Name: Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda a pulverização criogênica de patas de camundongo para análise molecular de inflamação em artrite. Este método melhora a extração de RNA e proteínas, permitindo perfis transcriptômicos e proteômicos de alta qualidade.

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Os autores desejam agradecer a Edith Janssen pela revisão crítica do manuscrito e Navin Rao e Jennifer Towne por seu apoio à publicação deste manuscrito.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as políticas do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Janssen R&D.
1. Método de Pulverização baseado em fábrica de freezer criogênico
<ol><li>Na terminação do estudo do CIA, os ratos do sacrifício com isoflurane de 1.5% seguidos pela deslocação cervical.</li>
	<li>No dia do processamento de tecidos, pré-chill todos os instrumentos (espátulas, frascos de moagem, etc) em gelo seco por um mínimo de 10 min. Use luvas térmicas para evitar danos ao congelamento.</li>
	<li>Corte patas traseiras com uma tesoura na linha de pele como descrito na Figura 1A.</li>
	<li>Transfira cada pata em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, congele-se imediatamente em nitrogênio líquido e guarde patas congeladas a -80 °C. Não mantenha amostras congeladas por mais de uma semana.</li>
	<li>Encha o moinho do congelador com nitrogênio líquido, como mostrado na Figura 1B e deixe equilibrar por pelo menos 10 min.</li>
	<li>Mantenha a amostra não processada em gelo seco e evite ciclos de congelamento-degelo.</li>
	<li>Transfira uma pata traseira para o frasco de moagem de policarbonato grande pré-refrigerado com um plugue de aço inferior, insira o impactor de aço pré-refrigerado e feche o frasco de moagem de policarbonato com a ficha de aço superior pré-refrigerada (Figura 1C).</li>
	<li>Transfira grandes frascos de moagem de policarbonato com as amostras para o moinho congelador pré-preenchido com líquido e feche a tampa com o fecho de borracha encontrado na frente do instrumento.</li>
	<li>Deixe as amostras esfriar em nitrogênio líquido por 1 minuto.</li>
	<li>Defina a fábrica de freezer saem do programa de 1 minuto com 10 ciclos por segundo e pressione o botão de partida. Aguarde o moinho do congelador para completar o seu ciclo. Nota: A máquina faz um som de bateria como o impactor de aço se move para frente e para trás. Use tampões de ouvido para evitar a perda auditiva.</li>
	<li>Abra a tampa do moinho congelador, tirar o frasco de moagem de policarbonato grande e colocá-lo em um extrator, como descrito na Figura 1D. Retire a ficha de aço superior, colocando pressão para baixo sobre a alça preta até que a ficha de aço desliza para fora do tubo de policarbonato.</li>
	<li>Transfira o grande frasco de moagem de policarbonato aberto para o gelo seco. Retire o impactor de aço com fórceps pré-refrigerados.</li>
	<li>Transfira o pó congelado para o tubo cônico pré-refrigerado de 50 mL.</li>
	<li>Peso 30-50 mg de pó congelado em um tubo de microcentrífuga congelado de 1,5 mL para extração de RNA e 100-200 mg de pó congelado para extração de proteína. Nota: O pó congelado deve olhar como a areia fina branca ou cor-de-rosa clara como descrito na figura 1E.</li>
	<li>Armazenar amostras pulverizadas em -80 °C e proceder a RNA e isolamentos de proteínas dentro de 24 h.</li>
</ol>2. Extração de RNA
<ol><li>Adicione 10 μL de β-mercaptoetanol (β-ME) por 1 mL de buffer RLT.</li>
	<li>Calcule o volume de RLT Buffer correspondente a uma proporção de 23,3 mL/mg de tecido e adicione o volume apropriado de RLT Buffer com β-ME ao tubo com pó congelado. Esta relação foi empiricamente determinada a ser ideal para as patas do rato.</li>
	<li>Vortex a amostra em 3.000 RPM para 10 s.</li>
	<li>Misture bem por pipetting cima e para baixo 10 vezes vigorosamente com um pipettor 1 mL.</li>
	<li>Vortex a amostra novamente em 3.000 RPM para 20 s.</li>
	<li>Centrífuga do tubo a 13.000 x g por 2 min.</li>
	<li>Transfira 700 μL das supernatantes para um tubo fresco e adicione 700 μL de 70% de etanol. Nota: Se o μL está no tubo, é aceitável prosseguir, ainda adicionando volume equivalente de 70% de etanol.</li>
	<li>Carregue 700 μL da amostra em uma coluna de purificação de RNA.</li>
	<li>Centrífuga do tubo a ≥10.000 x g para 30 s.</li>
	<li>Descarte o fluxo e carregue a parte restante da amostra para a coluna RNeasy.</li>
	<li>Centrífuga do tubo a ≥10.000 x g para 30 s.</li>
	<li>Descarte o fluxo através e lave a coluna adicionando 700 μL de buffer RW1 com centrífuga de ≥10.000 x g para 30 s. Se executar a digestão de DNASE opção, 350 μL de RW1 é adicionado antes do tratamento de DNASE.  E um adicional de 350 μL de RW1 é adicionado após o tratamento de DNASE.</li>
	<li>Opcional) Realize uma etapa de digestão de DNase siga as instruções do fabricante.</li>
	<li>Lave o tubo duas vezes adicionando 500 μL de buffer RPE seguido de centrífugação em ≥10,000 x g para 30 s. Descarte fluxo através de cada vez.</li>
	<li>Seque a coluna por centrífuga a ≥10.000 x g por 2 min.</li>
	<li>RNA elute adicionando 50 μL de água com centrífuga em ≥10.000 x g para 2 min. Coletar fluxo através e transferência para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Determine a quantidade de RNA usando o método de escolha e armazenação do pesquisador a -80 °C antes de uma análise mais aprofundada.</li>
</ol>3. Extração de proteína
<ol><li>Diluir a solução de estoque de lyse de células 10x na solução de estoque de lyse de células 1x usando água de grau de cultura celular.</li>
	<li>Reconstituir o inibidor protease cocktail conjunto i com 1 mL de água para fazer um estoque inibidor de protease 100x.</li>
	<li>Adicione 100 μL de inibidor de protease a 9,9 mL de lyse celular 1x para fazer uma solução de estoque final 1x.</li>
	<li>Adicione 4 μL de gelo frio 1x Cell Lysis Buffer por mg de tecido em pó (por exemplo, 800 μL de dbuffer de lyse para 200 mg de tecido em pó).</li>
	<li>Adicione uma conta de aço inoxidável de 5 mm ao tubo.</li>
	<li>Vortex o tubo em 3.000 RPM para 60 s. Transfira o tubo para o gelo molhado e continue para a próxima amostra.</li>
	<li>Coloque todos os tubos de amostra em uma caixa e agite a caixa de centrífuga em um roqueiro a 1.000 RPM, 4 °C por 1 h. Nota: Os investigadores podem encontrar que coloc a caixa vertical pode facilitar a melhor mistura com o grânulo.</li>
	<li>Centrífugas os tubos a 10.000 x g e 4 °C por 15 min.</li>
	<li>Transfira as supernatantes em um tubo fresco e evite a camada gorda na parte superior.</li>
	<li>Determinar a concentração total de proteínas. 10 a 30 vibrações duplas de liceu de proteína são ideais para um teste de BCA.</li>
	<li>Aliquot a amostra em tubos de microcentrírífuga de 1,5 mL e armazenar a -80 °C antes de uma análise mais aprofundada.</li>
</ol>

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li>
<li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).</li>
<li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis%3A+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li>
<li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+factors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focus+on+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li>
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<li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li>
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<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li>
</ol>

Os autores BJ, SH, ML, RM, ML, TO e FS são funcionários da Janssen Research & Development Inc e são acionistas da empresa-mãe, Johnson & Johnson, Inc.

Embora haja uma forte lógica científica para avaliar as vias moleculares nos tecidos sinoviais, muitos relatórios sobre o perfil imunológico do modelo da CIA murine foram focados no sangue periférico, enquanto os dados de análise de proteínas e RNA de patas inflamadas são bastante limitados. Existem várias razões possíveis para este viés: as articulações do tornozelo murine não são maiores do que ~ 2 cm; as áreas afetadas consistem em tecidos de pele, osso e conjuntivo, que muitas vezes são difíceis de homogeneizar usand...

A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória sistêmica crônica com sinofite simétrica persistente nas articulações e envolvimento articular extra de órgãos como a pele, coração, pulmões e olhos1. Embora as manifestações sistêmicas da resposta imune sejam evidentes em pacientes humanos, uma das características da patologia da RA é a infiltração de células imunes no tecido sinovial e a proliferação de células fibroblastas sinoviais2.
Semelhante ao AR humano, o modelo de artrite induzida por colágeno do rato (CIA) provoca forte inflamação do tecido com respostas imunes ativas em tecidos sinoviais e compartimentos sistêmicos. A susceptibilidade de diferentes cepas de camundongos para links modelo da CIA para Major Histocompatibilidade Complexo (MHC) haplótipo e antígeno específico célula T e interações celulares B3,4. Além disso, muitas vias patogênicas na AR humana, incluindo a produção de autoanticorpos, deposição de complexo imune, ativação de células mieloides, manifestações poliarticulares e formação de pannus com infiltração imune sinovial, também são evidentes neste modelo 5,6. Os investigadores empregaram este modelo bem estabelecido do CIA para investigar efeitos de tratamentos anti-inflamatórios da citocina7. Muitos produtos biológicos aprovados para doenças auto-imunes ou inflamatórias, como anti-TNFα e anti-IL-6, são encontrados para ser eficaz no modelo da CIA8,9.
O perfil das interações do sistema imunológico no tecido sinovial é crucial para elucidar os mecanismos moleculares associados à patogênese da AR. No ambiente clínico humano, uma prática comum é realizar biópsias sinoviais de agulha a orientação de imagens de ultrassom. Nas configurações pré-clínicas, a arquitetura menor das articulações de urina torna os procedimentos de biópsia muito mais difíceis, se não impossíveis. Recentemente, demonstramos a utilização do modelo murine CIA para avaliar combinações de drogas para impactar pontos finais díspares e resolver a doença em uma abordagem combinatória10. Um método criogênico de pulverização à base de uma fábrica de freezer foi empregado para processar patas de urina inflamadas em pós finos homogêneos e estabeleceu processos a jusante para extrair RNA e proteínas. Este método protege o RNA e a proteína dos processos degralísticos enzimáticos e químicos e permite-nos aplicar múltiplos métodos analíticos a uma única fonte homogênea da amostra.

<table><tbody><tr><td>Grânulo de aço inoxidável de 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Agente redutor de amostra que inibe as enzimas RNASE</td></tr><tr><td>Kit Bioanalisador</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Kit de qualificação de RNA</td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Cultura de Células Água</td><td>Corning</td><td>25-055-CI</td><td>Solução</td></tr><tr><td>de estoque de lise de célula</td> de água <td>Sinalização celular</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>Tubos de microfuga</td></tr><tr><td>Caixa centrífuga de tubo Eppendorf</td><td>Nalgene</td><td>5055</td><td>Caixa para segurar tubos eppendorf em arranjo de tubos horizontal</td></tr><tr><td>Everlast 247 Variable Speed Rocker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td></td></tr><tr><td>Freezer Mill</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6875</td><td>Freezer/Mill para processamento de patas em pó pulverizado</td></tr><tr><td>Frasco de moagem</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6801</td><td>Frasco de policarbonato para processamento de patas em pó pulverizado</td></tr><tr><td>Kit Pierce BCA</td><td>Kit Pierce</td><td>23225</td><td>para quantificação de proteína total</td></tr> Conjunto <tr><td>de coquetel de inibidor de protease 1</td><td>Calbiochem</td><td>539131</td><td>Protease</td></tr><tr><td>Kit BCA de proteína</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Kit Quantigene</td><td>Thermofisher</td><td>QP1013</td><td>Kit de análise de bDNA</td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td> Tampão RLT <td>de centrifugação</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td></tr><tr><td>Tampão</td> de <td>extração de RNA</td><td>Qiagen</td><td>79216</td> Mini</tr><tr><td>kit RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>incluindo coluna RNeasy, tampão RLT e tampão RW1</td></tr><tr><td>Espátula Shaker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td>Rocker/Shaker</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10806-412</td><td>Espátula para transferência de pó</td></tr><tr><td>Conta de aço inoxidável</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>Conta para misturar durante a extração de proteínas</td></tr><tr><td>Extrator de tubo</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6884</td><td>Extrator para remover a parte superior do frasco de moagem</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>Mistura de amostras</td></tr></tbody></table>

um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

O perfil de alterações moleculares nos tecidos locais é crucial para entender o mecanismo de ação dos candidatos terapêuticos in vivo. No campo da pesquisa da artrite, muitos estudos são focalizados nas junções inflamadas que são compostas de uma mistura complexa do osso, da cartilagem, do músculo, das pilhas estromais e das pilhas imunes. Aqui, estabelecemos um método mecânico confiável e robusto para interromper as patas inflamadas do rato em amostras pulverizadas homogêneas em um ambiente criogenicamente controlado. As lisatas proteicas e rna foram processadas para permitir desfechos proteômicos e transcricionais e caracterização molecular de vias de doenças relevantes no tecido local.

Aqui, nós mostramos uma visualização representativa da imagem do gel do RNA extraído das patas dianteiras de ratos do CIA na figura 2A. O rRNA 28S e a banda rRNA 18S indicam que todas as amostras têm quantidade suficiente de RNA intacto. Em seguida, mostramos um gráfico representativo de dispersão de concentrações totais de proteínas com base na análise de proteína BCA na Figura 2B. As concentraç...

Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.

Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

A avaliação dos perfis moleculares nos tecidos locais é um passo crítico para a compreensão do mecanismo de ação dos fármacos ativos, pois são avaliados em modelos pré-clínicos relevantes para a doença. No campo da pesquisa da artrite, o ambiente de interesse do tecido local são as pequenas articulações de peso que são compostas por uma mistura complexa de células ósseas, cartilagem, muscular e imune. Aqui descrevemos um método robusto confiável para a interrupção mecânica e/ou pulverização deste complexo ambiente tecidual em um ambiente criogenicamente controlado.Este método pode então ser usado para gerar esforços de perfil proteômico e transcricional a jusante para estabelecer assinaturas moleculares da doença a partir de uma única fonte de amostra uniforme. Este método gera um pó homogêneo ao contrário de muitas outras técnicas antigas. Além disso, o antigo procedimento de isolamento de temperatura permite o isolamento do RNA de alta qualidade.Este método pode então ser usado para gerar perfis proteômicos e transcricionais a jusante, permitindo a caracterização molecular de caminhos de interesse relevantes da doença. Este método pode fornecer insights para qualquer campo de pesquisa que esteja derivando assinaturas moleculares de tecidos. O método poderia ser estendido a qualquer sistema tecidual complexo que tenha densos e difíceis de dissociar constituintes.Embora não tenhamos avaliado até agora, pudemos ver a aplicação potencial de tecidos de cartilagem densas como orelhas ou ossos. A natureza crítica do tempo de transferir o pó para tubos para pesagem é algo que requer prática. Se muito tempo for levado, o pó começará a descongelar e se tornar amorfo.É importante limitar o número de amostras para 10 a 15 até que você esteja confortável com o procedimento. No dia do processamento tecidual, todos os instrumentos necessários em gelo seco durante o mínimo de 10 minutos. Use luvas térmicas para evitar ser prejudicado pelo frio extremo.Em seguida, transfira cada uma das patas de rato preparadas para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro e imediatamente encaixe o congelamento em nitrogênio líquido. Guarde as patas congeladas a 80 graus Celsius negativos. Quando estiver pronto para continuar, encha um moinho de congelador com nitrogênio líquido e deixe equilibrar por pelo menos 10 minutos.Coloque a amostra não processada em gelo seco e mantenha-a lá para evitar ciclos de congelamento/degelo. Em seguida, transfira uma pata traseira em um frasco de moagem de policarbonato grande pré-refrigerado com um plugue de aço inferior. Insira o impactor de aço pré-refrigerado e feche o frasco de moagem de policarbonato com o plugue de aço superior pré-refrigerado.Transfira os frascos de moagem de policarbonato grandes com as amostras para o moinho de congelador pré-preenchido e feche a tampa com o fecho de borracha encontrado na frente do instrumento. Deixe as amostras esfriarem no nitrogênio líquido por um minuto. Em seguida, coloque o moinho de congelador no programa de um minuto com 10 ciclos por segundo.Pressione o botão de execução e aguarde que o moinho de congelador complete seu ciclo. Depois disso, abra a tampa do moinho de congelador e tire o frasco de moagem de policarbonato grande. Coloque o frasco de moagem em um extrator e remova o plugue de aço superior colocando pressão para baixo na alça preta até que o plugue de aço deslize para fora do tubo de policarbonato.Transfira o frasco de moagem aberto para gelo seco e use fórceps pré-refrigerados para remover o impactor de aço. Transfira o pó congelado para um tubo cônico pré-refrigerado de 50 mililitros. Pesar entre 30 e 50 miligramas do pó congelado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro hierárquico para extração de RNA e entre 100 e 200 miligramas para extração de proteínas.Armazene as amostras pulverizadas a 80 graus Celsius negativos e prossiga para isolamentos de RNA e proteínas dentro de 24 horas. Primeiro, adicione 10 microliters de beta-mercaptoetanol para cada mililitro de buffer RLT. Calcule o volume do tampão RLT correspondente a uma razão de 23,3 mililitros por miligrama de tecido e adicione o volume apropriado de tampão RLT com beta-mercaptoetanol ao tubo com pó congelado.Vórtice a amostra a 3.000 RPM por 10 segundos. Use uma pipetter de um mililitro para pipeta para cima e para baixo vigorosamente 10 vezes e vórtice da amostra novamente a 3.000 RPM por 20 segundos. Centrifugar a 13.000 vezes g por dois minutos e transferir 700 microliters do supernante para um tubo fresco.Adicione 700 microliters de 70% de etanol a este tubo e carregue 700 microliters da amostra em uma coluna de purificação de RNA. Centrifugar o tubo a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g durante 30 segundos. Descarte o fluxo e carregue a parte restante da amostra na coluna RNeasy e centrifugar o tubo novamente a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g durante 30 segundos.Descarte o fluxo e lave a coluna adicionando 700 microliters de tampão RW1 e centrifugando pelo menos a velocidade de 10.000 vezes g por 30 segundos. Se realizar a digestão DNAse opção, 350 microliters de RW1 são adicionados antes do tratamento DNAse. E após o tratamento DNAse, mais 350 microliters de RW1 são adicionados.Em seguida, lave a coluna duas vezes adicionando 500 microliters de tampão RPE e centrífuga a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g por 30 segundos certificando-se de descartar o fluxo de cada vez. Depois disso, seque a coluna centrifugando-a a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g por dois minutos. Elute o RNA adicionando 50 microliters de água e centrifugando a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g por dois minutos.Colete o fluxo e transfira-o para um novo tubo de 1,5 mililitro. Determine a quantidade de RNA usando o método de escolha do pesquisador e armazene a 80 graus Celsius negativos antes de uma análise mais aprofundada. Diluir a solução de estoque de lise celular 10X para a solução de estoque de lise celular 1X com água de grau de cultura celular.Reconstituir o coquetel inibidor de protease definir um com um mililitro de água para fazer um estoque inibidor de protease 100X. Adicione 100 mililitros de inibidor de protease a 9,9 mililitros de tampão de lise celular 1X para obter uma solução de estoque final 1X. Adicione quatro microliters de tampão de lise celular fria para cada miligrama de pó de tecido e adicione uma conta de aço inoxidável de cinco milímetros ao tubo.Vórtice o tubo a 3.000 RPM por 60 segundos. Transfira o tubo para o gelo molhado e continue para a próxima amostra. Além disso, os pesquisadores podem descobrir que colocar a caixa vertical pode facilitar uma melhor mistura com a conta.Após uma hora, centrifufique os tubos a 10.000 vezes g e a 4 graus Celsius por 15 minutos. Transfira os supernantes para um tubo fresco, certificando-se de evitar a camada de gordura na parte superior. Determine a concentração total de proteínas.Alíquotar cada amostra em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mililitro e armazená-los a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para realizar uma análise mais aprofundada. Neste estudo, um método de pulverização criogênica é usado para processar patas murinas, a fim de melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a respostas inflamatórias. Uma visualização representativa de imagem em gel mostra o RNA extraído das patas dianteiras dos ratos da CIA.As bandas de rRNA 28S e 18S indicam que todas as amostras têm quantidade suficiente de RNA intacto. Um gráfico representativo das concentrações totais de proteínas baseadas na análise de BCA proteica é mostrado aqui. Concentrações totais de proteínas de camundongos ingênuos, camundongos da CIA ou camundongos da CIA sob vários tratamentos são comparáveis entre grupos.As análises luminex são então conduzidas para determinar as concentrações de citocinas inflamatórias e quimiocinas no extrato de proteínas. Um gráfico representativo das concentrações de citocinas e quimioterapias normalizadas revela que, quando comparados com camundongos ingênuos, várias citocinas são elevadas em camundongos da CIA e o tratamento com anticorpo anti-IL17A inibe significativamente a produção de várias citocinas. A análise da microarray é realizada para avaliar as alterações de transcriptome na CIA e efeitos relacionados ao tratamento.Um gráfico representativo do mapa de calor de genes aumentou significativamente em camundongos da CIA em comparação com ratos ingênuos é mostrado aqui. Ao realizar esse procedimento, é fundamental que os pesquisadores minimizem o tempo em que o tubo e o pó são mantidos fora do gelo seco. Isso ajuda a evitar o descongelamento do pó e problemas subsequentes ao RNA degradado e à proteína.A alta qualidade das assinaturas moleculares geradas por essa técnica permite aos pesquisadores interrogar o perfil único que um terapêutico irá transmitir e ainda permite a diferenciação de mecanismos que podem ser utilizados para tratar condições artríticas. Esta técnica poderia ser usada para extrair uma série de tecidos densos como orelhas e ossos para avaliar ainda mais assinaturas moleculares nesses tecidos de interesse. Entender como a terapêutica modula as assinaturas moleculares da doença nos permite avaliar melhor quais caminhos específicos de sinalização são modulados.E talvez ainda mais importante, quais caminhos não são regulados com o mecanismo terapêutico sendo avaliado. Ao trabalhar com nitrogênio líquido e gelo seco, é imprescindível usar equipamentos de proteção individual, incluindo luvas devidamente avaliadas e escudos faciais. A exposição da pele por mais de alguns segundos pode causar queimaduras graves.Ao trabalhar com grandes quantidades de gelo seco, é importante trabalhar em uma área bem ventilada, pois o gelo seco libera dióxido de carbono.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo mostra uma terapia baseada em células para artrite autoimune em camundongos. As células T reguladoras derivadas de iPSC que expressam receptores específicos de ovalbumina são injetadas com albumina de soro bovino metilado (mBSA) emulsionada em um adjuvante. As células apresentadoras de antígenos murinos (APCs) processam e apresentam o mBSA às células T, estimulando a ativação e migração das células T para a membrana sinovial da articulação do joelho. As injeções subsequentes envolvem...

Uma terapia baseada em células para artrite autoimune em um modelo murino

Desenvolvemos uma medida evocada da dor da artrite e, juntamente com um método padronizado para medir a dor espontânea em diferentes modelos de murino de artrite induzida quimicamente. Estas medidas são sensíveis e reprodutíveis para diferentes tipos de dor nas articulações.

Espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares

Aqui, apresentamos três métodos para avaliar a migração de neutrófilos e infiltração tanto in vivo quanto in vitro. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapêuticas promissoras visando a migração de neutrófilos.

Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

O presente protocolo descreve os arranhões controlados da microlâmina na superfície da cartilagem articular após a desestabilização do joelho do camundongo pelo corte do ligamento miniscotibial medial. Este modelo animal apresenta uma forma acelerada de osteoartrite (OA) adequada para estudar a formação de osteófitos, osteosclerose e dor em estágio inicial.

Desestabilização do Menisco Medial e Cartilagem Scratch Murine Modelo de Osteoartrite Acelerada

O presente estudo fornece um protocolo modificado para isolar macrófagos sinoviais e fibroblastos do tecido da artrite inflamatória murina.

Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

Apresentamos um protocolo para manipulação de Tuina realizada em ratos com osteoartrite de joelho induzida por gesso imobilizado. Com base nos resultados preliminares, sugeriu-se que a eficácia do método dependia da redução da inflamação e da perda de cartilagem.

Manipulação de Tuina para Reduzir a Inflamação e Perda de Cartilagem em Ratos com Osteoartrite de Joelho

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

A imagem in vivo das articulações é uma técnica valiosa para descobrir o comportamento migratório dos leucócitos e a dinâmica molecular dentro das articulações inflamadas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens in vivo das articulações usando um modelo murino da artrite induzida por colágeno tipo II (CIA).

In vivo Imagens revelam o comportamento migratório dos leucócitos dentro das articulações

Aqui, relatamos um protocolo que estabelece um modelo de camundongo com artrite reumatóide (AR) por meio da transferência adotiva de células T CD4+ de camundongos SKG, fornecendo uma ferramenta experimental rápida e confiável para investigar os mecanismos imunológicos, progressão patológica e desenvolvimento de novos tratamentos para AR.

Um modelo de transferência adotiva de artrite reumatóide em camundongos

Células M em um epitélio folículo-associados especializados que cobrem as placas de Peyer desempenhar um papel importante para a vigilância imunológica da mucosa intestinal em tecido linfóide associado. Aqui descrevemos o método de avaliação para transcitose bacteriana por células...

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

Aprenda a pulverização criogênica de patas de camundongo para análise molecular de inflamação em artrite. Este método melhora a extração de RNA e proteínas, permitindo perfis transcriptômicos e proteômicos de alta qualidade.

Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno (Vídeo) | JoVE Journal

Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

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