Name: Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a modular múltiplos microRNAs simultaneamente em células eucarióticas usando clusters artificiais de DNA. Este método flexível minimiza etapas de clonagem molecular e oferece aplicações promissoras em terapia gênica para glioblastoma e outros cânceres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores desejam agradecer aos membros do laboratório de Oncologia neuro de Harvey Cushing por apoio e críticas construtivas. Este trabalho foi apoiado pelo NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.

1. caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma
<ol><li>Análise da expressão diferencial ampla de miRNA em glioblastoma versus cérebro
	<ol>
<li>Primeiramente, determine os miRNAs o mais significativamente desregulamentado no tumor. Isso pode ser conseguido usando pelo menos três métodos diferentes:<ol>
<li>Mine o Atlas do genoma do cancro, encontrado em https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para arranjar em seqüência dados11.</li>
			<li>Realize análises de Microarray a partir de um espécime operativo fresco12.</li>
			<li>Use os conjuntos de dados publicados anteriormente13. Nota: Seja qual for o método escolhido, a saída fornece um conjunto em massa de miRNAs cuja expressão é estatisticamente correlacionada (direta ou inversamente) com a biologia tumoral. Este grupo inicial constitui o conjunto de miRNAs que são analisados para a identificação de um subconjunto de miRNAs exibindo a associação funcional mais rigorosa, realizando uma análise mais dinâmica das alterações de expressão, como discutido abaixo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de expressão de miRNA específica da condição
	<ol>
<li>Indução da diferenciação celular:<ol>
<li>Use pratos plásticos pré-revestidos de poli-D-lisina (PDL) para favorecer a formação de uma cultura monocamada. Para o revestimento do prato, dissolva PDL na água em uma concentração de 100 μg/mL. Utilize 1 mL de solução por superfície de 25 cm2 . Enxague 2x com PBS 6 h após a aplicação da solução PDL.</li>
			<li>Placas de células-tronco neurais humanas em quantidades iguais (100.000 células/5 mL) em meio de células-tronco (meio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), meio de diferenciação astrocítica (DMEM + 10% FBS) ou meio de diferenciação neuronal (meio neurobasal + B27 suplemento, + 2 μM de ácido retinóico)14. O protocolo de diferenciação Oligodendrócito requer adição de IGF-1 (200 ng/ml) após a remoção de EGF/FGF14,15.</li>
			<li>Após o chapeamento de pilha, coloc na incubadora para 1 semana em 37 ° c, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Extração de RNA:<ol>
<li>Após 7 dias, retire as células da incubadora e retire o meio.</li>
			<li>Lave as células com PBS (5 mL). Em seguida, adicione 1 ml de reagente de lise (ver tabela de materiais) para lyse as células e raspar as células em 1,5 ml microcentrífuga tubo usando um raspador de células. Mantenha os tubos contendo as células lisadas à temperatura ambiente (RT) durante 5 min.</li>
			<li>Proceder ao isolamento total do RNA seguindo as instruções do fabricante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>análise de expressão de miRNA:<ol>
<li>Quantificar a expressão diferencial de miRNAs específicos identificados na etapa 1,1 entre os três padrões de diferenciação por PCR em tempo real, utilizando sondas TaqMan e seguindo os protocolos do fabricante para transcrição reversa e amplificação de PCR ( Figura 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Validação de clusters de miRNA por desafios específicos ao stress
	<ol>
<li>Cultura G34 glioblastoma células tronco-like em meio neurobasal + B27 suplemento + 20 ng/mL EGF/FGF. Comece com 1 x 106 células em 5 ml em um balão de fixação de 25 cm2 baixo.</li>
		<li>Começando 48 h após o chapeamento, adicione a duplicação de concentrações de temozolomida do agente alquilantes do ADN (TMZ) cada 5 dias, como segue:<ol>
<li>Comece com 5 μM durante 5 dias. Após 5 dias, retire o meio e substitua-o por meio fresco sem temozolomida, para permitir que as células sobreviventes se recuperem. Após 48 h, adicionar 10 μM TMZ e incubar por mais 5 dias.</li>
			<li>Repita a etapa 1.3.2.1, dobrando a concentração de TMZ cada vez, até que uma concentração pelo menos de 100 μM esteja alcangada e as pilhas se tornem resistentes à droga10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Em um experimento paralelo, irradiar células G34 da seguinte maneira:<ol>
<li>Começando 48 h após o chapeamento 1 x 106 células em 5 ml em um 25 cm2 baixo frasco de fixação, irradiar células com 2 GY de energia (qualquer irradiador fornecendo emissão de fóton é aceitável). Devolva as células à incubadora e não perturbe. Após 48 h, irradiar as pilhas outra vez com 2 GY adicionais da energia.</li>
			<li>Repita o passo 1.3.3.1 4x até que um total de 10 GY de energia é administrado.</li>
			<li>Retorne as pilhas à incubadora e deixe-as recuperar no meio fresco por pelo menos 5 dias antes da análise a jusante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Após a indução da resistência, as pilhas do lyse que usam o reagente do lysis e extraem o RNA total de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Analise a expressão dos miRNAs específicos identificados nas secções 1.1-1.2, conforme descrito no passo 1.2.1 (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Caracterização da convergência funcional de miRNAs clusterizadas
	<ol>
<li>Obtenha o targetome previsto de cada miRNAs definido nas seções 1.2-1.3 obtidas usando ferramentas de predição de segmentação de miRNA. Nota: Nós geralmente recorrem ao TargetScan, pois seu algoritmo é atualizado periodicamente16. As ferramentas de predição adicionais são miRanda17, mirdb18e Diana-mirpath19. Todos esses programas são aplicativos gratuitos e baseados na Web.<ol>
<li>Na primeira página do Targetscan, selecione o miRNA de interesse do menu suspenso pré-preenchido. Clique no botão Enviar .</li>
			<li>Baixe a lista de alvos resultante como uma planilha usando o link baixar tabela (complementar Figura 1).</li>
			<li>Para diminuir as chances de previsões falsas positivas, inclua somente alvos dentro da coluna de sites conservados em análises downstream. Também, mais rigor pode ser obtido usando programas adicionais da predição de Mirna (veja acima) e somente including os alvos que são comuns a todos os algoritmos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Classifique os targetomes resultantes de acordo com as categorias de ontologia gênica usando o ToppGene Suite20 para avaliar o enriquecimento de caminhos comuns a cada Mirna.<ol>
<li>Cole a lista de alvos obtidos da etapa 1.4.1 na janela "conjunto de genes de treinamento", usando o símbolo HGNC como o tipo de entrada. Clique em enviar > Iniciar. O programa fornecerá uma tabela de saída mostrando as categorias "Go" mais significativas para a lista de genes inseridos (Figura complementar 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para finalmente estabelecer a contribuição de cada miRNA para a regulação de um caminho comum ou processo celular (neste caso, a regulação da cromatina), verificar cada targetome obtido na etapa 1.4.1 contra a lista completa de genes envolvidos no processo celular específico ( ou seja, regulação da cromatina), utilizando a função de diagrama de Venn fornecida no site de bioinformática e genômica evolutiva http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. Nota: Este programa permite a interseção de vários grupos ao mesmo tempo (Figura 3). Os alvos únicos específicos fornecidos por cada miRNA são anotados então e selecionados para experimentos funcionais a jusante.<ol>
<li>Na primeira página do programa, carregue ou copie/cole a lista se o mRNAs de destino para cada miRNA ou interesse nas respectivas janelas. Nomeie cada lista com um identificador exclusivo.</li>
			<li>Clique em Submit. O programa fornecerá uma saída Visual de um diagrama de Venn com números de genes em cada setor, bem como uma lista completa de mRNAs para cada subconjunto e combinações de interseção.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. montagem de módulos de miRNA em um aglomerado transgênico Policístrônico
<ol><li>
Preparação de andaime transgênico baseado no locus de agrupamento miR-17-92
	<ol>
<li>Obtenha a sequência de nucleotídeo do cluster miR-17-92 do navegador do genoma do Ensemble21. Selecione o ~ 800 par base "Core" seqüência abrangendo todos os seis codificado Mirna grampos do locus e pelo menos 200-nucleotídeo flanqueando sequências de upstream (5 ') e downstream (3 ') da seqüência de núcleo.</li>
		<li>Cole a seqüência acima em qualquer programa de edição de palavras.</li>
		<li>Defina a sequência de cada um dos seis grampos de cabelo nativos, recuperando-os no miRBase22. Marque cada uma dessas sequências dentro do intervalo da seqüência "núcleo" identificada anteriormente. Todas as seqüências entre cada hairpin representam as seqüências do espaçador, que são importantes para o processamento correto do transgene.</li>
		<li>Remova as sequências de hairpin nativas da sequência "Core", com exceção de 3-5 nucleotídeos em ambos os 5 ' e 3 ' extremidades de cada hairpin, que servirá como um aceitador para os grampos de cabelo novo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construindo um novo transgene codificando vários miRNAs de escolha
	<ol>
<li>Obter seqüências de hairpin de miRNAs destinados a ser superexpressos no transgene de miRBase. Anote com cuidado os nucleotídeos específicos que são os locais da clivagem do microprocessador.</li>
		<li>Substitua os grampos de cabelo removidos (passo 2.1.4) com as sequências de hairpin dos miRNAs desejados obtidos na etapa 2.2.1.</li>
		<li>Adicionar seqüências de restrição desejadas em ambas as regiões flanquear do transgene para facilitar a subclonagem em vetores de entrega de escolha. Verifique se as sequências de restrição escolhidas não estão presentes dentro da própria sequência.</li>
		<li>Para controles negativos, use sequências de 20 nucleotídeo mexidos para substituir a seqüência natural de 20 nucleotídeo de cada miRNA maduro. Gere essas sequências embaralhadas usando uma ferramenta online como https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificando a estrutura bidimensional do transgene
	<ol>
<li>Copie a seqüência transgênica completa para o programa de software de predição de estrutura de RNA RNAweb Fold23.</li>
		<li>Usando as configurações padrão do programa, clique em continuar.</li>
		<li>Analise a saída gráfica, particularmente para a presença de grampos de cabelo bem definidos e a presença de estruturas de haste dobro-encalhadas pelo menos 11 nucleotídeos proximal ao local do clivagem do microprocessador. Além disso, procure a ausência de pontos de ramificação dentro das sequências de hairpin (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. obtendo transgenes por síntese de DNA
<ol><li>Após o projeto e na validação do silico do conjunto quimérico de Mirna, obtenha a seqüência de funcionamento usando a síntese do ADN dos vendedores comerciais24 e prossiga com a clonagem a jusante em vetores e na entrega do transgene. Utilizamos vetores lentivirais para entrega in vitro10 e vírus adeno-associados (AAV) para parto intracraniano in vivo25.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li>
<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li>
<li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124%2C+%E2%88%92128%2C+and+%E2%88%92137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li>
<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
<li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li>
<li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li>
<li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li>
<li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).</li>
<li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA.org+resource%3A+targets+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li>
<li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRD%28B%29+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li>
<li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-miRPath+v3.0%3A+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+miRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vienna+RNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly%3A+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).</li>
<li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li>
<li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li>
<li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li>
<li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li>
<li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).</li>
<li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li>
</ol>

Os autores relatam não haver conflitos de interesse.

Este protocolo baseia-se na noção de que, em vez de funcionar isoladamente, os miRNAs são biologicamente relevantes por trabalharem em grupos, e esses grupos são determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar essa abordagem a partir de uma perspectiva translacional, um protocolo de acompanhamento que permite a recriação deste padrão de multi-miRNA em células/tecidos é introduzido. Isto é possível aproveitando-se da biosgênese relativamente simples de miRNA...

miRNAs oferecer uma oportunidade ímpar para o desenvolvimento de uma abordagem de terapia gênica ampla para muitas doenças1,2,3, incluindoo cancro4,5. Isto é baseado em diversas características originais destas moléculas biológicas, incluindo seu tamanho pequeno6, biogênese simples7, e tendência natural funcionar na associação8. Muitas doenças são caracterizadas por padrões específicos de expressão de miRNA, que muitas vezes convergem para a regulação de funções biológicas complexas9. O objetivo deste método é primeiro definir uma estratégia para identificar grupos de miRNAs que são sinergicamente relevantes para funções celulares específicas. Consequentemente, fornece uma estratégia para o restabelecimento de tais combinações de miRNA em estudos e aplicações a jusante.
Este método permite a análise funcional de vários miRNAs de uma só vez, aproveitando a sua segmentação simultânea de um grande número de mRNAs, recapitulando assim as paisagens complexas de doenças. Esta abordagem tem sido recentemente empregada para definir um grupo de três miRNAs que 1) são simultaneamente desregulado no cancro do cérebro e 2) mostram um forte padrão de coexpressão durante a diferenciação neural, bem como em resposta ao stress genotóxico por radiação ou um Agente alquilantes do ADN. A reexpressão combinatória deste módulo de três miRNAs pelo método de agrupamento descrito abaixo resulta em profunda interferência com a biologia das células cancerosas e pode ser facilmente utilizada como estratégia de terapia gênica para estudos pré-clínicos10. Este protocolo pode ser de particular interesse para os envolvidos na pesquisa de miRNA e suas aplicações translacionais.

<table><tbody><tr><td>0,4% de baixa temperatura de fusão agarose&nbsp;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; Unidade de filtro estéril M</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços&nbsp;</td><td>Camundongos Atímicos Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>(FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento&nbsp;</td>Garrafa de cultura de células <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Cesium 137 irradiador&nbsp;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>Core Facility (Harvard Medical School)</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td>Solução</td><td>Gibco 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Solução de formalina Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Suplemento Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco de glioma primário humano (GBM62)</td><td></td><td></td> <td>Fornecido pelo Dr. EA Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Células-tronco primárias de glioma humano (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Fornecido pelo Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Vetor lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>modelo no. 5424 R, cat. no.5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Tubos de Centrífuga de Fundo Redondo de Policarbonato de Alta Velocidade&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Células progenitoras neurais (NPC)</td><td></td><td></td> <td>Fornecido pelo Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Médium Neurobasal&nbsp;</td>Sistema <td>de</td> microscópio fluorescente motorizado <td>Thermo Fisher Scientific</td> 21103049 <td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti</td><td>Nikon, Japão</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina&nbsp;</td>Placas de Petri <td>15140122</td><td></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>94/16&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>EGF Humano Recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-básico&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Retinóico</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Minipreparação RNA</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Termociclador&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Micro Irradiador Guiado por Imagem de Pequenos Animais&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences, UK</td><td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td>Sistema de PCR em Tempo Real <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>StepOne</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>Armário de biossegurança SterilGARD</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Kit de Transcrição Reversa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomida</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek temperatura de corte ótima&nbsp;</td>Reagente <td>de TRIzol NC9636948</td><td></td> <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Reagente de <td>lise</td><td>de 15596026</td> <td>científica Thermo Fisher</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Expressão Lentivector ViraPower&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>Água, grau HPLC</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de mirnas funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

A relevância biológica de microRNAs (miRNAs) na saúde e na doença depende significativamente de combinações específicas de muitos miRNAs desregulados simultaneamente ao invés da ação de um único miRNA. A caracterização desses módulos miRNAs específicos é um passo fundamental para maximizar seu uso na terapia. Isso é extremamente relevante porque seus atributos combinatoriais podem ser praticamente explorados. É descrito aqui um método para definir uma assinatura específica de Mirna relevante ao controle de repressores oncogênico do cromatina no glioblastoma. A aproximação define primeiramente um grupo geral de miRNAs que são desegulated nos tumores em comparação ao tecido normal. A análise é ainda mais refinada por condições de cultura diferencial, ressaltando um subgrupo de miRNAs que são coexpressos simultaneamente durante Estados celulares específicos. Finalmente, os miRNAs que satisfazem estes filtros são combinados em um transgenes polycistronic artificiais, que seja baseado em um andaime de genes naturalmente existentes dos conjuntos de Mirna, usado então para o superexpressão destes módulos de Mirna em pilhas de recepção.

Este método permitiu a caracterização de um módulo de três miRNAs que são consistentemente regulamentados em tumores cerebrais, que são coexpressos especificamente durante a diferenciação neuronal (Figura 1) e envolvidos na resposta de sobrevida tumoral após terapêutica (Figura 2). Isto é conseguido regulando um caminho repressivo oncogênico complexo da cromatina. Esse padrão de coexpressão sugeriu uma forte atividade sinergístic...

É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.

Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Este protocolo permite a modulação simultânea de muitos micro RNAs em células eucarióticas e é baseado em um método muito simples e flexível que minimiza etapas de clonagem molecular. Essa técnica tem implicações para o estudo de interações funcionais micro RNA in vitro, mas o mais importante é fornecer uma plataforma para um uso mais eficaz de micro RNAs na terapia. Desenvolvemos e usamos principalmente no contexto do câncer cerebral, mas se aplica a quaisquer doenças onde múltiplas alterações de expressão genética estejam envolvidas.Testamos nossos genes trans artificiais em outros modelos, como linhas de câncer de mama e tireoide, mostrando a reprodutibilidade dessa técnica. O conhecimento básico da bioinformática e da biologia micro RNA é útil para este protocolo, mas não indispensável. Uma abordagem bioinformática é importante para definir combinações relevantes de micro RNA e o TRK-11, enquanto a familiaridade com o processamento de micro RNA é importante para entender como esses diferentes micro RNAs podem ser montados em clusters de DNA artificiais que podem ser processados com sucesso uma vez estáveis para as células específicas.Para revestir o prato, primeiro dissolva a poli-D-lysina na água a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Despeje a solução no prato na quantidade de um mililitro de solução por 25 centímetros quadrados de superfície. Gire o prato para ter certeza da cobertura de todo o prato.Após seis horas aspirar a solução de poli-D-lysine e enxaguar duas vezes com PBS. Placa células-tronco neurais humanas na quantidade de 100.000 células por cinco mililitros do meio, seja no meio celular-tronco, meio de diferenciação astróctica ou meio de diferenciação neuronal. Após o revestimento celular, coloque o prato em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma semana e prossiga para realizar a análise de expressão de micro RNA de acordo com o manuscrito.Para cultivar células-tronco gbm-34 glioblastoma, comece com uma vezes dez para a quinta células e cinco mililitros de meio neurobásal em um frasco de 25 centímetros quadrados de baixa fixação. Coloque o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 48 horas após o revestimento, adicione concentrações duplicadas de temozolomida agente de dna a cada sete dias.Comece com a adição de cinco micromolar TMZ suplementados em cinco mililitros médios por cinco dias. Após cinco dias, remova o meio e substitua por meio fresco sem temozolomida para permitir que as células sobreviventes se recuperem. Após 48 horas, adicione 10 temozolomida micromolar e incubar por mais cinco dias.Repita o tratamento de temozolomida duplicada até que a concentração de pelo menos 100 micromolars seja alcançada e as células se tornem resistentes à droga. Após a indução da resistência, ficam as células usando 1 mililitro do reagente lysis. Extrair RNA total e analisar a expressão dos micro RNAs específicos de acordo com o manuscrito.Para obter o targetome previsto de cada micro RNA previamente definido, use ferramentas de previsão de segmentação micro RNA. Na primeira página do TargetScan, selecione o micro RNA de interesse do menu suspenso pré-preenchido. Clique no botão enviar.Baixe a lista de destinos resultantes como uma planilha usando o link da tabela de download. Para diminuir as chances de falsas previsões positivas, incluem apenas alvos dentro da coluna de sites conservados e análise a jusante. Programas adicionais de previsão de micro RNA obtém mais stringency e incluem apenas alvos que são comuns a todos os algoritmos.Em seguida, abra a suíte ToppGene 20. Para avaliar o enriquecimento de caminhos comuns a cada micro RNA, cole a lista de metas obtidas na janela de conjuntos genéticos de treinamento. Clique no Símbolo HGNC como o tipo de entrada.Clique em enviar e iniciar. O programa fornece uma tabela de saída mostrando as categorias go mais significativas para a lista de genes inscritos. Para finalmente estabelecer a contribuição de cada micro RNA para a regulação de um caminho comum ou processo celular, abra a função venn-diagrama fornecida no site bioinformática e genômica evolutiva.Verifique cada targetome obtido contra a lista completa de genes envolvidos no processo celular específico. Se o mensageiro-alvo RNAs para cada micro RNAs de interesse estiverem nas respectivas janelas, faça upload da cópia-cola da lista. Nomeie cada lista com um identificador único.Clique em enviar. O programa fornece uma saída visual de um diagrama de venn com números de genes em cada setor, bem como uma lista completa de RNAs mensageiros para cada subconjunto e combinações de intersecção. Para agrupar os micro RNAs selecionados em um gene trans funcional, obtenha um andaime transgênico baseado no lócus de cluster miR-17-92.Obtenha a sequência de nucleotídeos do navegador genoma conjunto. Selecione a sequência de núcleo de par de aproximadamente 800 bases abrangendo todos os seis grampos micro RNA codificados do lócus e pelo menos 200 sequências de flanco nucleotídeos tanto rio acima quanto a jusante da sequência do núcleo. Cole a sequência em qualquer programa de edição de palavras.Defina a sequência de cada um dos seis pinos de cabelo nativos recuperando-os na base miR. Marque cada uma dessas sequências dentro do período da sequência do núcleo previamente identificada. Quaisquer sequências entre cada grampo de cabelo representam sequências espaçadoras.Em seguida, obtenha as sequências de pinos de cabelo de micro RNAs destinadas a ser mais expressas no gene trans da base miR. Observe cuidadosamente os nucleotídeos específicos que estão nos locais do decote do micro processador. Exclua as sequências nativas da sequência do núcleo, com exceção de três a cinco nucleotídeos nas extremidades cinco e em cada grampo de cabelo que servirão como um aceitador para os novos grampos.Cole as sequências de grampos dos micro RNAs desejados para substituir os grampos de cabelo previamente excluídos. Adicione sequências de restrição desejadas em ambas as regiões de flanqueamento do gene trans para facilitar a sub clonagem em vetores de entrega de escolha. Verifique se as sequências de restrição escolhidas não estão presentes dentro da sequência em si.Para verificar a estrutura bidimensional do gene trans, copie toda a sequência transgênica no programa de previsão de estrutura RNA RNA Webfold. Selecione as configurações padrão do programa e clique em prosseguir. Analise a saída gráfica, particularmente para a presença de grampos bem definidos na presença de estruturas de haste duplas encalhadas que são pelo menos 11 nucleotídeos proximais para o local do decote do micro processador.Além disso, procure a ausência de pontos de ramificação dentro das sequências de grampos. Neste ponto, o gene trans está pronto para ser produzido pela síntese genética e clonado nos vetores de entrega desejados. Este método permitiu a caracterização de um módulo de três micro RNAs que são consistentemente para baixo regulados em tumores cerebrais, que são co-expressos especificamente durante a diferenciação neuronal.Padrões de co-expressão de módulos micro RNA durante o estresse genoxico foram confirmados e sugeriram uma forte atividade sinérgica entre esses três micro RNAs. O gene trans projetado poderia simultaneamente recapitular a expressão dos três micro RNAs em células de glioblastoma, tanto in vitro quanto in vivo, com interferência significativa na biologia tumoral e aplicabilidade translacional promissora. Além disso, o cluster transgênico também foi funcional em um modelo de câncer de mama.Os requisitos cruciais deste protocolo são manter o tamanho original do decote do processador no gene trans. E certifique-se de que a estrutura do laço de haste dos grampos quiméricos micro RNA seja preservada. Com este método, podemos concentrar múltiplos genes micro RNA biologicamente ativos em sequências de DNA muito curtas que podem literalmente ser encaixadas em qualquer vetor de entrega para uso de terapia genética.Este método é ideal para estudar a interação funcional entre diferentes micro RNAs e interferir em complexas vias celulares multifatoriais que de outra forma exigirão múltiplas combinações de medicamentos.

characterization-functionally-associated-mirnas-glioblastoma-their

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aqui descrevemos um protocolo eficiente e versátil para induzir, monitorar e analisar novos glioblastomas (GBM) usando DNA de transposon injetado nos ventrículos de camundongos neonatais. As células da zona subventricular, que absorvem o plasmídeo, transformam-se, proliferam e geram tumores com características histopatológicas do GBM humano.

Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

MicroRNAs desempenham papéis cruciais no cérebro e são alvos potenciais para modelar a neurodegeneração. No entanto, perturbar os níveis de miRNA é um desafio devido ao curto comprimento do miRNA e à inacessibilidade do tecido cerebral. Este vídeo apresenta um método para o design do antagomir e entrega específica do cérebro usando um neuropeptídeo em camundongos.

Uma alternativa simples para injeção estereotáxica para Brain Knockdown específico de miRNA

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.

Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias para o glioblastoma, uma doença para a qual não há cura. Aqui, relatamos uma nano plataforma terapêutica de óxido de ferro guiada por imagem in vivo que pode contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular no tumor.

Entrega de nanopartículas de uma carga útil de oligonucleotídeo em um modelo animal de glioblastoma multiforme

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a modular múltiplos microRNAs simultaneamente em células eucarióticas usando clusters artificiais de DNA. Este método flexível minimiza etapas de clonagem molecular e oferece aplicações promissoras em terapia gênica para glioblastoma e outros cânceres.

Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica

Explorar mais vídeos