Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.

Este método permite uma análise transcriômica de uma população celular rara da glândula acessório masculina de Drosophila, chamada de células secundárias, e descobre genes que as tornam críticas para o sucesso reprodutivo. No decorrer de um dia, essa técnica permite a classificação de células secundárias de diferentes genótipos e a extração do RNA total para sequenciamento qPCR ou RNA subsequente. Às vezes, os projetos são limitados pela raridade do material inicial.

Este método pode fornecer a base para outros grupos que enfrentam o desafio de trabalhar com uma população celular rara. Como o procedimento precisa acumular 40 glândulas, é importante praticar as dissecções. Preparar as dicas caseiras de pipeta também é importante, e por isso você deve visualizá-la no vídeo como fazê-lo e se preparar com antecedência.

Antes de iniciar o procedimento, corte e rodada de chama, largas, 200 dicas de microliter para manusear as glândulas, e passe a abertura da ponta de múltiplas pontas de 1.000 microliter perto de uma chama por menos de um segundo para estreitar as aberturas. Em seguida, classifique as pontas modificadas de mais estreitas para mais largas com base em sua velocidade de aspiração. Para dissecção da glândula de acesso, coloque 20 a 25 drosophila macho em um prato de vidro no gelo, e use fórceps e um microscópio de dissecção para remover o trato reprodutivo de uma mosca macho.

Limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos, incluindo os testículos e a lâmpada ejaculatória, e transfira as glândulas acessórias para uma placa de vidro contendo meio suplementado de soro à temperatura ambiente. Quando 20 pares de glândulas acessórias tiverem sido coletados, lave as glândulas em um prato de PBS por um a dois minutos em temperatura ambiente. No final da lavagem, transfira as glândulas para uma solução de dissociação recém-preparada, e use fórceps afiados sob um microscópio dissecando para beliscar firmemente o meio de um lobo glandular.

Usando um segundo par de fórceps, corte o tecido com a ponta afiada para separar a região proximal da glândula acessório e o ducto ejaculatório da porção da glândula que contém células secundárias. Corte as glândulas para que as peptidases possam alcançar as células que são protegidas de outra forma pela camada muscular externa e pelo fluido seminal viscoso no lúmen da glândula. Em seguida, use uma dica de pipeta pré-molhada, arredondada por chamas, larga e de 200 microliter para transferir as glândulas para um tubo de 1,5 mililitro.

Para digestão tecidual, coloque o tubo em um shaker Celsius de 37 graus por 60 minutos a 1.000 rotações por minuto. No final da incubação, pare a digestão com um mililitro de meio suplementado por soro, e use uma dica de pipeta pré-molhada, arredondada por chamas, larga, 1.000 microliter para transferir as amostras para uma placa de 24 poços. Verifique as células quanto à expressão GFP sob um microscópio fluorescente.

A maioria das pontas da glândula deve parecer intacta, e algumas células secundárias devem ser separadas. Use uma ponta de pipeta arredondada, estreita, de 1.000 microliter para triturar suavemente as células três a cinco vezes para interromper o tecido da glândula acessório. Em seguida, use uma dica de pipeta muito estreita, arredondada, de 1.000 microliter uma a duas vezes para individualizar as células.

Deixe as células se acomodarem por 15 minutos. Confirme se as células parecem saudáveis sob o microscópio e remova o excesso de meio. Em seguida, transfira as células para um novo tubo de 1,5 mililitro e enxágue os poços com meio fresco para recuperar quaisquer células restantes.

A construção Abd-B-GAL4 pode ser usada nestes experimentos para rotular células secundárias, mas não principais com GFP. Neste estudo, ambos os tipos de células foram classificados a partir de glândulas acessórios mutantes iab-6cocuD1. Este mutante D1 não tem a expressão de transcrições Abd-B e MSA, que afetam o desenvolvimento de células secundárias, morfologia e função.

Após a dissociação celular, o FACS é usado para selecionar células vivas com base no DRAQ7, e o nível de fluorescência GFP é usado para isolar células secundárias e células principais. O RNA é extraído de cada população celular e ajustado a dois nanogramas por amostra para rt-qPCR subsequente e sequenciamento. A quantificação da expressão de genes específicos por PCR quantitativo em tempo real em extratos de células principais e secundárias do tipo selvagem revela que os genes de células secundárias Rab19 e MSA são detectados apenas a partir de extratos de células secundárias, enquanto o peptídeo sexual genético principal da célula é detectado apenas a partir de amostras de células principais.

A principal análise de componentes em dados de sequenciamento de RNA de três tipos selvagens e três réplicas mutantes revela que o tipo selvagem replica ambos os aglomerados próximos um do outro e longe das amostras mutantes. Visualizar leituras alinhadas a genes específicos mostra que genes domésticos como actin 5C, e os genes específicos de células secundárias Rab19 e Dve são expressos em ambos os genótipos. Para a MSA, no entanto, a forte expressão do gene observado em moscas do tipo selvagem é perdida nas cepas mutantes.

Obter células secundárias dissociadas suficientes é importante para um procedimento bem sucedido. Assim, verifique o protocolo de dissecção e dissociação em experimentos de pequena escala. Este método permite a classificação de ambos os tipos celulares de glândulas acessórias a partir de um pequeno número de moscas, permitindo o estudo de como essas células reagem transcricionalmente a múltiplas condições genéticas ou ambientais.

O sucesso reprodutivo masculino é conhecido por ser afetado por muitas coisas, incluindo genótipo, idade e status de acasalamento. A facilidade deste método deve nos permitir investigar como esses fatores afetam a transcrição da glândula acessório.