Name: Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a gerar gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer usando um acelerador de evolução microfluídico. Esta plataforma permite estudos quantitativos em tempo real da dinâmica tumoral em nível de célula única.

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Este trabalho foi apoiado pelo NSF PHY-1659940.

1. fabricação de microfluídico dispositivo
<ol><li>Gere o padrão microfluídico desejado usando um software de design de layout (consulte materiais complementares).</li>
	<li>Fabricar a máscara fotográfica. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.<ol>
<li>Utilizando um gravador de laser, escreva o padrão em uma placa de vidro de soda-cal revestida com 100 nm de CR e 500 nm de fotororesista AZ1518.</li>
		<li>Desenvolva o fotoresistente com o colaborador AZ300MIF para 60 s.</li>
		<li>Etch afastado o cromo sem proteção do fotoresistente usando CR-7 Chromium Etchant.</li>
		<li>Descasque fora o fotoresistente residual usando um descascador do fotoresistente em 70 ° c por 45 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste padrão o photoresist. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.<ol>
<li>Spin Coat HMDS em wafer de silício a 4000 rpm por 40 s.</li>
		<li>Spin Coat fotoresistente AZ4330 em wafer de silício a 4000 rpm por 40 s.</li>
		<li>Soft cozer a bolacha de silício a 95 ° c por 60 s.</li>
		<li>Utilize o alinhador da máscara para expor o UV à bolacha do silicone.</li>
		<li>Desenvolva o fotoresistente com o colaborador AZ300MIF por 4 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute a gravura DRIE. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.<ol>
<li>Seque-grave a bolacha modelada com o fotoresistente usando um sistema de Etching reactivo do íon do silício (Drie) para a profundidade de 100 μm.</li>
		<li>Descasque fora o fotoresistente com acetona e o plasma etch com um etcher do plasma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oxidação e silanization da bolacha. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.<ol>
<li>Realize a oxidação térmica no wafer de silício gravado em um forno a 1100 ° c por 1 h.</li>
		<li>Aguarde até que a bolacha de silício esfrie e, em seguida, coloque o wafer em um dessecador com algumas gotas de tricloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silano (PFOTS) gotejados em um pequeno recipiente perto da bolacha.</li>
		<li>Bombeie a pressão do exsicador a 0,5 ATM na temperatura ambiente por 60 minutos. O molde da bolacha do silicone deve tornar-se hydrofóbico após o silanization apropriado, que pode ser testado adicionando diversas gotas da água no Wafer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Litografia suave. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.<ol>
<li>Misture o pre-polímero e o cross-linker (do jogo do polimetilsiloxano (PDMS) em um 10:1 pela relação do peso.</li>
		<li>Despeje o PDMS misto para criar um filme de 10 mm de altura sobre o molde de wafer de silício SILANIZADOS.</li>
		<li>Degas o sistema de Wafer PDMS-silício resultante em um dessecador por 30 min a 1 h.</li>
		<li>Incubar a bolacha do PDMS-silicone em uma incubadora de 70 ° c durante a noite para curar o PDMS.</li>
		<li>Uma vez que o PDMS é curado, descasque a película de PDMS fora da bolacha do silicone com cuidado.</li>
		<li>Usando agulhas da biópsia, perfurar através-furos nas portas de entrada baseadas na posição do teste padrão no PDMS e empregar um perfurador circular para cortar microplaquetas 27 milímetros no diâmetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colagem da camada de PDMS.<ol>
<li>Cura de calor duas pilhas de cilindros PDMS de 27 mm (sem padronização), que se tornará a camada de reservatório e a camada tampando do dispositivo.</li>
		<li>Corte dois círculos de 7 milímetros em torno das entradas na camada do reservatório, e utilize uma agulha da biópsia para perfurar através-furos nas portas de entrada na camada tampando.</li>
		<li>Bond três pilhas de PDMS (pilha modelada, camada do reservatório, camada tampando) com tratamento do plasma do oxigênio.</li>
		<li>Com a agulha da biópsia, perfure através-furos nas tomadas e na porta Center do dispositivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mídia e linha de célula de preparação
<ol><li>Prepare mídia para a cultura de linhas de células PC3, incluindo PC3-EMT e PC3-EPI: Misture o meio RPMI 1640 com soro bovino fetal a 10% (FBS) e 1x antibiótico-Antimicótico. Gere linhas de célula como descrito anteriormente14. Nota: as linhas celulares PC3 são mantidas na mídia acima em incubadoras humidificadas a 37 ° c com 5% de CO2. Divida as células e subcultura a cada 3 dias, antes de atingirem 100% de confluência.</li>
	<li>As linhas celulares do transfect com marcadores fluorescentes citoplasmáticos rotulados para melhor visualização, como descrito anteriormente12, tal que PC3-EMT expressa GFP citoplasmático e PC3-EPI expressa mcherry citoplasmática. Note-se que a tecnologia também é compatível com quaisquer células fluorescentes-rotuladas, bem como imagem brightfield de células sem rótulo.</li>
</ol>3. configuração experimental
<ol><li>Fabricação do suporte da placa de metal<ol>
<li>Fabricar um suporte da placa que seja suficiente para prender pratos de cultura gás-permeáveis simultâneos para experimentos paralelos fazendo à máquina ou à impressão 3D. O arquivo CAD 3D ("placa de 3 poços. FCStd ") pode ser encontrado no GitHub como uma referência (https://github.com/kechihl/3-well-plate).</li>
		<li>Desaparafuse os componentes do suporte (Figura 2) com uma chave de fenda. Desinfete os componentes através da exposição UV durante pelo menos 1 h e deixe-o num ambiente estéril. Nota: o suporte é projetado para fornecer condições substanciais para o equilíbrio térmico e composições de gás ideal, com entradas de canal de gás que permitem o fluxo de ar. Mais detalhes podem ser encontrados em nosso trabalho anterior12.</li>
		<li>Prepare até três pratos de cultura permeáveis a gás, dos quais a membrana de cultura celular é relativamente flexível.</li>
	</ol></li>
	<li>Propagação da linha celular<ol>
<li>24 horas antes do início do experimento, colheita de células PC3-EPI e PC3-EMT por tripsinização por 5 min. Adicionar meios de cultura pré-aquecido, em seguida, centrifugar a 150 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Células de contagem de cada PC3-EPI e PC3-EMT usando um hemocitômetro e isolar um total de 2,5 x 104 de cada tipo de célula para cada gás-permeável cultura prato.</li>
		<li>Misture e ressuscite os dois tipos de células em 2 mL de meios de cultura e semente as células em cada um dos gás-permeável cultura prato.</li>
		<li>Deixe todo o suporte da placa na incubadora durante a noite para que as células se fixem.</li>
		<li>Desinfecte os dispositivos PDMS através de exposição UV por pelo menos 1 h e deixe em um ambiente estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurando unidade de controle térmico e sistema de abastecimento de gás<ol>
<li>Como mostrado na Figura 3, configurar um sistema de abastecimento de gás que consiste em ambas as unidades de controle co2 e O2 , uma bomba de gás, uma câmara de mistura de gás, um humidificador ou um borbulhador, e três conjuntos separados de válvulas de gás e medidores de pressão. Mais detalhes podem ser encontrados em nosso trabalho anterior12.</li>
		<li>Configure as unidades de controle CO2 e o2 de forma que ajustem a taxa de mistura do gás dos tanques co2 e N2 e da fonte o2 . Alternativamente, qualquer sistema de abastecimento de gás que fornece gás condição de normóxia funcionaria.</li>
		<li>Certifique-se que o gás que é combinado na câmara de mistura e humidificado por um Bubbler tal que a umidade relativa é aumentada até 85% (como lido para fora de um monitor da umidade relativa) e que o gás conduz a três válvulas de gás independentes com calibres de pressão a fim controle e monitore o caudal de gás no suporte da placa.</li>
		<li>Coloque todo o suporte da placa numa unidade de controlo térmico de incubação no palco com subunidades de aquecimento separadas para a tampa e a placa inferior, com todas as unidades situadas a 37 ° c. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.</li>
	</ol></li>
	<li>Instalação de dispositivo microfluídico. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.<ol>
<li>Identifique que os componentes detalhados do suporte da placa de 3 poços estão em ordem, como na Figura 2. Cada um dos três poços são idênticos e independentes, com um par de canais de gás para cada poço. Cada poço possui um suporte gás-permeável do prato da cultura, um suporte da microplaqueta de PDMS, um suporte de vidro da janela, e um par de janelas de vidro de 35 milímetros. Estes componentes podem ser montados usando os parafusos ajustados. Nota: as janelas de vidro asseguram-se de que haja um espaço termicamente isolado entre a membrana da cultura gás-permeável e o poço tal que nenhuma condensação da água ocorre devido às diferenças da temperatura na relação. Note que os 3 poços são independentes, e 3 experimentos podem ser feitos separadamente.</li>
		<li>Meio de cultura pré-aquecido a 37 ° c e Degas em câmara de vácuo por 20 min.</li>
		<li>Trate os chips PDMS usando um sistema de plasma de oxigênio para 30 s, a fim de manter a hidrofilicidade.</li>
		<li>Configure o sistema da seringa. Carregue duas seringas lentamente com meios de crescimento e outras duas seringas com reagente de interesse desejado (meios de comunicação, meios de comunicação com drogas, etc.). Conecte cada seringa individual a uma tubulação de 50 cm (0, 20 "x 0.060" OD) por uma agulha de distribuição de 23 G em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubulação.</li>
		<li>Prime a tubagem e insere o pino de aço em cada chip PDMS através da camada de nivelamento. Encha acima a camada do reservatório e molhe o teste padrão da camada do teste padrão de PDMS com meios. A camada do reservatório trabalha como uma armadilha da bolha da em-microplaqueta para impedir que as bolhas de ar começ no teste padrão microfluídicos.</li>
		<li>Carregue uma seringa de 1 mL com meios de cultura. Conecte a seringa a uma tubulação de 5 cm (0, 20 "x 0.060" OD) por uma agulha de distribuição de 23 G em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubagem e prima a tubagem.</li>
		<li>Insira o pino de aço oco no furo central da microplaqueta, onde os meios excessivos podem ser extraídos para fora da microplaqueta mais tarde durante o processo da selagem da microplaqueta.</li>
		<li>Como cada dispositivo PDMS requer 4 10 mL seringas carregadas em uma bomba de seringa, carga 2 10 mL seringas por chip na plataforma para a frente. Coloque as duas outras seringas na plataforma de retirada do sistema da seringa.</li>
		<li>Coloque o chip diretamente no topo das membranas de cultura permeável a gás (com células já aderiram às membranas). A fim de evitar a entrada de microbolhas no padrão microfluídico, dispensar 1 mL de meios pré-aquecidos e desgaseificados no prato de cultura de gás permeável de 35 mm antes da montagem e, em seguida, certifique-se de que o chip se aproxima da superfície líquida com um ângulo de inclinação de 15 graus.</li>
		<li>Prenda o prato gás-permeável da cultura e o poço no suporte gás-permeável do prato da cultura para cada microplaqueta, com o suporte de microplaqueta de PDMS que empurra o dispositivo de PDMS para baixo.</li>
		<li>Tape uma folha de um aferidor na parte superior do dispositivo PDMS e braçadeira com o suporte de chip PDMS, a fim de evitar que o chip de secar.</li>
		<li>Defina a taxa de fluxo de mídia ao redor da matriz para 20 μL/h.</li>
		<li>Ajuste a placa inteira na incubadora do em-estágio na fase motorizada de um microscópio invertido. Conecte o sistema de fornecimento de gás aos canais de gás e pressurizando a membrana de cultura permeável a gás contra o chip PDMS instalado para garantir a vedação do dispositivo. Mantenha a pressão do calibre em 0,2 libras por polegada quadrada (1,4 x 104 PA).</li>
		<li>Extraia lentamente a mídia excessiva no chip usando a seringa de 1 mL do orifício central. Observe o chip o microscópio durante a extração de mídia e, em seguida, parar de extrair quando o chip é selado. A selagem da microplaqueta deve ser óbvia desde que uma parte das pilhas seria esmagada pelas microestruturas.</li>
		<li>Ligue a unidade de detecção de temperatura da incubadora no palco à placa de 3 poços e defina a 37 ° c.</li>
	</ol></li>
</ol>4. imagem de lapso de tempo de célula única
<ol><li>Configurar software de imagem utilizando um microscópio invertido para aquisição de imagens de lapso de tempo. Observe que um microscópio fluorescente invertido com estágio x-y totalmente motorizado, botão de foco, obturador e cubos de filtro é necessário para uma experiência de EA.</li>
	<li>Configure o software para adquirir imagens em dois canais com ampliação de 10x para cada chip com costura automática de imagem após uma rodada de autofoco. Esteja ciente de que os sistemas de correção automática como o foco perfeito não garantem qualidade de imagem satisfatória. É mais recomendável gerar uma superfície de foco personalizada para aquisição de imagem de longo prazo com base em foco automático ou focagem manual em todo o chip.</li>
	<li>Tire imagens a cada hora e deixe a experiência em execução na escala de tempo de semanas. Monitore a qualidade da imagem em uma base diária e atualize a superfície de foco, se necessário.</li>
	<li>Prepare a microplaqueta de PDMS e o prato gás-permeável da cultura para a análise imunofluorescente subseqüente, como descrito previamente13.</li>
</ol>5. processamento e análise de imagens
<ol><li>Processamento pós-experimental<ol>
<li>Converta imagens em formato TIFF para processamento de imagem e medições utilizando Fiji/ImageJ.</li>
		<li>Compacte arquivos TIFF para facilitar o processamento de imagens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de Fiji/ImageJ<ol>
<li>Para identificar células, realize subtração de fundo e análise de partículas para identificar pontos brilhantes fluorescentes para detecção de localização de células e contagem automática de células.</li>
		<li>Utilize plugins (rastreamento manual, quimiotaxia, ferramenta de migração, Trackmate) para analisar a motilidade celular e a migração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

A cultura celular convencional foi desenvolvida há quase um século e continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado na pesquisa biomédica, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos no câncer17. Os modelos animais oferecem a maior relevância fisiológica e similaridade genética razoável para os seres humanos, mas há muito têm sido reconhecidos para ter limitações significativas na predição de resultados humanos18. Entre todo...

O câncer tem sido cada vez mais reconhecido como um ecossistema complexo que depende não só da continuação da desregulação das populações de células mutadas, mas também de interações vitais entre as células cancerosas e o microambiente hospedeiro. Nesse sentido, o câncer evolui em uma paisagem adaptativa manifestada por uma combinação de fatores, incluindo um microambiente de tumor heterogêneo e conversa cruzada com uma variedade de células hospedeiras, todas as quais contribuem com pressões seletivas para mais genética ou alterações epigenéticas1,2,3. No contexto de tumores sólidos, a distribuição desigual de quimioterápicos e outros gradientes de recursos contribui para sua heterogeneidade molecular e pode desempenhar um papel no desenvolvimento da resistência a fármacos, aumento da angiogênese para o tumor particular subpopulações e até mesmo metástase4,5,6. Estudos de cultura de células 2D convencionais in vitro, possuindo capacidade experimental de grande escala e conveniente, proporcionam condições de campo médio, uniformes e fixas, muitas vezes faltando o controle ambiental preciso e espacial necessário para realmente emular a dinâmica tumoral in vivo. Assim, há a necessidade de modelos ex vivo mais representativos para reproduzir o microambiente tumoral antes dos modelos animais no pipeline de desenvolvimento de fármacos para uma melhor predição da progressão do câncer, bem como respostas a drogas dentro do estresse dinâmico Paisagens. Microfluínicos têm sido propostos para colmatar a lacuna entre estudos de cultura de células 2D e estudos em animais mais complexos in vivo que podem não ser capazes de suportar estudos quantitativos verificáveis7,8,9.
Um sistema in vitro ideal para caracterizar a dinâmica das células cancerosas deve possuir a capacidade de gerar um microambiente heterogêneo para imitar as respostas celulares adaptativas que podem ocorrer em um tumor, bem como permitir a observação dessas dinâmicas em um resolução de uma única célula. Neste artigo, descrevemos uma plataforma de cultura de células microfluídico, um dispositivo baseado em PDMS chamado "Evolution Accelerator" (EA), que permite estudos paralelos in vitro de dinâmicas de células cancerosas em resolução celular com aquisição de dados em tempo real sobre o curso de semanas, enquanto mantendo estavelmente gradientes de stress em toda a paisagem da cultura. O projeto desta plataforma é baseado em nosso trabalho precedente, em que a dinâmica evolutiva dos organismos em um metapopulação pode ser acelerada10,11. Especificamente, em um grupo de populações espacialmente separadas que interagem em algum nível, quando expostos a uma paisagem de estresse heterogêneo, as espécies mais aptos podem dominar em uma população local mais rapidamente em comparação com a de uma grande população uniforme. As espécies vantajosas então migram para os microhabitats vizinhos em busca de recursos e espaço, e eventualmente dominam toda a população. Como mostrado na Figura 1, o padrão do chip microfluídico ea é composto de (i) um par de canais serpentinos que fornecem circulação de mídia fresca e constroem condições de contorno fixo para difusão química, e (II) a região de cultura de células hexagonais que consiste em 109 câmaras sextavadas e 24 meio-hexagonais interconectadas no centro, assemelhando-se a uma estrutura alveolar. O chip é de 100 μm em profundidade. Os canais de mídia e a região da cultura celular estão conectados com pequenas fendas (cerca de 15 μm de largura), que impedem o fluxo direto de mídia e o estresse de cisalhamento resultante em toda a área de cultura celular, mas ainda permitem que os produtos químicos se difundem através de pequenas fendas e trocam nutrientes, resíduos metabólicos, etc. A geração de gradientes químicos é demonstrada na Figura 1B, onde um canal de mídia contém 0,1 mm de fluoresceina, enquanto o outro canal está livre de fluoresceina. As pilhas são cultivadas em uma membrana permeável do gás, encapsulada pelas microestruturas com a pressão traseira positiva na membrana de encontro à microplaqueta. Os componentes do suporte do dispositivo são ilustrados na Figura 2, e a configuração experimental é ilustrada na Figura 3, onde a cultura é mantida em um microscópio invertido a 37 ° c, com acima de 85% de umidade relativa, e condicionada composição do gás normóxia.
Este sistema fornece a observação detalhada de interações celulares localizadas através do brightfield e de canaletas fluorescentes e permite os ensaios a jusante espacialmente-resolvidos tais como a imunofluorescência, o borrão ocidental, ou a espectrometria maciça. Nós demonstramos previamente como uma prova--princípio deste modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta na cocultura a longo prazo de pilhas epithelial e mesenquimais do cancro da próstata PC312 assim como o emergence do gigante poliplóides da droga-resistência células cancerosas usando a linha celular PC3 epitelial13. Quando nós apresentamos a aplicação desta plataforma para compreender a dinâmica armazenamento de PC3 epithelial e de pilhas mesenquimais do cancro da próstata um inclinação do stress de docetaxel, o sistema microfluídicos pode facilmente ser aplicado a toda a combinação de linhas de pilha e recursos (i.e., drogas, nutrientes, oxigênio) gradientes.

<table><tbody><tr><td>Seringas de ponta Luer-Lok BD 10 mL</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x anti-anti</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>Revelador fotorresistente</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>Fotorresistente</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>Fotorresistente</td></tr><tr><td>Cr Cromo Etchant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66 + laserwriter</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66 +</td> <td>Fotomáscara de escrita</td></tr><tr><td>Hexametildisilazane (HMDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>Para aprimoramento de adesão fotorresistente</td></tr><tr><td>Pinos de aço ocos</td><td>Novo Tubo Pequeno da Inglaterra</td><td>NE-1300-01</td><td>. 025 OD .017 ID x .500 long / tipo 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi Sistema de Aquecimento, Placas Multi-Poço, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>Incubadora no palco&nbsp;</td></tr><tr><td>Agulha dispensadora Luer-Lok 23 G</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Para conectar seringas e tubos</td></tr><tr><td>Placa Lumox 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>Placa de cultura de células permeáveis a gás</td></tr><tr><td>Removedor de micropositos 1165</td><td>Dow Electronic Materials</td><td>Removedor de micropositores 1165</td><td>Removedor de fotorresistentes</td></tr><tr><td>Microseal B Selador adesivo</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td> O-Ring selador</td></tr><tr><td>(para vedação de placa Lumox)</td> <td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Anel O-Ring Duro 70</td></tr><tr><td>(para vedação de janela de vidro inferior)</td> <td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Painel No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen Sistema de Limpeza/Gravação de Plasma Plasmatic</td><td>Systems, Inc</td><td>Plasma-Preen</td><td>Sistema de plasma de oxigênio</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>Sistema de gravação de íons reativos profundos Alinhador de</td></tr><tr><td>máscara SUSS MA6 Alinhador</td> de máscara <td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone Sylgard 184 Elastômero</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>TePla M4L gravador de plasma</td><td>PVA TePla</td><td>M4L</td><td>Gravador de plasma</td></tr><tr><td>Tricloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil-silano (PFOTS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Para silanização de wafer de silício</td></tr><tr><td>Tubo microbore Tygon (0,020 "x 0,060" OD)</td> <td>Tubos Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td> para entrega de mídia</td></tr></tbody></table>

geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução microfluídico para observação em tempo real

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

A cultura celular convencional continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos em câncer. Modelos de câncer microfluídico em chip têm sido propostos para colmatar a lacuna entre as culturas 2D convencionais supersimplificadas e modelos animais mais complicados, que têm capacidade limitada para produzir resultados quantitativos confiáveis e reprodutíveis. Aqui, nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta que reproduz componentes chaves de um microambiente complexo do tumor em uma maneira detalhada, contudo é simples bastante fornecer descrições quantitativas robustas da dinâmica do cancro. Este modelo microfluídico de câncer em chip, o "Evolution Accelerator", divide uma grande população de células cancerosas em uma matriz interconectada de microambientes tumorais, gerando uma paisagem de estresse quimioterápico heterogêneo. A progressão e a dinâmica evolutiva do câncer em resposta ao gradiente de drogas podem ser monitoradas por semanas em tempo real, e inúmeros experimentos a jusante podem ser realizados de forma complementar às imagens de lapso de tempo tiradas no decorrer dos experimentos.

Validação do crescimento celular ideal no chip Um dos principais objetivos da plataforma experimental é reproduzir os principais componentes e interações em um microambiente de tumor complexo de forma abrangente, mas simples o suficiente para fornecer dados quantitativos, confiáveis e reprodutíveis. Este objetivo só pode ser alcançado se tivermos controle total dos fatores ambientais físicos e bioquímicos. Devemos excluir os fatores indesejados ou descobrir uma maneira...

Nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta, a tecnologia do "acelerador evolução", que fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos em tempo real a longo prazo da dinâmica do cancro dentro das condições ambientais bem definidas no único-Cell Nível. Espera-se que esta tecnologia funcione como um modelo in vitro para pesquisa fundamental ou desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Este modelo de câncer microfluido no chip, que chamamos de acelerador de evolução, fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos de longo prazo e em tempo real da dinâmica do câncer dentro de condições ambientais bem definidas em um único nível celular. A tecnologia nos permite sondar a dinâmica evolutiva do câncer sob uma paisagem de estresse semelhante a um tumor. Fornecendo informações incluindo morfologia, população, motilidade e migração ao longo do tempo no nível celular.Com a capacidade de controlar e monitorar o comportamento das populações de tumores mistos sob gradientes de estresse bem controlados, nossa tecnologia pode apresentar um modelo mais fisiologicamente relevante para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. O método de embalagem de vedação de pressão apresentado também pode ser implementado em outros sistemas microfluidos que exigem ajuste sofisticado da composição do gás ambiente, bem como a capacidade de experimento a jusante. As chaves para realizar com sucesso um experimento de longo prazo é garantir um ambiente fisicamente e bioquimicamente estável.Fatores como temperatura, umidade e composição do gás devem ser monitorados o tempo to

generation-heterogeneous-drug-gradients-across-cancer-populations-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós descrevemos um protocolo para a microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos que pode gerar gradientes espaciais e temporais bem definidos em microambiente. Nesta abordagem, o dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser usado para estudar a migração celular dirigido, a embriogênese, cicatrização de feridas, e metástase de câncer.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

Nós apresentamos o procedimento para a fabricação e operação de um dispositivo micro que recria heterogêneos microambientes...

Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor<em&gt; In Vitro</em

Descrevemos um ensaio de sensibilidade a medicamentos de alto rendimento para células primárias de mieloma múltiplo. Consiste em uma reconstrução do microambiente da medula óssea (incluindo matriz extracelular e estroma) em placas de múltiplos poços e um método não invasivo para quantificação longitudinal da viabilidade celular.

Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

O controle de gradientes químicos e de oxigênio é essencial para culturas de células. Este artigo relata um dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato (PDMS-PC) capaz de gerar de forma confiável combinações de gradientes químicos e de oxigênio para estudos de migração celular, que podem ser praticamente utilizados em laboratórios biológicos sem instrumentação sofisticada.

Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Este relatório descreve um método chip-baseado microfluídicos para estabelecer uma única experiência da cultura da pilha em que o emparelhamento de alta eficiência e a análise microscópica de pilhas únicas múltiplas podem ser conseguidos.

Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico

Apresentamos um sistema microfluido para estudos de alto rendimento em máquinas de vida complexas, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. O chip microfluido permite a análise das condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

A hipóxia é uma marca registrada do microambiente tumoral e desempenha um papel crucial na progressão do câncer. Este artigo descreve o processo de fabricação de um câncer hipóxico baseado na tecnologia de impressão celular 3D para recapitular uma patologia relacionada à hipóxia do câncer.

Câncer hipoxico impresso em células 3D para recapitulando progressão patológica do câncer sólido

Aprenda a gerar gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer usando um acelerador de evolução microfluídico. Esta plataforma permite estudos quantitativos em tempo real da dinâmica tumoral em nível de célula única.

Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real

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