada para a esterilização de embarcações fechadas deve ser usada na aplicação deste protocolo. Caso contrário, a sobrepressão derivada do aumento da temperatura pode causar a explosão de frascos de soro. Para preparar o inóculo do digestor anaeróbico, adicione 400 mililitros de água destilada a um frasco e leve-o para ferver.
Esfrie-o até aproximadamente 30 graus Celsius enquanto lava permanentemente o espaço da cabeça com nitrogênio. Adicione aproximadamente 100 gramas de lodo, derivado de um digestor anaeróbico, certificando-se de registrar a massa exata da lama para determinação da diluição. Troque o espaço da cabeça do frasco com nitrogênio, e feche-o com um septo de borracha de butílio.
Agite o frasco por 30 minutos a 120 RPM. Deixe sedimentar partículas de lodo maiores, em seguida, usar uma seringa e cânula para remover 5 mililitros de inóculo e injetá-lo em um frasco de soro previamente preparado. Incubar o frasco de soro inoculado a uma temperatura apropriada para o experimento, certificando-se de drenar a pressão sobre causada pelo aumento da temperatura, aproximadamente 15 a 30 minutos após o início da incubação.
Para avaliar a produção e composição de bio gás durante o período de incubação, registo da pressão atmosférica atual e preparar um manômetro para avaliar a pressão dentro do frasco. Agite os frascos e remova 1 mililitro de gás espacial da cabeça usando a seringa e a cânula. Meça a concentração de hidrogênio, oxigênio, metano e dióxido de carbono usando cromatografia gasosa.
Use 1 mililitro de líquido do frasco para monitorar as concentrações de todos os ácidos graxos altos, de acordo com as instruções do manuscrito, e drenar os frascos sobre a pressão depois de devolvê-lo à temperatura apropriada. Este protocolo foi usado para criar bioreatores em miniatura realizando digestões anaeróbicas. Triptofano, tyrosina, fenilalanina, extrato de carne e caseína foram adicionados em 3 concentrações diferentes, e a produção de metano foi monitorada durante um período de incubação de 28 dias.
Os methanogênios foram visualizados irradiando a co-enzima F420, que é um portador de elétrons em methanogênese, e exibe uma fluorescência azul-esverdeada com um máximo de absorção em 420 nanômetros. Simultâneo com a análise de gás, as amostras foram analisadas para ácidos graxos voláteis e concentrações de ácido fenil durante o período de incubação. Métodos biológicos moleculares voltados à abundância de microrganismos específicos e/ou composição da comunidade microbiana, em um determinado ponto do experimento, podem ser aplicados utilizando o procedimento descrito.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método simples para o cultivo de microrganismos anaeróbicos provenientes de uma usina de biogás. Ele detalha a preparação dos meios e a quantificação de gás e ácidos graxos voláteis.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biotecnologia
- Ciência Ambiental
Contexto
- Organismos anaeróbicos não conseguem sobreviver na presença de oxigênio.
- A manutenção de condições anóxicas é crucial para o seu cultivo.
- Este método é simples e economicamente viável para populações microbianas mistas.
- Ele também pode ser adaptado para culturas puras.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um protocolo eficaz para cultivo anaeróbio.
- Quantificar a produção de biogás e ácidos graxos voláteis.
- Visualizar metanogênicos durante o processo.
Métodos Utilizados
- Preparação de meios anaeróbicos com indicadores REDOX.
- Inoculação com lodo de digestores anaeróbicos.
- Monitoramento da composição do gás utilizando cromatografia gasosa.
- Análise de ácidos graxos voláteis durante a incubação.
Resultados Principais
- Obteve-se o cultivo bem-sucedido de microrganismos anaeróbicos.
- A produção de biogás foi monitorada ao longo de um período de 28 dias.
- Foram quantificadas as concentrações de metano e ácidos graxos voláteis.
- Os metanogênicos foram visualizados utilizando técnicas de fluorescência.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para o cultivo de culturas anaeróbicas.
- Permite a avaliação da produção de biogás e da composição da comunidade microbiana.
- Este protocolo pode ser adaptado para diversas aplicações de pesquisa anaeróbica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O cultivo confiável de microrganismos estritamente anaeróbicos é essencial para a pesquisa e desenvolvimento em biofármacos&D direcionado ao metabolismo microbiano, biologia sintética e inovação em bioprocessos. Este protocolo permite a preparação reprodutível de meios livres de oxigênio e o monitoramento quantitativo dos produtos microbianos, apoiando a descoberta inicial e a redução de riscos mecanicistas em fluxos de trabalho baseados em anaeróbios. A escalabilidade e padronização do método facilitam sua integração em plataformas de triagem em larga escala e pesquisas translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação orientada por hipóteses de vias metabólicas anaeróbicas e função microbiana.
- Apoia a redução de riscos biológicos ao manter condições anóxicas rigorosas para alvos sensíveis.
- Facilita a validação funcional de consórcios microbianos relevantes para o desenvolvimento de bioprocessos e terapias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece preparação padronizada e reprodutível de meios anaeróbicos para ensaios subsequentes.
- Garante medição quantitativa de produtos gasosos e metabólitos para avaliação confiável de compostos.
- Permite escalabilidade do ensaio e reutilização da plataforma em diversos sistemas anaeróbicos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Permite o alinhamento das saídas microbianas com biomarcadores translacionais, como metano e ácidos graxos voláteis.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica em aplicações impulsionadas por anaeróbios.
- Reduz o risco no avanço de candidatos microbianos ao fornecer dados robustos e quantitativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo posiciona o cultivo anaeróbio como uma capacidade fundamental desde as fases iniciais de descoberta até a identificação de compostos líderes e a pesquisa pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias metabólicas mediante controle rigoroso dos níveis de redox e oxigênio.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para análise de gases e metabólitos, apoiando a preparação de ensaios.
- Análises: Integra cromatografia gasosa e HPLC para medição precisa da atividade microbiana e dos produtos metabólicos.
- Pesquisa Translacional: Alinha os produtos microbianos com pontos finais pré-clínicos relevantes para o desenvolvimento de bioprocessos e terapias.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e reutilizável para o cultivo anaeróbio em programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de sistemas anaeróbicos.
- Valor Operacional: Oferece cultivo e análise anaeróbicos padronizados, escalonáveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos e quantitativos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos impulsionados por anaeróbios.
Considerações de Implementação
- Exige expertise em microbiologia anaeróbia e técnica asséptica.
- Requer acesso a frascos estanques ao gás, autoclaves para recipientes fechados e plataformas analíticas (GC, HPLC).
- Exige padronização rigorosa entre equipes para manter condições anóxicas e reprodutibilidade.
- Pode ser necessária adaptação para cepas altamente sensíveis ao oxigênio ou sistemas modelo alternativos.
- Protocolos de segurança para manipulação de gases pressurizados e nitrogênio são essenciais.
