Name: Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a isolar células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila usando FACS para análise transcriptômica. Este método permite extrair RNA de populações celulares raras para estudos de biologia reprodutiva.

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Nós somos gratos aos membros do laboratório de Karch, ao plateform da genômica de iGE3, à facilidade do núcleo da citometria do fluxo da Universidade de Genebra, e ao Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye que ajustou o protocolo para FACS. Agradecemos Luca Stickley por sua ajuda com a visualização das leituras sobre IGV. Agradecemos-nos por uma gentil permissão para reutilizar figuras, e os editores para nos pedir para ser criativo com a escrita.
Esta pesquisa foi financiada pelo estado de Genebra (CI, RKM, FK), o fundo nacional suíço de pesquisa (www.snf.ch) (FK e RKM) e doações da Fundação Claraz (FK).

linhas 1. Drosophila usadas e coleção dos machos
<ol><li>Para este protocolo, use machos expressando GFP no SCs e não nas células principais. Aqui, um excitador de abdb-GAL4 (descrito na referência18), recombined com UAS-GFP (no cromossoma 2) é usado. Outros drivers apropriados também podem ser usados. Para a isolação de SCs circunstâncias diferentes do mutante, cruze a mutação nas linhas que contêm a linha SC-específica de GFP.</li>
	<li>Colete dois lotes de cerca de 25 homens saudáveis e virgens para cada genótipo e envelhecê-los a 25 ° c por 3-4 dias em frascos com comida de Drosophila recém-feita. Nota: Como a idade, o status de acoplamento, a nutrição e o ambiente social afetam cada biologia reprodutiva, os protocolos estritos devem ser seguidos para controlar para estes parâmetros. Os machos virgens são envelhecidos por 3-4 dias após a eclosão do pupal em 25 ° c com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, no alimento padrão da farinha de milho-Agar-fermento, nos grupos de 20-25 machos por o frasco.</li>
</ol>2. soluções e preparação de material
<ol><li>
Prepare as seguintes soluções.
	<ol>
<li>Prepare o meio suplementado do soro (SSM): o meio da Drosophila de Schneider complementou com o soro fetal bovino inativado do calor de 10% e a penicilina-estreptomicina de 1%.</li>
		<li>Prepare alíquotas de enzima de tripsina 1x (por exemplo, enzima TrypLE Express) e armazene à temperatura ambiente.</li>
		<li>Prepare alíquotas de papaína [50 U/mL] (armazenadas a-20 ° c e descongelados apenas uma vez).</li>
		<li>Prepare 1 tampão fosfato salina (PBS, armazenado à temperatura ambiente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare várias pontas de Pipet arredondadas à chama para a dissociação física das glândulas acessórias. Nota: use pontas baixas da retenção para segurar as glândulas acessórias como tendem a aderir ao plástico não tratado. O processo de arredondamento de chamas reduz a abertura da ponta e suaviza as bordas da ponta. Isto assegura uma dissociação eficiente após a digestão do peptidase sem cortar as membranas de pilha.<ol>
<li>Cortar 1 200 μL de ponta com uma lâmina afiada e passá-lo suavemente sobre uma chama para arredondar a sua ponta de modo a que a abertura seja mais larga mas suave para o manuseamento durante o passo 3,7.</li>
		<li>Estreite a abertura de várias pontas de 1.000 μL, passando a abertura da ponta perto de uma chama por menos de um segundo. Gire a ponta ligeiramente para evitar excesso de derretimento ou entupimento. Classifique as dicas feitas de mais estreito para mais largo. Isto pode ser feito cronometrando a velocidade da aspiração. Tente dissociar uma amostra pequena escala de AGs para testar a eficiência das pontas mais estreitas. Nota: Estas pontas são críticas para a agitação mecânica (etapas 5,2 e 5,3). As pontas Flame-arredondadas da qualidade do Pipet permitem a dissociação completa ao preservar a viabilidade da pilha. Como tal, estas pontas são lavadas completamente com água no fim do procedimento para a reutilização. Isto permite a dissociação reprodutível do dia a dia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dissecção de glândulas acessórias
<ol><li>Põr 20 a 25 Drosophila masculino em um prato de vidro no gelo.</li>
	<li>Dissecar 1 macho em SSM. Retire o seu trato reprodutivo e limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos para além do Ducto ejaculatório. Nota: Remover testículos porque o esperma liberado pode criar aglomerantes e perturbar o processo de dissociação. Retire o bulbo ejaculatório, o que torna a manipulação difícil quando flutua.</li>
	<li>Com fórceps, transfira as glândulas acessórias a uma placa de vidro enchida com o SSM na temperatura ambiente. Repita os passos 3.2-3.3 20 vezes para obter um lote de 20 pares de glândulas no SSM. Nota: Estes passos serão alcançados em 15 a 20 min. AGs deve parecer saudável, e os movimentos peristálticos da camada muscular em torno das glândulas devem ser visíveis. GFP pode ser monitorado usando um microscópio fluorescente.</li>
	<li>Transfira as glândulas acessórias para 1X PBS para uma lavagem de 1-2 min à temperatura ambiente. Nota: Para uma melhor dissociação, é imperativo enxaguar as glândulas com PBS. A duração desta etapa, no entanto, deve ser limitada à medida que as células mostram sinais de stress em PBS; células secundárias dissociadas em PBS rapidamente incham e morrem.</li>
	<li>Diluir 20 μL de papaína [50 U/mL] em 180 μL de enzima de tripsina 1x para obter a solução de dissociação (para aumentar ou diminuir a escala, manter 9 μL de enzima tripsina e 1 μL de papaína para cada macho). Com fórceps, transfira as glândulas acessórias a esta solução.</li>
	<li>Isolar a ponta das glândulas acessórias (contendo células secundárias) da parte proximal. Use fórceps fino para beliscar firmemente o meio de um lobo glandular e corte com a ponta afiada de um segundo fórceps. Retire a parte proximal das glândulas acessórias e o Ducto ejaculatório para melhorar a dissociação e reduzir o tempo de triagem celular. Nota: Dissecando a parte distal de 20 pares de glândulas levará 15 a 20 min e digestão por peptidases, assim, começará à temperatura ambiente.</li>
	<li>Depois que todas as pontas da glândula foram dissecadas, transfira-as em um tubo de 1,5 mL usando uma ponta especial do Pipet de 200 μL preparada na etapa 2.2.1. Deve ser largo, arredondado e molhado antes de segurar as glândulas. Nota: Para o tecido da glândula acessório Pipet, as pontas devem sempre ser pre-molhadas com solução apropriada (enzima do trypsin ou SSM, mantem um tubo de cada para esta finalidade). Lave cuidadosamente as pontas entre as amostras para evitar contaminação.</li>
</ol>4. digestão do tecido
<ol><li>Coloque o microtubo em um agitador de 37 ° c por 60 min, balançando a 1.000 rpm. Nota: A agitação e o tempo da digestão são críticos para a dissociação bem sucedida. A digestão mais curta ou imóvel dará a dissociação pobre, provavelmente porque a camada do músculo exterior e o líquido seminal viscoso interno protegem pilhas da glândula acessória dos peptidases.</li>
	<li>Adicione 1 mL de SSM à temperatura ambiente para parar a digestão e prossiga imediatamente para o passo 5.</li>
</ol>5. dissociação mecânica das células
<ol><li>Usando uma ponta arredondada de 1.000 μL, pre-molhado com SSM, transfira a amostra a uma placa de 24 poços. Monitore a fluorescência de GFP o microscópio: a maioria de pontas da glândula devem olhar intact e alguns SC devem ser destacados.</li>
	<li>Usando uma ponta de Pipet estreita arredondada gerada na etapa 2.2.2, Pipet para cima e para baixo 3 a 5 vezes para interromper o tecido da glândula acessória. Nota: Monitore a fluorescência para certificar-se de que os remendos grandes do tecido estiveram quebrados acima. Repita o passo 5,2 se este não for o caso.</li>
	<li>Usando uma ponta de Pipet arredondada muito estreita (gerada na etapa 2.2.2), Pipet acima e para baixo 1-2 vezes. Nota: Somente células individuais devem ser visíveis após a etapa 5,3. A utilização de placas de 24 poços é recomendada porque permitem uma monitorização fácil do processo. Quando algumas amostras foram processadas e deram resultado satisfatório (células secundárias de aparência saudável perfeitamente dissociadas), as etapas de pipetagem serão realizadas no microtubo.</li>
	<li>Aguarde pelo menos 15 min para deixar as células se instalarem na parte inferior do poço e remover o excesso de SSM para reduzir o tempo de classificação. Nota: Deixar as pilhas resolver provou superior aos métodos alternativos como a centrifugação, e permite uma última inspeção visual das pilhas apenas antes de FACS.</li>
	<li>Pipet as células em um tubo limpo 1,5 mL e piscina amostras idênticas (dois lotes de 20 machos para cada condição). Enxague poços com SSM para recuperar as últimas células, e Pipet-los no tubo (use um pequeno volume).</li>
	<li>Em 1,5 mL de microtubos, adicione 300 μL de solução de lise celular e 1 μL de proteinase K [50 μg/μL] (soluções fornecidas no kit de purificação de RNA, consulte a etapa 7). Prepare dois tubos para cada amostra (uma para MCs e uma para SCs).</li>
</ol>6. FACS (fluorescência-ativado célula de triagem)
<ol><li>Adicionar marcador de viabilidade para cada amostra a ser classificado alguns minutos antes da triagem (0,3 mM Draq7). Atenção: Draq7 deve ser manuseado com precaução.</li>
	<li>
Classifique uma população homogênea de células secundárias ao vivo (células GFP-positivas, Draq7-negativas). Em outro microtubo, classifique uma população de células principais (menor, GFP negativo, células Draq7 negativas). Use a seguinte estratégia de gating FACS: Nota: ajuste a pressão de classificador de células a 25 psi e passe as células através de um bocal de 100 μm. A taxa de classificação é de cerca de 2.000 células/s.<ol>
<li>Exclua detritos e selecione células totais com base no FSC-SSC (Figura 2e) para excluir detritos.</li>
		<li>Exclua as células mortas. Excite Draq7 com um laser de 640 nanômetro e colete a fluorescência emitida com um filtro da faixa-passagem 795/70. Porta Draq7 células positivas (Figura 2F).</li>
		<li>Remova os doublets usando uma dupla gating em SSC-H vs SSC-W e FSC-A vs FSC-H (Figura 2h). Nota: Exclua duplicações de células de forma estrita usando dupla gating, para reduzir a contaminação da célula principal.</li>
		<li>Sort ~ 550 células GFP-positivas em um microtubo de 1,5 mL com tampão de Lise e proteinase K. Esta população é considerada células secundárias (SC, Figura 2G). Excite GFP em 488 nm e colete a fluorescência emitida com um filtro da faixa-passagem 526/52.</li>
		<li>Sort ~ 1.000 células GFP-negativas, homogêneas e pequenas em tamanho, em um microtubo de 1,5 mL com tampão de Lise e proteinase K. Esta população é considerada células principais (MC, Figura 2G).</li>
		<li>Vortex todas as amostras. Nota: De 40 machos (~ 40 x 80 SC = 3.200 células secundárias), 600 a 800 células secundárias de singlet ao vivo são obtidas (cerca de 20-25% de recuperação). Pare de classificar em torno de 550 SC e 1.000 MC para normalizar amostras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. extração de RNA
Nota: Utilizamos o kit de purificação de RNA MasterPure da Epicentre para extração de RNA, com as seguintes adaptações. Outros kits podem ser usados enquanto o rendimento for alto o suficiente para preparar uma biblioteca para sequenciamento de ~ 500 células (2 ng RNAs foi usado aqui).
<ol><li>Amostras de calor a 65 ° c por 15 min e Vortex a cada 5 min para completar a lise celular.</li>
	<li>Coloque as amostras no gelo por 5 min. siga as recomendações do fabricante para precipitações de ácidos nucleicos (partes "precipitação de ácidos nucleicos totais" e "remoção de DNA contaminante de preparações de ácidos nucleicos totais").</li>
	<li>Suspenda a pelota do RNA em 10 μL de tampão RNase-livre do TE.</li>
	<li>Adicionar inibidor de RNase (opcional).</li>
	<li>Armazene amostras em-80 ° c.</li>
</ol>8. controles da qualidade da quantidade, da qualidade e da especificidade do RNA
<ol><li>Estimar a qualidade e a concentração do RNA. Devido ao pequeno volume e concentração, use RNA 6000 chips pico aqui. O RNA da boa qualidade é definido como não-degradado, visível como uma baixa linha de base com picos afiados que correspondem a rRNAs.</li>
	<li>
RT-qPCR para controlar a identidade de células classificadas
	<ol>
<li>Realize a transcrição reversa com 2 ng de RNAs totais usando multi-hexâmeros aleatórios como primers. Execute RT no RNA secundário da pilha e no RNA principal da pilha. Nota: cDNAs podem ser diluídas, aliquotadas e mantidas congeladas para uso posterior.</li>
		<li>Realize o PCR quantitativo em tempo real usando pares apropriados da primeira demão para quantificar genes da limpeza (alfa-tubulin, 18S rRNA), genes específicos da pilha secundária (MSA, Rab19, Abd-B) e gene específico da pilha principal (peptide do sexo).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. sequenciamento (preparação da biblioteca do cDNA, sequenciamento e análise de dados)
<ol><li>Use 2 ng de RNAs totais para sintetizar cDNAs com primers polydT. Use a tecnologia SMARTer para amplificá-los para amplificação.</li>
	<li>Use um kit NextEra XT para preparar a biblioteca.</li>
	<li>Seqüência usando multiplexado, 100 nucleotídeos single lê seqüenciamento (embora 50 nucleotídeos leituras são apropriadas para a maioria dos fins) para produzir cerca de 30 milhões leituras para cada amostra.</li>
</ol>10. análise de dados
<ol><li>Execute FastQC.</li>
	<li>Use o alinhador Star para mapear as leituras no genoma de referência da Drosophila dm6 UCSC e gerar arquivos. bam. Use o Visualizador de genômica Integrativa (IGV) para visualizar leituras no navegador do genoma.</li>
	<li>Use HTSeq para executar contagens de genes.</li>
	<li>Use o método de média aparada de valores M (TMM) para normalizar as contagens de genes22. Use edgeR para realizar análises estatísticas de expressão diferencial, parcelas MA e PCA.</li>
	<li>Para análise e estatística da expressão gênica, use o modelo linear geral, o teste F de quase-verossimilhança com taxa de detecção falsa (FDR) e benjamini & correção de Hochberg (BH).</li>
</ol>

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<li>Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgação.

Os métodos para a dissociação da pilha do tecido da Drosophila como discos imaginal são descritos já23. Nossas tentativas de simplesmente usar esses procedimentos em glândulas acessórias falharam, incentivando-nos a desenvolver este novo protocolo. A digestão da protease e a trituração mecânica foram passos críticos para o sucesso do procedimento e, assim, colocamos muitas anotações nas seções 2 a 5 para ajudar os experimentadores a obter resultados satisfatórios. Para que a dissociação s...

Os órgãos são compo de tipos múltiplos da pilha, cada um com funções discretas e expressando às vezes vastamente jogos diferentes dos genes. Para obter uma compreensão precisa de como um órgão funciona, muitas vezes é crítico para estudar cada tipo de célula distinta que compõe este órgão. Um dos principais métodos utilizados para explorar a possível função é a análise do transcriptoma. Este método poderoso fornece um instantâneo da expressão de gene em uma pilha, para revelar processos e caminhos ativos. Entretanto, este tipo de análise é frequentemente difícil para as populações raras da pilha que devem ser purificadas das pilhas vizinhas distante mais-abundantes. Por exemplo, a glândula acessória masculina de Drosophila é um órgão compo primeiramente de dois tipos secretora da pilha. Como o mais raro dos dois tipos da pilha compreende somente 4% das pilhas desta glândula, o uso de uma análise específica do transcriptoma do Cell-Type não tinha sido usado para ajudar a determinar a função destas pilhas.
As glândulas acessórias (AGs) são órgãos do trato reprodutivo masculino em insetos. Eles são responsáveis pela produção da maioria das proteínas do fluido seminal (proteínas do fluido seminal (SFPs) e proteínas de glândula acessória (ACPs)). Alguns desses SFPs são conhecidos por induzir as respostas fisiológicas e comportamentais em fêmeas acasaladas, comumente chamadas de resposta pós-acoplamento (PMR). Alguns dos PMRs incluem: uma taxa aumentada da ovulação e do ovo-colocação, o armazenamento e a liberação do esperma, uma mudança na dieta fêmea, e uma diminuição na receptividade fêmea aos machos cortejando secundários1,2. Como os insetos impactam muitas questões societais importantes da saúde humana (como vetores de doenças mortais) para a agricultura (insetos podem ser pragas, ainda são críticas para a polinização e qualidade do solo), a compreensão da reprodução de insetos é uma importante área de pesquisa. O estudo de AGs e de ACPs foi avançado significativamente com o modelo do organismo Drosophila melanogaster. Estes estudos têm destacado o papel da AGS e algumas das proteínas individuais que produzem na criação do PMR, impactando o trabalho em outras espécies como ovetor dedoença Aedes aegypti3,4, eoutros insetos1 ,5. Além disso, como AGS secretam os constituintes do fluido seminal1,6eles são muitas vezes pensado como o análogo funcional da glândula prostática de mamíferos e vesicle seminal. Esta semelhança da função combinada com as similaridades moleculars entre os dois tecido-tipos, fêz ao AGs um modelo para a glândula de próstata nas moscas7.
Dentro do macho de Drosophila , há dois lóbulos de glândulas acessórias. Cada lobo pode ser visto como uma estrutura de saco-like compo de um monocamada de pilhas secretora que cercam um lúmen central, e envolvido por músculos lisos. Como mencionado acima, há dois tipos de células secretoras morfologicamente, desenvolvimentais e funcionalmente distintas que compõem esta glândula: as células principais em forma de poligonal (tornando-se ~ 96% das células), e as células secundárias maiores, redondas (SC) (tornando-se o restantes 4% das células, ou cerca de 40 células por lobo). Tem sido demonstrado que ambos os tipos de células produzem conjuntos distintos de ACPs para induzir e manter o PMR. A maioria dos dados obtidos até o momento destacam o papel de uma única proteína no desencadeamento da maioria dos comportamentos característicos da PMR. Esta proteína, o peptídeo sexual, é um pequeno, 36 aminoácido peptídeo que é secretado pelas células principais8,9,10. Embora o peptídeo sexual pareça desempenhar um papel importante na PMR, outros ACPs, produzidos por ambas as células principal e secundária, também têm demonstrado afetar vários aspectos da PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Por exemplo, com base em nosso conhecimento atual, as SCs, por meio das proteínas que produzem, parecem ser necessárias para a perpetuação da sinalização de SP após o primeiro dia18.
Dada a raridade das SCs (apenas 80 células por macho), todo o nosso conhecimento sobre estas células e as proteínas que produzem provém de abordagens genéticas e candidatas. Até agora, somente uma lista relativamente pequena de genes foi mostrada para ser SC-specific. Esta lista inclui o proventrículo defeituoso da proteína de homeodomínio (DVE)19, o lncrna MSA20, Rab6, 7, 11 e 1921, CG1656 e CG1757511, 15,21 e o fator de transcrição homeobox abdominal-b (Abd-b)18. Previamente, nós mostramos que um mutante deficiente para a expressão de Abd-B e o Lncrna MSA em pilhas secundárias (mutante deIAB-6cocuD1 ) encurta o comprimento do PMR de ~ 10 dias a somente um dia12 , 18 anos de , 20. este phenotype parece ser causado pelo armazenamento impróprio de SP no intervalo reprodutivo fêmea12,18,20. No nível celular, as células secundárias deste mutante mostram morfologia anormal, perdendo suas estruturas características vacuol-like18,20,21. Usando esta linha mutante, nós tentamos previamente identificar os genes envolvidos na função do SC comparando os perfis transcricional de AGS inteiros do tipo selvagem ou das glândulas acessórias do mutante12. Além disso, outros laboratórios mostraram que o número de SC, a morfologia e o conteúdo vacuolar dependem da dieta masculina, do estado de acasalamento e da idade21,25,26.
Embora o progresso positivo fosse feito usando estas aproximações, um transcriptoma completo do SC era longe de ser conseguido. A raridade destas pilhas neste órgão fêz difícil progredir mais mais mesmo das pilhas selvagens do tipo. Para testar a expressão gênica, as alterações nessas células após estímulos ambientais específicos seriam ainda mais difíceis. Assim, foi necessário um método para isolar e purificar o RNA SC que foi rápido e simples o suficiente para atuar diferentes origens genéticas e condições ambientais.
Ambos os genes de Abd-B e de MSA exigem um potenciador específico de 1,1 KB do complexo do bithorax de Drosophila (chamado o potenciador D1 ) para sua expressão em SCs18,20. Esse potenciador tem sido usado anteriormente para criar um driver GAL4 que, quando associado a um UAS-GFP, é capaz de direcionar a expressão GFP forte especificamente no SCs. Assim, utilizamos esta linha como base para um protocolo FACS para isolar essas células tanto do tipo selvagem como do IAB-6cocuD1 AGS). Como IAB-6cocuD1 Mutant SCs exibem uma morfologia celular diferente, nós mostramos que este protocolo pode ser usado para isolar as células para a determinação de seu transcriptoma a partir deste tipo de células raras condições vastamente diferentes.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio binocular para dissecção</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binocular com fonte de luz para GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Draq7 0,3 mM</td><td>BioStatus</td><td>DR71000</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos de plástico 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td></td></tr><tr>Pinça <td></td><td></td><td></td>de<td>dissecção fina</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>calor inativado antes do uso</td></tr><tr><td>Pratos de vidro para dissecação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balde de</td><td></td><td></td><td></td>gelo</tr><tr><td>ImProm-II Sistema de Transcrição Reversa</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação de RNA MasterPure</td><td>Epicentre</td><td>MCR85102</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nextera XT</td><td>illumina</td><td></td><td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td></td><td></td><td>50U / mL estoque</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>caseiro</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Primers PolydT Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hexâmeros aleatórios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico kit</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila médio</td><td>Kit de</td> síntese de cDNA Gibco <td>21720-001</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer</td><td>Takara</td><td></td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td></tr><tr><td>SYBR select Master mix para CFX</td><td>aplicado biosystems</td><td>4472942</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Hangzhou Allsheng intruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 1250 &mu; Ponta graduada L</td><td>Starlab</td><td>S1161-1820</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 200 &mu; Ponta chanfrada em L</td><td>Starlab</td><td>S1161-1800</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo baseado em facs para isolar o rna das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de drosophila

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Para entender a função de um órgão, muitas vezes é útil entender o papel de suas populações de células constituintes. Infelizmente, a raridade de populações de células individuais muitas vezes torna difícil obter material suficiente para estudos moleculares. Por exemplo, a glândula acessória do sistema reprodutivo masculino de Drosophila contém dois tipos distintos de células secretoras. As células principais compõem 96% das células secretoras da glândula, enquanto as células secundárias (SC) compõem o restante 4% das células (cerca de 80 células por macho). Embora ambos os tipos da pilha produzam componentes importantes do líquido seminal, somente alguns genes são sabidos para ser específicos aos SCs. A raridade do SCs tem, até agora, dificultado o estudo da análise transcriptômica deste importante tipo de célula. Aqui, um método é apresentado que permite a purificação de SCs para extração de RNA e seqüenciamento. O protocolo consiste em primeiras glândulas dissecantes de moscas expressando um repórter GFP específico do SC e, em seguida, sujeitando essas glândulas à digestão da protease e dissociação mecânica para obter células individuais. Seguindo estas etapas, as pilhas individuais, vivas, GFP-marcadas são classificadas usando um classificador de célula ativado fluorescente (FACS) para a purificação do RNA. Este procedimento rende RNAs SC-específicos de ~ 40 machos por a condição para a jusante RT-qPCR e/ou o sequenciamento do RNA no curso de um dia. A rapidez e simplicidade do procedimento permite o transcriptoma de muitas moscas diferentes, de diferentes genótipos ou condições ambientais, a ser determinado em um curto período de tempo.

O protocolo aqui apresentado permite que um experimentador Isole as células secundárias das glândulas acessórias masculinas da Drosophila e EXTRAIA seu RNA no decorrer de um único dia (Figura 1).
Utilizamos a construção de Abd-B-GAL4 18 para rotular células secundárias (SC), mas não as células principais (MC) com GFP (Figura 2<s...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Este método permite uma análise transcriômica de uma população celular rara da glândula acessório masculina de Drosophila, chamada de células secundárias, e descobre genes que as tornam críticas para o sucesso reprodutivo. No decorrer de um dia, essa técnica permite a classificação de células secundárias de diferentes genótipos e a extração do RNA total para sequenciamento qPCR ou RNA subsequente. Às vezes, os projetos são limitados pela raridade do material inicial.Este método pode fornecer a base para outros grupos que enfrentam o desafio de trabalhar com uma população celular rara. Como o procedimento precisa acumular 40 glândulas, é importante praticar as dissecções. Preparar as dicas caseiras de pipeta também é importante, e por isso você deve visualizá-la no vídeo como fazê-lo e se preparar com antecedência.Antes de iniciar o procedimento, corte e rodada de chama, largas, 200 dicas de microliter para manusear as glândulas, e passe a abertura da ponta de múltiplas pontas de 1.000 microliter perto de uma chama por menos de um segundo para estreitar as aberturas. Em seguida, classifique as pontas modificadas de mais estreitas para mais largas com base em sua velocidade de aspiração. Para dissecção da glândula de acesso, coloque 20 a 25 drosophila macho em um prato de vidro no gelo, e use fórceps e um microscópio de dissecção para remover o trato reprodutivo de uma mosca macho.Limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos, incluindo os testículos e a lâmpada ejaculatória, e transfira as glândulas acessórias para uma placa de vidro contendo meio suplementado de soro à temperatura ambiente. Quando 20 pares de glândulas acessórias tiverem sido coletados, lave as glândulas em um prato de PBS por um a dois minutos em temperatura ambiente. No final da lavagem, transfira as glândulas para uma solução de dissociação recém-preparada, e use fórceps afiados sob um microscópio dissecando para beliscar firmemente o meio de um lobo glandular.Usando um segundo par de fórceps, corte o tecido com a ponta afiada para separar a região proximal da glândula acessório e o ducto ejaculatório da porção da glândula que contém células secundárias. Corte as glândulas para que as peptidases possam alcançar as células que são protegidas de outra forma pela camada muscular externa e pelo fluido seminal viscoso no lúmen da glândula. Em seguida, use uma dica de pipeta pré-molhada, arredondada por chamas, larga e de 200 microliter para transferir as glândulas para um tubo de 1,5 mililitro.Para digestão tecidual, coloque o tubo em um shaker Celsius de 37 graus por 60 minutos a 1.000 rotações por minuto. No final da incubação, pare a digestão com um mililitro de meio suplementado por soro, e use uma dica de pipeta pré-molhada, arredondada por chamas, larga, 1.000 microliter para transferir as amostras para uma placa de 24 poços. Verifique as células quanto à expressão GFP sob um microscópio fluorescente.A maioria das pontas da glândula deve parecer intacta, e algumas células secundárias devem ser separadas. Use uma ponta de pipeta arredondada, estreita, de 1.000 microliter para triturar suavemente as células três a cinco vezes para interromper o tecido da glândula acessório. Em seguida, use uma dica de pipeta muito estreita, arredondada, de 1.000 microliter uma a duas vezes para individualizar as células.Deixe as células se acomodarem por 15 minutos. Confirme se as células parecem saudáveis sob o microscópio e remova o excesso de meio. Em seguida, transfira as células para um novo tubo de 1,5 mililitro e enxágue os poços com meio fresco para recuperar quaisquer células restantes.A construção Abd-B-GAL4 pode ser usada nestes experimentos para rotular células secundárias, mas não principais com GFP. Neste estudo, ambos os tipos de células foram classificados a partir de glândulas acessórios mutantes iab-6cocuD1. Este mutante D1 não tem a expressão de transcrições Abd-B e MSA, que afetam o desenvolvimento de células secundárias, morfologia e função.Após a dissociação celular, o FACS é usado para selecionar células vivas com base no DRAQ7, e o nível de fluorescência GFP é usado para isolar células secundárias e células principais. O RNA é extraído de cada população celular e ajustado a dois nanogramas por amostra para rt-qPCR subsequente e sequenciamento. A quantificação da expressão de genes específicos por PCR quantitativo em tempo real em extratos de células principais e secundárias do tipo selvagem revela que os genes de células secundárias Rab19 e MSA são detectados apenas a partir de extratos de células secundárias, enquanto o peptídeo sexual genético principal da célula é detectado apenas a partir de amostras de células principais.A principal análise de componentes em dados de sequenciamento de RNA de três tipos selvagens e três réplicas mutantes revela que o tipo selvagem replica ambos os aglomerados próximos um do outro e longe das amostras mutantes. Visualizar leituras alinhadas a genes específicos mostra que genes domésticos como actin 5C, e os genes específicos de células secundárias Rab19 e Dve são expressos em ambos os genótipos. Para a MSA, no entanto, a forte expressão do gene observado em moscas do tipo selvagem é perdida nas cepas mutantes.Obter células secundárias dissociadas suficientes é importante para um procedimento bem sucedido. Assim, verifique o protocolo de dissecção e dissociação em experimentos de pequena escala. Este método permite a classificação de ambos os tipos celulares de glândulas acessórias a partir de um pequeno número de moscas, permitindo o estudo de como essas células reagem transcricionalmente a múltiplas condições genéticas ou ambientais.O sucesso reprodutivo masculino é conhecido por ser afetado por muitas coisas, incluindo genótipo, idade e status de acasalamento. A facilidade deste método deve nos permitir investigar como esses fatores afetam a transcrição da glândula acessório.

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Aprenda a isolar células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila usando FACS para análise transcriptômica. Este método permite extrair RNA de populações celulares raras para estudos de biologia reprodutiva.

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