Caracterização de Sickling durante desoxigenação automatizada controlada com o gradiente ektacytometry do oxigênio

Ektacytometria de gradiente de oxigênio é um ensaio funcional que avalia a tendência doentia individual. Até o momento, nenhum outro ensaio funcional está disponível ou usado. Ektacytometria de gradiente de oxigênio é capaz de determinar a tensão de oxigênio em que as células sanguíneas do paciente com doença falciforme começam a ser foice.

Esta tensão de oxigênio é específica do paciente e pode servir como um biomarcador para a gravidade da doença. Na doença falciforme, essa técnica pode ser usada para monitorar a eficácia do tratamento e pode ser usada para o desenvolvimento de novos tratamentos. A demonstração visual dessa técnica é importante porque é muito sensível.

Existem inúmeros fatores que influenciarão a medição que você não sabe quando começa a trabalhar com essa técnica. Alguém que tenta isso pela primeira vez pode experimentar que a técnica é muito sensível para preparação de amostras e manuseio de amostras. Meu conselho é trabalhar o mais padronizado possível e desenvolver uma rotina.

Para iniciar este procedimento, ligue o computador e o ektacitômetro e abra o software no computador. Abra o cilindro de nitrogênio para ter certeza de que o nitrogênio está disponível para desoxigenar a amostra. Abaixe o bob na xícara e certifique-se de que o copo pode girar livremente.

Quando o software estiver em execução, verifique se a mensagem está aberta e clique em OK. Certifique-se de que o ektacitômetro inicie o processo de auto-verificação e selecione iniciar. Se a auto-verificação falhar, execute-a novamente clicando em verificação de hardware, pO2, auto-verificação. Escolha a varredura pO2 dos diferentes testes listados à esquerda.

Escolha as configurações à direita da tela e certifique-se de que elas sejam definidas de acordo com os parâmetros listados na tabela um do protocolo de texto, certificando-se de manter as mesmas configurações para cada medição. Salve essas configurações clicando em OK e clique em OK novamente. Primeiro, coletar amostras de sangue por venepuntura em um tubo contendo EDTA e armazenar o sangue a quatro graus Celsius por um mínimo de 30 minutos, mas não mais do que 24 horas.

Depois disso, misture as amostras suavemente por inversão para homogeneizar. Deixe as amostras aquecerem até a temperatura ambiente em um banco de rolos antes da medição. Use um analisador de hematologia para medir a contagem completa de sangue colocando a aspiração precisando no tubo e pressionando o botão atrás da agulha do analisador de hematologia para iniciar a medição e o analisador usará entre 20 e 200 microlitres de sangue inteiro.

Em seguida, padronize toda a amostra de sangue para uma contagem de RBC de 200 milhões de glóbulos vermelhos em cinco mililitros de PVP calculando o volume da amostra que será adicionada. Para começar, corte uma ponta de pipeta e pré-molhe-a resususentando o sangue três vezes. Em seguida, pipeta o volume amostral calculado em um frasco PVP.

Misture suavemente a amostra manualmente por inversão até que seja homogênea. Desenhe lentamente dois mililitros do sangue e mistura PVP em uma seringa de três mililitros sem a agulha. Empurre o êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar visíveis e solução de amostra em excesso até que entre 1,5 e 1,8 mililitros sejam deixados na seringa.

Injete o volume total da amostra lentamente e uniformemente no bob através do conector. Certifique-se de que o nível da amostra está acima do sensor de oxigênio e do pequeno orifício de sucção. No software, clique em novo e preencha o identificador de amostras, observações, data de doação e a viscosidade do PVP.

Clique em OK e aspire. Após 60 segundos de aspiração, o copo gira e aspira novamente por 15 segundos. Quando a rotação parar, clique em OK. Feche a tampa da máquina.

Clique continue e comece agora como ektacytometria de gradiente de oxigênio é feito com um ganho fixo. Após a medição, imprima o relatório que mostra a curva e os parâmetros que são calculados automaticamente pelo software. Certifique-se de que os dados brutos são armazenados automaticamente na pasta designada nas configurações.

Primeiro, remova a seringa amostra e substitua-a por uma seringa cheia de água destilada ou água desionizada. Pressione limpar e lavar lentamente o conector durante a lavagem, certificando-se de lavar em ambas as direções. Em seguida, remova a seringa e levante o bob.

Use um pano macio para secar completamente o bob e o conector. Em seguida, use uma seringa grande para lavar o conector, a fim de remover qualquer água restante no tubo e bob. Mantenha a seringa na entrada e bloqueie a saída do bob para recuperar a pressão nos tubos, removendo assim a água restante.

Em seguida, seque o copo enquanto evita tocar no ponto de oxigênio. Abaixe o bob e o copo preparando a máquina para a próxima medição. Depois de garantir que a máquina esteja bem enxaguada, verifique se os tubos adequados estão relacionados com a solução de limpeza.

Feche o software, pressione o fechamento e pressione o programa de limpeza do fim do dia. Em seguida, esvazie a garrafa de lixo e use um pano macio para secar o bob e o copo. Feche a tampa da máquina.

Feche o cilindro de nitrogênio e desligue o computador e a máquina. Ektacytometria de gradiente de oxigênio pode ser usada para estudar o comportamento doentio dos glóbulos vermelhos sob uma série de concentrações de oxigênio. Na ektacitoritometria de gradiente de oxigênio, a desoxigenação contínua da amostra por gás nitrogênio é seguida por rápida reoxigenação por ar ambiente.

Nessas condições, o adoecimento dos glóbulos vermelhos pode ser observado sob desoxigenação. Isso causará uma distorção do padrão de difração porque as células vermelhas doentes não se alinharão adequadamente sob o estresse aplicado da tesoura. Os glóbulos vermelhos da foice mostram uma mudança de forma durante a desoxigenação que imita condições durante a ektacittometria gradiente de oxigênio, mas não mostram nenhuma mudança na forma quando oxigenadas.

Este processo resulta em distorção do padrão de difração durante a ektacittometria de gradiente de oxigênio e, portanto, em uma diminuição no índice de alongamento. Uma curva representativa obtida pelo ektacitômetro mostra os seis parâmetros que refletem diferentes características do comportamento doentio: o índice máximo de alongamento, o índice mínimo de alongamento, o delta EI, o ponto de adoecimento, a área sob a curva e a recuperação. Curvas representativas de glóbulos vermelhos de controles saudáveis, pacientes com traços de HbS e um paciente com doença falciforme homozigosa são mostrados aqui.

As diferenças claras nas curvas representativas dos pacientes com células falciformes homozigos tratadas com ureia hidroxíl e transfusão destacam a utilidade deste ensaio. Existem inúmeros fatores que influenciam a ektacitometria gradiente de oxigênio, como temperatura, pH e osmolaridade do PVP, mas também remanescentes de água e o grau de mistura da solução amostra de sangue podem afetar as medidas. Portanto, o manuseio padronizado da amostra é essencial.

O resultado da ektacitoritometria de gradiente de oxigênio pode ser diretamente implementado na prática clínica, contribuindo assim para a medicina personalizada. Essa técnica permite estudar o comportamento doentio para investigar o potencial de novos tratamentos para a doença falciforme e pode servir como um biomarcador clinicamente relevante para a gravidade da doença.