Name: Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a triar peptídeos que se ligam ao receptor FGFR2 usando biblioteca de phage display. Este protocolo eficiente identifica moduladores com alta afinidade e avalia seus efeitos na proliferação celular in vitro.

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Este trabalho foi apoiado pelo programa de ciência e tecnologia de Guangzhou (n º 2016201604030039).

1. preparação do reagente
<ol><li>LB (caldo lysogeny) médio: dissolver 1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, e 0,5 g de NaCl em 100 mL de H2O. autoclave e armazenar a 4 ° c.</li>
	<li>Estoque de tetraciclina: Prepare 20 mg/mL em 1:1 etanol: H2O. Armazene em-20 ° c, e Vortex antes de usar.</li>
	<li>Solução de IPTG/X-GAL: misture 0,5 g de IPTG (isopropyl β-D-1-tiogalactopyranoside) e 0,4 g de X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside) em 10 mL de DMF (dimetil formamida). A solução pode ser armazenada a-20 ° c durante um ano no escuro.</li>
	<li>LB + tetraciclina (Tet) placas: Dissove 1 g de Bacto-triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de NaCl, e 1,5 g de agar em 100 mL de H2O. autoclave e arrefecer a &Lt; 70 ° c. Adicionar 100 μL do estoque de tetraciclina e despeje as placas. Armazene as placas a 4 ° c no escuro.</li>
	<li>LB + IPTG/X-GAL placas: dissolver 1 g de Bacto-triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de NaCl, e 1,5 g de agar em 100 mL de H2O. autoclave e arrefecer a &Lt; 70 ° c. Adicione 100 μL da solução de IPTG/X-GAL e despeje as placas. Armazene as placas a 4 ° c no escuro.</li>
	<li>Tampão glicina-HCI (0,2 M): dissolver 1,5014 g de glicina e 100 mg de BSA (albumina sérica bovina) em 100 mL de H2o e ajustar o pH para 2,2 com HCl. filtre a solução utilizando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° c.</li>
	<li>Tampão Tris-HCl (1 M): dissolver 12,11 g de tris (Tris (hidroximetil) aminometano) em 100 mL de H2o e ajustar o pH para 9,1 com HCl. autoclave e armazenar a 4 ° c.</li>
	<li>Tampão de revestimento (0,1 M): dissolva 1,68 g de NaHCO3 em 200 ml de H2o e ajuste o pH a 8,6 com NaOH. Filtre a solução utilizando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° c.</li>
	<li>Tampão de bloqueio: Prepare 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) com 5 mg/ml de BSA. Filtre a solução utilizando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° c.</li>
	<li>TBS: Prepare 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) com 150 mM NaCl. Autoclave e loja à temperatura ambiente.</li>
	<li>0, 5%, 0,1%, ou 0,5% TBST: Prepare TBS com 0, 5%, 0,1%, ou 0,5% (v/v) Tween-20. Filtre usando um filtro de 0,22 μm e armazene à temperatura ambiente.</li>
	<li>PEG/NaCl: Prepare 20% (w/v) polietileno glicol – 8000 com 2,5 M NaCl. Autoclave e loja à temperatura ambiente.</li>
	<li>Solução TE: misture 1 mL de Tris-HCl 1 M (pH 8.0) e 2 mL de EDTA 50 mM (pH 8,0) e ajuste o volume para 100 mL com H2O. autoclave e loja à temperatura ambiente.</li>
	<li>Tampão de iodeto: dissolva 30 g de NaI em 50 mL de TE, pH 8,0. Guarde a solução à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Ágar superior: dissolver 1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de NaCl e 0,7 g de agarina em 100 mL de H2O. autoclave e dispensar 15 ml de alíquotas. Armazene à temperatura ambiente para o uso.</li>
</ol>2. primeira rodada de biopanning: triagem clones de fago que se ligam ao domínio extracelular de FGFR2
Nota: Use pontas de pipeta resistentes ao aerossol e luvas de desgaste para todos os protocolos, a fim de minimizar a contaminação com bacteriófagos ambientais.
<ol><li>Prepare uma solução de 10 μg/mL FGFR2 (pureza > 97%; ver tabela de materiais) em tampão de revestimento. Adicione 1 mL da solução preparada a um prato de 35 cm2 e gire-o repetidamente até que a superfície esteja completamente molhada. Incubar durante a noite a 4 ° c com agitação. Nota: para evitar a seleção de ligantes alvo de chamariz, a proteína alvo deve ser altamente purificada.</li>
	<li>Inocular 5 mL de LB + Tet médio com Escherichia coli (E. coli) ER2738 por 5 – 10 horas a 37 ° c com agitação. As células ER2738 amplificadas serão usadas para titulação na etapa 3,3.</li>
	<li>Despeje a solução de revestimento do prato (a solução em excesso deve ser removida) e adicione a solução de bloqueio. Incubar a 4 ° c durante pelo menos 1 h.</li>
	<li>Elimine a solução de bloqueio e lave 6 vezes rapidamente com TBST (TBS + 0, 5% (v/v] Tween-20). Evite secar o prato.</li>
	<li>Reconstituir a biblioteca de fago original em 1 mL de TBST [concentração final de 1011 unidades formadoras de placas (Pfu)], adicione ao prato revestido, e balanç delicadamente para 2 h em um abanador na temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e lave o prato 10x com TBST (TBS + 0, 5% (v/v) Tween-20), conforme realizado na etapa 2,4. Nota: os fagos não acoplados devem ser removidos completamente pela lavagem vigorosa.</li>
	<li>Elute o fago acoplado adicionando 1 mL do amortecedor de 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,2) ao prato e balanç delicadamente por 10 minutos na temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira o eluato para um tubo de microcentrífuga esterilizado e neutralizar-o com 100 μl de 1 M de Tris-HCl, pH 9,1. Nota: na etapa 2,6, remova o fago não acoplado tanto quanto possível lavando o prato 10x vigorosamente. Este é um passo crucial. O fago eluída pode ser armazenado em 4 ° c por uma semana. No entanto, é melhor ir para a frente para a próxima etapa, logo que possível.</li>
</ol>3. determinação do título dos fagos eluída
<ol><li>Placas de LB + IPTG/X-GAL pré-quentes para, pelo menos, 1 h a 37 ° c antes da utilização.</li>
	<li>Prepare 100 μL de diluições seriadas de 10 vezes (ou seja, 101, 102, 103 e 104) do eluato da etapa 2,8 em lb. Use pontas com cartuchos de filtro para evitar a contaminação.</li>
	<li>Deixe a cultura da etapa 2,2 atingir a fase mid-log (OD600 ≈ 0,5). Dispensar 200 μl da cultura em tubos de microcentrífuga esterilizados, um para cada diluição de eluato.</li>
	<li>Para iniciar a infeção, adicione 10 μL de cada diluição do passo 3,2 a tubos de microcentrífuga individuais que contenham a cultura E. coli ER2738 a partir do passo 3,3. Vortex rapidamente e incubar à temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Cubra 90 μL da mistura da etapa 3,4 nas placas LB + IPTG/X-GAL com varas de revestimento.</li>
	<li>Opcionalmente, derreter o agar superior em um microondas, dispensar 3 mL em tubos de cultura estéreis, um para cada diluição eluída, e manter os tubos a 45 ° c. Transfira a mistura do passo 3,4 para os tubos de cultura contendo o agar superior de 45 ° c. Misture rapidamente e derrame imediatamente a cultura em uma placa pre-warmed de LB/IPTG/X-GAL. Incline suavemente e gire a placa para espalhar o ágar superior uniformemente.</li>
	<li>Após 5 min, inverta e incubar placas durante a noite a 37 ° c.</li>
	<li>Conte chapas em placas com aproximadamente 100 placas. Multiplique cada número pelo fator de diluição para que a placa obtenha o Titer do fago em PFU por 10 μL.</li>
	<li>Inocular outro 5 mL de LB + Tet médio com E. coli ER2738 a 37 ° c durante a noite com agitação para a amplificação de fago. Nota: Use a cultura de ER2738 na fase do mid-log (OD600 ≈ 0,5) para o Titer do fago. Se a maioria das chapas são brancas nas placas X-GAL/IPTG, isso significa que o pool de fago foi contaminado com bacteriófagos selvagens. Se a contaminação ocorre, é necessário começar outra vez com os passos de panning da solução de estoque não contaminada do fago.</li>
</ol>4. amplificação de Phage
<ol><li>Diluir (1:100) a cultura durante a noite a partir do passo 3,8 em 20 mL de LB num balão de 250 mL de Erlenmeyer. Adicione o eluato não amplificado e incubar com agitação vigorosa para 4,5 h em 37 ° c.</li>
	<li>Transfira a cultura para um tubo de centrifugação e Centrifugue durante 10 min a 12.000 x g a 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco, centrifugue novamente e descarte o pellet.</li>
	<li>Transfira o 80% superior do sobrenadante a um tubo fresco e adicione-lhe 1/6 volume de 20% PEG/2.5 M NaCl. Permitir que o fago para precipitar a 4 ° c durante a noite. Nota: Misture o sobrenadante de cultura com PEG/2.5 M NaCl bem.</li>
	<li>Centrifugue o fago precipitado em 12.000 x g por 15 minutos em 4 ° c. Descarte o sobrenadante, centrifugue novamente e retire o sobrenadante residual com uma pipeta.</li>
	<li>Ressuscitar o pellet em 1 ml de TBS e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga. Centrifugador a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° c.</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco e precipitar novamente adicionando 1/6 volume de 20% Peg/2.5 M NaCl. Incubar no gelo por 15 – 60 min. centrifugador a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante, re-spin, e retire o sobrenadante residual com uma pipeta.</li>
	<li>Ressuscitar o pellet em 200 μL de TBS e centrifugar por um minuto adicional para remover as impurezas. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco para obter o eluato amplificado.</li>
	<li>Titer o fago amplificado como descrito na seção 3. Nota: a diluição do eluato amplificado é maior em comparação com o eluato não amplificado; diluições seriais de 108– 1011 são tipicamente sugeridas.</li>
</ol>5. segunda rodada de contra
<ol><li>Repita as secções 2 a 4.</li>
	<li>Titer a segunda rodada do eluato amplificado nas placas LB + IPTG/X-GAL, conforme descrito na seção 3. Nota: Reduza a concentração de revestimento da proteína FGFR2 para 5 μg/mL. Use o fago amplificado da etapa 4,7 como a entrada e mantenha o Titer mesmos que na primeira rodada (1011 Pfu). Encurtar o tempo de incubação de fago e FGFR2-revestido prato para 1 h e aumentar a concentração de Tween para 0,1% (v/v) nas etapas de lavagem.</li>
</ol>6. terceira rodada de contra
<ol><li>Repita os passos 2.1-2.6.</li>
	<li>Elute o fago encadernado adicionando 1 ml da solução de 20 μm bFGF (um ligante para FGFR2) ao prato e balanç delicadamente para 60 minutos na temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita os passos 3.1-3.7. Nota: Reduza a concentração de revestimento da proteína FGFR2 para 2,5 μg/mL. Use a segunda rodada de fago amplificado da seção 5 como a entrada e manter o Titer mesmo como na primeira rodada (1011 Pfu). Encurtar o tempo de incubação de fago e FGFR2-revestido prato para 30 min e aumentar a concentração de Tween para 0,5% (v/v) nas etapas de lavagem.</li>
</ol>7. aquisição de DNA de chapa para sequenciamento
<ol><li>Amplificação da placa<ol>
<li>Diluir (1:100) uma cultura overnight de ER2738 em LB. Dispense 1 mL de cultura diluída em um tubo de 2 mL, um para cada clone a ser caracterizado.</li>
		<li>Use uma ponta da pipeta para escolher uma placa colorida azul bem separada de uma placa do Titer da seção 6 e transfira-a ao tubo que contem a cultura diluída. Escolha um total de 15 placas. Nota: as placas devem ser < 1 – 3 dias de idade, armazenadas a 4 ° c, e têm < placas 100.</li>
		<li>Incubar os tubos com agitação vigorosa para 4,5 h em 37 ° c.</li>
		<li>Transfira as culturas para tubos de centrifugação e Centrifugue a 12.000 x g durante 30 s. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e centrifugue novamente.</li>
		<li>Usando uma pipeta, transfira o superior 80% do sobrenadante a um tubo fresco. Rotule isso como o estoque de fago amplificado. Nota: diluir a fago amplificada com um volume igual de 100% de glicerol estéril e armazenar a-80 ° c para uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extração de DNA de chapa<ol>
<li>Transfira 500 μl do fago amplificado a um tubo de microcentrífuga fresco e adicione um volume 1/6 de NaCl de 20% Peg/2.5 M. Inverta para misturar e deixá-lo ficar por 10 – 20 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugue a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c e, em seguida, despeje o sobrenadante. Nota: a pelota de fago pode não estar visível.</li>
		<li>Centrifugue novamente. Remova cuidadosamente qualquer sobrenadante restante.</li>
		<li>Ressuspender completamente o pellet em 100 μL do tampão de iodeto, tocando vigorosamente o tubo.</li>
		<li>Adicionar 250 μL de 100% de etanol e incubar por 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugue a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c e retire o sobrenadante. Lave a pelota com 0,5 mL de etanol 70%, centrifugue rapidamente novamente, retire o sobrenadante e seque brevemente o pellet.</li>
		<li>Ressuspender o pellet em 30 μL de tampão TE e utilizá-lo para sequenciamento. Nota: pré-Resfrie o etanol a 70% a-20 ° c antes da etapa 7.2.6. A pelota do fago deve completamente ser ressuscipended no amortecedor do iodeto antes da adição do ethanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. identificação da sequência peptídica
<ol><li>Use o primer de sequenciamento-96 gIII (5 ́-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG – 3 ́) para sequenciamento.</li>
	<li>Analise as sequências peptídicas exibidas na fago com base nos resultados de sequenciamento de DNA.</li>
	<li>Sintetizar pequenos peptídeos e analisar por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas para confirmar sua pureza (≥ 98%).</li>
</ol>9. detectando a afinidade do peptídeo pequeno obtido e da proteína extracelular de FGFR2 por ITC
<ol><li>Água estéril de Degas usando um instrumento ultra-sônico. Dissolva o pequeno peptídeo e a proteína FGFR2 extracelular em água estéril. Centrifugue estas amostras para remover o precipitado residual.</li>
	<li>Realize os experimentos de titulação ITC a 25 ° c. Titrate 40 μM de peptídeo pequeno na célula com 1,5 μM de proteína FGFR2 da seringa, com uma velocidade de agitação de 750 rpm. Adicione a proteína FGFR2 em 2 μL de alíquotas (para um total de 19 injeções) em intervalos de 5 min.</li>
	<li>Analise os dados ITC usando um modelo de ligação de site único. Nota: a água estéril deve ser desgaseificada, e todas as amostras devem ser centrifugadas para remover bolhas de ar e impurezas residuais. O experimento deve ser conduzido a uma temperatura constante de 25 ° c.</li>
</ol>10. verificar a atividade biológica do pequeno peptídeo obtido utilizando um ensaio de proliferação celular
<ol><li>Células de semente BALB/c 3T3 (3,0 × 103 células/poço, 100 μL) em uma placa de 96 poços com o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 10% (FBS) durante a noite a 37 ° c e 5% co2.</li>
	<li>Substitua o sobrenadante com DMEM fresco com 0,5% FBS e morra de fome as pilhas por 12 h.</li>
	<li>Faça diluições seriais do pequeno peptídeo (0, 0, 64, 0, 32, 0,16, 0,8, 4, 20 e 100 μM) com DMEM fresco suplementado com 0,5% FBS (6 poços duplicados/concentração). Retire o sobrenadante da placa 96-well e adicione 100 μL da solução pequena do peptide por bem. Incubar para 48 h a 37 ° c e 5% CO2.</li>
	<li>Substitua o sobrenadante por DMEM fresco contendo 10% kit de contagem de células (CCK)-8 solução e incubar por 2 h.</li>
	<li>Meça a absorvência de cada poço em 450 nanômetro com um leitor do microplate e analise a viabilidade da pilha.</li>
</ol>

<ol><li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li>
<li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signaling%3A+from+development+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li>
<li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93(2010).</li>
<li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li>
<li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li>
<li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FIIa+study+evaluating+the+safety%2C+efficacy%2C+pharmacokinetics%2C+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li>
<li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713(2012).</li>
<li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li>
<li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li>
<li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li>
<li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8(2016).</li>
<li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li>
<li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li>
<li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+M13+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li>
<li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li>
<li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li>
<li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li>
<li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li>
<li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29-mediated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li>
<li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li>
<li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85(2008).</li>
<li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478(2014).</li>
<li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vasculature+address+book%3A+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li>
<li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses financeiros.

Uma biblioteca de fago combinatória é uma ferramenta poderosa e eficaz para a seleção da elevado-produção de peptídeos novos que podem ligar moléculas do alvo e regular sua função13. Atualmente, as bibliotecas do peptide do indicador do fago têm uma escala larga das aplicações. Por exemplo, eles podem ser usados para selecionar peptídeos bioativos vinculados a proteínas do receptor23, alvos não proteicos24,25, antig...

Os receptores do fator de crescimento de fibroblastos (FGFRs) desempenham papéis-chave na proliferação celular, cicatrização de feridas e angiogênese in vivo1. A ativação aberrante da sinalização de FGFR observada em uma variedade de tumores2,3,4,5 inclui amplificação genética, mutações genéticas, aberrações cromossômicas e secreção excessiva de ligante6 . Muitos inibidores que visam o FGFRs mostraram efeitos terapêuticos promissores em ensaios clínicos e são principalmente classificados em três tipos: (1) inibidores da pequena molécula quinase, que se ligam ao domínio intracelular de FGFR, (2) antagonistas que visam a segmento extracelular e (3) armadilhas de ligantes FGF6. Embora diversos dos inibidores pequenos da quinase da molécula tenham bons efeitos terapêuticos in vitro e in vivo7, a maioria deles têm a especificidade pobre do alvo e mostram efeitos adversos tais como a hipertensão8. A maioria dos antagonistas são anticorpos monoclonais9,10 e polipeptídeos11. Peptídeos têm vantagens sobre pequenas moléculas devido à sua especificidade e efeitos colaterais inferiores. Eles também mantêm a permeabilidade celular e não se acumulam em órgãos específicos, em comparação com as drogas proteicas12. Assim, os pequenos peptídeos direcionados são agentes terapêuticos efetivos e prospectivos.
A tecnologia de display phage é uma ferramenta fácil, mas poderosa,para identificar pequenos peptídeos que podem se vincular a uma determinada molécula13,14,15. Nós usamos uma biblioteca do peptide da exposição do fago que seja baseada em um fago simples de M13 com sobre 109 seqüências diferentes do peptide indicadas na cauda para ligar à molécula do alvo (veja a tabela dos materiais)16. Devido à afinidade elevada dos fagos para a molécula dada, os fagos desligados podem ser lavados afastado, e somente os fagos firmemente limitados com os peptídeos curtos desejados são retidos. As metas moleculares dadas podem ser imobilizadas proteínas17,18, carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos19,20. Um caso emocionante foi relatado onde os peptídeos órgão-específicos foram selecionados in vivo usando a tecnologia da exposição do fago21. As vantagens da tecnologia da exposição do fago incluem a taxa de transferência elevada, a facilidade de operação, o baixo custo e uma escala larga das aplicações22.
Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado de triagem de peptídeos pequenos que ligam a proteína imobilizada (FGFR2) usando uma biblioteca de exibição de fago. A eficácia da tecnologia é examinada igualmente medindo a afinidade do peptide obtido para FGFR2 pela calorimetria de titulação isothermal (ITC), e pela atividade biológica por um ensaio da proliferação de pilha. O método pode ser estendido para a triagem de pequenos peptídeos que se ligam a carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; m Filtro</td><td>Merck Millipore</td><td>MPGP002A1</td><td></td></tr><tr><td>35 cm2 Prato pequeno</td><td>Thermo</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Guangzhou fábrica de reagentes químicos</td><td>64-17-5-96</td><td></td></tr> <tr><td>gIII sequenciamento</td><td></td><td></td> primer <td>Síntese da Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Nest</td><td>701001-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Beyotime</td><td>ST004D</td><td></td></tr><tr><td>Oxóide de bacto-triptona</td><td></td><td>L0037</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 3T3 células</td><td>ATCC</td><td>CRL-&tímido; 6587</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Biodragon</td><td>BD-M10110</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 kit</td><td>DOJINDO</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>sh30243.01</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Newprobe</td><td>PB10247</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 Protein</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10014-HNAE</td><td>Pureza >95%</td></tr> <tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Beyotime</td><td>ST097</td><td></td></tr><tr><td>ITC200 sistema</td><td>MicroCal Omega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Guangzhou fábrica de reagentes químicos</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>NaI</td><td>Bidepharm</td><td></td><td></td>BD40879</tr><tr><td>NaOH</td><td>Guangzhou fábrica de reagentes químicos</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PEG&ndash; Kit</td> de biblioteca de peptídeos de exibição de fagos 8000 <td></td><td>Sigma P2139-250</td><td></td></tr><tr><td>Ph.D.-7</td><td>New England BioLabs</td><td>E8100S</td><td>Contendo a biblioteca de fagos Ph.D.-7, cepa hospedeira E. coli cepa hospedeira ER2738 e fagos de controle M13KE</td></tr><tr><td>Proteínas de domínio extracelular FGFR2 recombinantes</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10824-H08H</td><td>Pureza > 97%</td></tr> <tr><td>Síntese de peptídeos</td><td></td><td></td><td>pequenos da GL Biochem Ltd. (Xangai, China)</td></tr> <tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>S-SHS-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>SLF-T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Beyotime</td><td>ST912</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Oxóide</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de phage display

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

A família humana do receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR) compreende quatro membros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3, e FGFR4, que são involvidos em várias atividades biológicas que incluem a proliferação, a sobrevivência, a migração e a diferenciação da pilha. Várias aberrações na via de sinalização FGFR, devido a mutações ou eventos de amplificação genética, foram identificadas em vários tipos de cânceres. Assim, pesquisas recentes têm focado no desenvolvimento de estratégias envolvendo direcionamento terapêutico de FGFRs. os inibidores atuais de FGFR em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico incluem inibidores da molécula pequena de tirosina cinases ou anticorpos monoclonais, com apenas alguns inibidores à base de peptídeos no gasoduto. Aqui, fornecemos um protocolo usando a tecnologia de exibição de fago para triagem de pequenos peptídeos como antagonistas de FGFR2. Resumidamente, uma biblioteca de peptídeos exibidos com fago foi incubada em uma placa revestida com FGFR2. Subseqüentemente, o fago não acoplado foi lavado fora por TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), e o fago encadernado foi eluída com tampão de 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,2). O fago eluída foi amplificado mais e usado como a entrada para a próxima rodada de biopanning. Depois de três círculos de biopanning, as seqüências do peptide de clones individuais do fago foram identificadas pelo sequenciamento do ADN. Finalmente, os peptídeos selecionados foram sintetizados e analisados quanto à afinidade e atividade biológica.

Obtendo um pequeno peptídeo de alta afinidade visando FGFR2.
Para a tela de fagos visando FGFR2, uma biblioteca de pH.D.-7 foi usada neste estudo. Uma representação esquemática do fluxo de trabalho é mostrada na Figura 1. Neste processo, o número de entrada do fago (PFU) foi mantido inalterado, visto que a concentração de revestimento da proteína FGFR2 foi reduzida gradualmente. Os resultados do Titer do fago sugeriram que o número de fagos recupe...

Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a seleção de peptídeos pequenos que se ligam a FGFR2 usando uma biblioteca de peptídeo de exibição de fago. Nós analisamos mais a afinidade dos peptídeos selecionados em direção a FGFR2 in vitro e sua capacidade de suprimir a proliferação celular.

Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Comparado com outros métodos, este protocolo é mais fácil de descobrir novos antagonistas, agonisteres e moduladores alésteres quantitativos e qualitativos sem conhecer a estrutura de diluição e formação da proteína alvo. Este protocolo é de alta eficiência, fácil de manusear, econômico e comercialmente disponível. Combine este método de triagem de alto rendimento com a análise itc, os pequenos peptídeos funcionais podem ser obtidos quantitativamente e qualitativamente.Demonstrando o procedimento estarão Ying Zhao e Qiang Wang, estudantes de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de FGFR2 no tampão de revestimento a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Adicione um mililitro da solução a um prato de 35 centímetros quadrados e gire repetidamente até que a superfície esteja completamente molhada.Incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. No dia seguinte, despeje a solução de revestimento e adicione a solução de bloqueio preparada. Incubar a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora, depois descartar a solução de bloqueio e lavar rapidamente a placa seis vezes com TBST, certificando-se de que o prato não secar.Reconstitua a biblioteca phage original em um mililitro de TBST e adicione isso ao prato revestido. Balance suavemente a placa em um shaker à temperatura ambiente por duas horas. Depois disso, descarte o supernaspe e lave o prato 10 vezes com TBST.Elute o phage vinculado adicionando um mililitro de 0,2 molar glycine HCL ao prato e balançando suavemente à temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o eluente para um tubo de microcentrifuuge esterilizado e neutralize-o com 100 microliters de um Tris-HCL molar em pH 9.1. Primeiro, pré-aquecimento as placas LB e IPTG X-Gal preparadas a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes do uso.Usando pontas de pipeta com cartuchos de filtro, prepare 100 microliters de diluições dez vezes do eluente em LB. Depois que a cultura E.coli preparada chegar à fase de tronco médio, dispense 200 microliters da cultura em tubos de microcentrifuuuge esterilizados um para cada diluição eluente. Para iniciar a infecção, adicione 50 microliters de cada diluição aos tubos contendo a cultura E.coli. Vórtice rapidamente e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, use varas de revestimento para revestir as placas LB e IPTG X-GAL com 90 microliters desta mistura. Depois de cinco minutos, inverta as placas e incuba-as durante a noite a 37 graus Celsius. Conte placas quando elas aparecerem.Para começar, diluir a cultura da noite para o dia em 20 mililitros de LB em um frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros. Adicione o eluent não amplificado e incubar a 37 graus Celsius com agitação vigorosa por 4-1/2 horas. Em seguida, centrifugar a cultura a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Transfira o supernatante para um tubo fresco. Centrifugar novamente usando as mesmas condições e descartar a pelota. Transfira os 80% superiores do supernascer para um tubo fresco e adicione-o ao 1/6º volume de 20% de polietileno glicol e 2,5 cloreto de sódio molar.Deixe o phage precipitar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar o phage precipitado a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Descarte o supernatante e a centrífuga novamente usando as mesmas condições.Use uma pipeta para remover o supernatante residual. Resuspenja a pelota em um mililitro de TBS e transfira o supernante para um tubo de microcentrifuge. Centrífuga a 12.000 vezes G e 4 graus Celsius por cinco minutos.Transfira o supernascer para um tubo de microcentrífuga fresco e precipitar novamente adicionando 1/6º volume de 20% de polietileno glicol e 2,5 cloreto de sódio molar. Incubar no gelo por 15 a 60 minutos. Em seguida, centrífuga a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Descarte o supernatante e a centrífuga novamente usando as mesmas condições. Use uma pipeta para remover o supernatante residual. Resuspenja a pelota em 200 microlitadores de TBS e centrífuga por mais um minuto para remover impurezas.Em seguida, transfira o supernatante para um tubo de microcentrifuuge fresco para obter o eluent amplificado. Neste estudo, o número de insumos de phage é mantido inalterado, enquanto a concentração de revestimento da proteína FGFR2 é gradualmente reduzida. Os resultados do phage titer sugerem que o número de phages recuperados aumenta gradualmente e que após três rodadas, há um aumento de 65 vezes em relação ao do primeiro turno.Um experimento itc é então conduzido para medir a afinidade do pequeno peptídeo ao FGFR2. Os resultados indicam que o peptídeo SP1 tem alta afinidade com fGFR2. Esses dados demonstram a eficiência do protocolo de triagem.Para investigar a atividade biológica do peptídeo SP1, é realizado um ensaio de proliferação de fibroblastos utilizando-se um kit CCK-8. BALB/C3T3 são incubados com o peptídeo SP1 em diferentes concentrações. Os resultados sugerem que o peptídeo SP1 suprime o crescimento das células.A contaminação por phages do tipo selvagem tem que ser evitada aqui. Certifique-se de usar pontas de pipeta resistentes a aerossóis. Enquanto o crescimento por meio da obtenção de amplificação phage.Este procedimento também pode ser usado na triagem de pequenos peptídeos que se ligam a carboidratos, células culturais e tecidos. Esses peptídeos podem ser mais amplificados sobre o diagnóstico e direcionados

screening-identification-small-peptides-targeting-fibroblast-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Uma biblioteca de mostrar fago foi utilizado para identificar seqüências de peptídeos que o osso alvo. O objetivo foi investigar o efeito destes peptídeos sobre a diferenciação de células mesenquimais e determinar seus efeitos sobre a regeneração óssea.

Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

A triagem de matriz de peptídeos é um ensaio de alto rendimento para identificar locais de interação proteína-proteína. Isso permite mapear várias interações de uma proteína-alvo e pode servir como um método para identificar locais para inibidores que têm como alvo uma proteína. Aqui descrevemos um protocolo para triagem e análise de matrizes de peptídeos.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Fornecemos um método para rastrear simultaneamente uma biblioteca de fragmentos de anticorpos quanto à afinidade de ligação e solubilidade citoplasmática usando a via de translocação de arginina dupla de Escherichia coli, que possui um mecanismo de controle de qualidade inerente para dobramento de proteínas intracelulares, para exibir os fragmentos de anticorpos na membrana interna.

Exibição Inner-membrana bacteriana para o rastreio de uma biblioteca de anticorpo Fragments

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Aqui nós apresentamos um método para selecionar para variantes novas do ligase BirA da biotina-proteína de E. coli que biotinylates um peptide específico do alvo. O protocolo descreve a construção de um plasmídeo para a exposição bacteriana do peptídeo alvo, geração de uma biblioteca BirA, seleção e caracterização de variantes de BirA.

Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

São descritas técnicas para a geração de uma biblioteca de peptídeos curtos que podem ativar células de mastro através do receptor MRGPRX2. As técnicas associadas são fáceis, baratas e podem ser estendidas a outros receptores celulares.

Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

Aprenda a triar peptídeos que se ligam ao receptor FGFR2 usando biblioteca de phage display. Este protocolo eficiente identifica moduladores com alta afinidade e avalia seus efeitos na proliferação celular in vitro.

Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display (Vídeo) | JoVE Journal

Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display

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