Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo
25 de setembro de 2019
Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.
O protocolo aqui descrito nos permite investigar a função de uma quimiocina e o comportamento do macrófago in vivo. A maioria dos modelos experimentais existentes de quimitaxis celulares são baseados em experimentos in vitro celulares. Mas experimentos in vitro às vezes são muito simples para modelar o ambiente complexo in vivo.
Além disso, eles podem não representar a capacidade de quimioterapia in vivo. Esses métodos utilizam a vantagem específica do peixe zebra para observação direta do comportamento celular, o que é difícil para os camundongos. Comece gerando construções transgênicas TGFABP-10A-34.
Injete os construções de interleucina FABP-10A-34 em um estágio celular Tg (mpeg1:GFP)transgênico e embriões de peixe silvestre junto com a transposase MRNA. Levante e colete os embriões de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, fixá-los com 4% de paraformaldeído durante a noite a 4 graus Celsius ou por duas horas em temperatura ambiente.
Após a fixação, lave os embriões com PBST três vezes por cinco minutos por lavagem. Desidratar os embriões separadamente com 50% de metanol no PBST, seguido de 100% de metanol, depois mudar para metanol fresco 100%, e armazená-los a 20 graus Celsius negativos por pelo menos 2 horas. Quando estiver pronto para hibridização da sonda, reidrate os embriões separadamente em 50% de metanol em PBST.
Em seguida, lave-os com PBST três vezes por cinco minutos por lavagem. Digerir os embriões com proteinase K em PBST à temperatura ambiente. Em seguida, descarte a solução de digestão e repita a fixação com 4% de paraformaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente.
Após a fixação, lave os embriões duas vezes com PBST por 10 minutos por lavagem. Realize a pré-hibridização com tampão de hibridização aquecido a 65 graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, pré-aqueça a sonda interleucina-34 a 65 graus Celsius por 10 minutos.
Recicle o tampão de hibridização no tubo original e realize a hibridização com a sonda pré-aquecido a 65 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave os embriões com 50% de formamida e 2X SSCT seguidos por 2X SSCT e depois 0,2X SSCT a 65 graus Celsius. Repita cada lavagem três vezes com 20 minutos por lavagem.
Em seguida, lave os embriões três vezes com PBST por cinco minutos por lavagem. Bloqueie as amostras com 600 mililitros de tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 400 microliters de solução de anticorpos HRP anti-digoxigenina e incuba os embriões a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, remova o anticorpo e lave os embriões seis vezes com PBST por 20 minutos por lavagem. Após a última lavagem, enxágue cada amostra com 30 microlitres de 1X mais diluente de amplificação por cinco minutos. Incubar as amostras na solução de trabalho de tiramina fluoroforina por cinco a 15 minutos no escuro.
Estendendo o tempo de incubação para 30 minutos se os sinais estiverem fracos. Em seguida, lave os embriões com PBST três vezes por 10 minutos por lavagem. E incuba-los com o anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, lave os embriões cinco vezes com PBST por 30 minutos por lavagem, e incuba-os com os anticorpos secundários a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave os embriões três vezes em PBST por 10 minutos por lavagem, e armazene-os em 70% de glicerol no escuro a quatro graus Celsius ou 20 graus Celsius negativos por mais tempo. Antes da imagem, use um microscópio de fluorescência para selecionar os embriões vermelhos DS e GFP duplo positivo.
Para montar o peixe, use um banho de metal para aquecer um mililitro de 1% de baixa agarose de fusão a acima de 90 graus Celsius. Em seguida, esfrie-o à temperatura corporal e misture em 50 microliters de 0,2% tricaine. Transfira os embriões anestesiados para um pequeno prato montado com um slide de cobertura na parte inferior.
Remova a água circundante e lentamente deixe cair a baixa agarose de derretimento sobre os embriões. Ajuste cuidadosamente a posição do peixe antes que a agarose se solidifique, mantendo a área do fígado perto do deslizamento de cobertura. Uma vez que a agarose tenha solidificado, cubra-o cuidadosamente com outra camada de agarose para reforçá-la.
Coloque o prato na mesa portadora do microscópio confocal, cubra o peixe com a solução E2 com tricaine e inicie a imagem. Para operar o microscópio confocal, abra o software Zen Black 2.3 e clique em localizar, em seguida, incubação e, em seguida, definir a temperatura para 29 graus Celsius. Clique no menu de aquisição e selecione o modo de varredura e lasers necessários no menu de configuração inteligente.
Em seguida, selecione pilha-Z e posição. Clique no menu de designer experimental e selecione ativar o experimento multi-bloco no primeiro bloco para encontrar a amostra sob baixa ampliação. Em seguida, mude para a alta ampliação e deixe a área observada no centro do campo visual.
Defina as informações de posição e z-stack. Em seguida, selecione a intensidade do laser apropriada, camadas de varredura e velocidade de imagem. Uma vez que todos os blocos estejam configurados, defina o número apropriado de loops e comece a gravar.
Este protocolo foi usado para injetar uma interleucina específica do fígado-34 sobre a expressão plasmid em embriões de peixes transgênicos, que os macrófagos foram rotulados com GFP. Fluorescência de montagem total na hibridização situ e imunostaining foram utilizados para analisar a expressão de macrofagos rotulados interleucina-34 e GFP. Os números de células macrófagos foram analisados quantitativamente em uma região de fígado e cauda injetadas.
Imagens vivas foram utilizadas para observar diretamente macrófagos, rotulados de verde, passando pelo fígado de um peixe de controle e migrando para o fígado de uma interleucina-34 sobre a expressão de peixes. As etapas importantes deste protocolo incluem a seleção de uma linha transgênica adequada para rotular a célula de interesse. E tecido apropriado para a imagem de sua expressão de gene transgênico, bem como uma janela de tempo de observação apropriada.
Essa técnica poderia ser aplicada para estudar a função de outras quimiocinas no comportamento de outras células, como células T e neutrófilos in vivo.
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Visão Geral
Este estudo investiga o papel de uma quimiocina no recrutamento de macrófagos utilizando modelos in vivo. Os métodos empregados incluem hibridização in situ em preparações inteiras e imagem em tempo real para observar o comportamento dos macrófagos em tempo real.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- Modelos existentes de quimiotaxia celular muitas vezes dependem de experimentos in vitro.
- Modelos in vitro podem simplificar excessivamente o ambiente in vivo complexo.
- A observação direta do comportamento celular é desafiadora em modelos mamíferos tradicionais.
- O peixe-zebra oferece uma vantagem única para o estudo da migração celular in vivo.
Objetivo do Estudo
- Explorar a função de uma quimiocina específica.
- Analisar o comportamento de macrófagos em um organismo vivo.
- Aprimorar o entendimento da quimiotaxia em um ambiente mais representativo.
Métodos Utilizados
- Hibridização in situ em preparação inteira para detecção de quimiocinas.
- Imunomarcação para identificar macrófagos.
- Imagem em tempo real para observação da migração de macrófagos.
- Uso de peixe-zebra como organismo modelo.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida da expressão de quimiocinas in vivo.
- A imagem em tempo real revelou padrões dinâmicos de migração de macrófagos.
- Os resultados sugerem que a quimiocina desempenha um papel significativo no recrutamento de macrófagos.
- Demonstrou as vantagens do uso de peixe-zebra para tais estudos.
Conclusões
- O estudo destaca a importância de modelos in vivo para compreender a quimiotaxia.
- Os resultados podem orientar pesquisas futuras sobre respostas imunes.
- O uso de peixe-zebra pode aprimorar o estudo do comportamento celular em um ambiente complexo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modelagem direta in vivo do recrutamento de macrófagos mediado por quimiocinas aborda uma lacuna crítica na imunologia translacional, permitindo a análise quantitativa e em tempo real da migração celular em um contexto fisiologicamente relevante. Este fluxo de trabalho baseado em peixe-zebra oferece confiança preditiva na validação de alvos e reduz riscos nas decisões iniciais de descoberta, fornecendo resultados quantitativos robustos sobre o comportamento de células imunes. A abordagem melhora o triagem de portfólios ao esclarecer o impacto funcional da modulação de quimiocinas em um sistema vivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação funcional de alvos quimioatratores em um sistema vertebrado vivo.
- Auxilia na desmistificação biológica ao revelar a dinâmica de migração celular in vivo.
- Fornece evidências quantitativas de engajamento do alvo e relevância da via.
- Facilita a confiança preditiva no avanço de ativos moduladores de quimiocinas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece modelos validados de macrófagos marcados com fluorescência para triagem subsequente.
- Fornece leituras quantitativas reprodutíveis de recrutamento e localização celular.
- Apoia a padronização de ensaios para avaliação de compostos que visam vias de quimiotaxia.
- Permite fluxos de trabalho de imagem escaláveis para análise comparativa entre condições.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de migração celular in vivo com mecanismos imunológicos relevantes para a doença.
- Proporciona continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica da função de quimiocinas.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao vincular achados mecanicistas a desfechos translacionais.
- Facilita a identificação de biomarcadores para o recrutamento de células imunes em modelos de doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de expressão ectópica de quimiocinas integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes baseados em hipóteses do recrutamento de células imunes in vivo, apoiando tanto a validação de alvos quanto as etapas de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a migração de macrófagos em resposta à superexpressão de quimiocinas, esclarecendo a função da via.
- Triagem: Fornece imagens padronizadas e reprodutíveis e contagens celulares para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Permite a comparação estatística de números e localização celulares entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas às respostas imunes relevantes para doenças em modelos de vertebrados.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a outras quimiocinas e tipos de células imunes para aplicação mais ampla no portfólio.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos quimiocinas e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho padronizados, escaláveis e reprodutíveis de imagem in vivo.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e melhora a eficiência do capital ao esclarecer riscos biológicos precocemente.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos imunomoduladores.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em transgênese de peixe-zebra e técnicas de imagemagem ao vivo.
- Exige acesso à microscopia confocal e infraestrutura para análise quantitativa de imagens.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de marcação, aquisição de imagens e quantificação.
- Adaptável a outros tipos de células imunes e quimiocinas com linhagens transgênicas apropriadas.
- Depende de um cronograma preciso e seleção de tecidos para janelas ótimas de observação.
