Name: Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Aprenda a técnica de imagem em células vivas para analisar o transporte intracelular de organelas em astrócitos murinos. Este método permite estudar dinâmicas de partículas em tempo real sob condições fisiológicas e patológicas.

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DNL foi apoiado pela Universidade da Carolina do Norte na Chapel Hill (UNC) escola de medicina como um estudioso Simmons. O TWR foi apoiado pelo UNC PREP Grant R25 GM089569. Trabalho usando o centro de neurociência UNC microscopia núcleo Facility foi apoiado, em parte, pelo financiamento do NIH-NINDS Neuroscience Center support Grant p30 NS045892 e o NIH-NICHD intelectual e desenvolvimento apoio centro de pesquisa subsídio U54 HD079124.

Todos os procedimentos animais foram realizados com a aprovação da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, cuidado animal e Comitê de uso (IACUC).
1. dissecção cerebral e cultura de astrócitos primários de camundongo
Nota: o seguinte protocolo foi adaptado a partir de métodos publicados, que segue o procedimento original desenvolvido por McCarthy e devellis13,14,15. Culturas de células mistas de astrócitos de McCarthy/devellis (MD) são preparadas a partir do dia pós-Natal 2 − 4 (P2 − P4) córtices de camundongo, tratados com um fator antimitótico, e purificados para produzir a cultura final enriquecida do astrocite. Quatro córtices de filhotes de rato de ambos os sexos são suficientes para gerar uma cultura de balão de cultura de tecido T75.
<ol><li>Cubra o fundo dos frascos de T75 (100% de acesso em ângulo de pescoço, 0,22 μm de tampão de filtro ventilado hidrofóbico) com poli-D-lisina (1 mg/mL no tampão Tris de 0,1 M, pH 8,5) e incubar a 37 ° c durante 24 horas antes do início da dissecção.</li>
	<li>Antes de iniciar o procedimento de dissecção, aqueça 30 mL de meios de cultura astrocitais (Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio [DMEM] alta glicose, 10% de calor-inativado soro bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina) em 37 ° c e descongelar uma alíquota de 5 mL de 2,5% tripsina no gelo. Prepare dois pratos de dissecação (60 mm de diâmetro) em gelo preenchido com 6 mL de solução de sal balanceada de Hank (HBSS) sem CA2 + ou mg2 +.</li>
	<li>Desinfecte todas as ferramentas cirúrgicas (pinça de ponta fina, tesoura de dissecação, Tesoura Vannas em linha reta, pinça Graefe com pontas curvas) em 70% de etanol antes e entre cada dissecção.</li>
	<li>Pulverize a cabeça e o pescoço dos filhotes de mouse P2 − P4 com 70% de etanol antes de eutanizar-los rapidamente por decapitação com tesouras cirúrgicas. Realize uma incisão posterior à linha média anterior ao longo do couro cabeludo para expor o crânio. Corte cuidadosamente o crânio do pescoço para o nariz.</li>
	<li>Realize duas incisões laterais adicionais superiores aos olhos. Usando pinças finos da ponta lanç delicadamente as aletas do crânio ao lado. Retire o cérebro e coloque-o no primeiro prato de dissecação preenchido com HBSS gelada sem CA2 + ou mg2 +. Mantenha o prato no gelo e continue colhendo o resto do cérebro. Nota: realize o restante do procedimento de dissecção um escopo de dissecação.</li>
	<li>Retire os bulbos olfatório usando as tesouras de Vannas ou as pinças finas (Figura 1ai). Com o fórceps curvo da ponta na interseção das fissuras transversais e interhemisféricas, introduza delicadamente um segundo par de fórceps curvado da ponta entre o córtice e o diencephalon, abrindo lentamente o fórceps para separar os hemisférios cerebrais do descanso de o cérebro (Figura 1aIi, Aiii). Remova o tecido indesejado (Figura 1AIV).</li>
	<li>Para cada hemisfério cortical, Retire cuidadosamente as meninges com pinça de ponta fina. Opcionalmente, retire o hipocampo dos córtices. Transfira os córtices dissecados do rato em um segundo prato enchido com o HBSS gelo-frio sem CA2 + ou magnésio2 + e mantenha-o no gelo ao dissecação os cérebros restantes. Nota: realize as próximas etapas condições assépticas em uma capa de fluxo laminar.</li>
	<li>Corte os córtices dissecados em pedaços pequenos (aproximadamente 2 − 4 mm) usando uma tesoura cirúrgica afiada estéril ou um bisturi. Transfira o tecido dissecado para um tubo cônico de 50 mL contendo solução enzimática (22,5 mL de HBSS sem CA2 + ou mg2 +, 2,5 ml 2,5% tripsina). Incubar a 37 ° c por 30 min com inversão suave a cada 10 min.</li>
	<li>Colete o tecido digerido por centrifugação em 300 x g por 5 min e retire a solução enzimática por decantação (não use um aspirador a vácuo). Adicione 10 ml de meios de cultura do astrocyte e dissociar o tecido em únicas pilhas introduzindo a solução 20 − 30x usando uma pipeta sorológicos de 10 ml.</li>
	<li>Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para minimizar os aglomerados celulares e o tecido não digerido. Colete o filtrado em um tubo cônico 50 mL limpo e ajuste o volume total a 20 mL com meios de cultura do astrocyte. Neste ponto, avalie a eficiência da dissociação cortical misturando 10 μL da suspensão da pilha com 10 μl do azul do Tripan e contando pilhas com um Hemocytometer. Nota: uma preparação de quatro córtices do rato P2 − P4 rende 10 − 15 x 106 únicas pilhas.
</li>
	<li>Aspirar a solução de revestimento poli-D-lisina das garrafas de cultura T75 e lave duas vezes com água estéril. Placa a suspensão celular de 20 mL e incubar a 37 ° c e 5% CO2.</li>
</ol>2. purificação e manutenção de culturas astrocícitos
Nota: realize todas as mudanças de mídia condições assépticas em uma capa de fluxo laminar usando estéril filtrado (0,22 μm membrana filtro) astrocyte mídia aquecida para 37 ° c.
<ol><li>Substitua a mídia celular 48 h após o chapeamento (dia in vitro 2, DIV2).</li>
	<li>Em DIV5, substitua os meios com os meios de cultura frescos do astrocyte suplementados com o arabinoside do citosina de 10 μm (arac). Nota: este passo facilita a remoção de células contaminantes, incluindo fibroblastos e outras células gliais. É importante tratar as culturas com AraC não mais do que 48 h porque uns tempos mais longos da incubação reduzirão a viabilidade do astrocyte.</li>
	<li>Em DIV7, mude meios para meios de cultura do astrocyte sem arac e comece verific diariamente o confluência da cultura. Uma vez que as pilhas alcangaram a confluência de 80%, o revestimento dois-T75 frascos para cada balão não purificada da cultura do astrocyte com poli-D-lysine e incubar em 37 ° c por pelo menos 8 h à noite.</li>
	<li>No dia seguinte, comece a purificação do astrocyte agitando os frascos da cultura em 180 rpm por 30 minutos em uma incubadora de agitação orbital de 37 ° c. Retire a mídia e substituí-lo com meios de cultura frescos astrocyte. Agitar as células a 240 rpm por 6 h em uma incubadora de agitação orbital de 37 ° c. Pré-aqueça 1x fosfato-tampão salino (PBS), meios de cultura do astrocyte, e 0,25% Trypsin-EDTA a 37 ° c 20 − 30 minutos antes do fim do período de agitação. Nota: a incubação de co2não é exigida durante as etapas de agitação. Se desejado, a mídia coletada após as etapas de agitação de 30 min e 6 h pode ser usada para cultura microglia e oligodendrócitos, respectivamente. O tratamento de AraC da cultura misturada reduzirá, entretanto, a abundância das outras pilhas glial.</li>
	<li>Retire as garrafas de cultura da coqueteleira e substitua imediatamente a mídia por 10 mL de 1X PBS quente por balão. Retire o PBS e adicione 3 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco. Incubar a 37 ° c e 5% CO2, verificando a cada 5 min para descolamento.</li>
	<li>Uma vez que as pilhas se separaram do balão, pare o tripsinização adicionando 10 ml de meios de cultura do astrocyte. Transfira astrócitos destacados para um tubo cônico de 50 mL e células da pelota por centrifugação a 300 x g por 5 min. aspirar sobrenadante e re-suspender as células em 40 ml de meios de cultura astrocícitos.</li>
	<li>Lave as garrafas de T75 revestidas com poli-D-lisina duas vezes com água estéril e placa de 20 mL da suspensão de astrocite purificada. Retorne ao ° c 37 e à incubadora de 5% CO2 . Mude os meios de cultura do astrocyte cada dois dias para uns 10 dias adicionais até que os astrócitos amadureça. Nota: cada balão T75 de astrócitos purificados deve ser suficiente para produzir 2 novos frascos de T75 com 3 x 105 células cada no chapeamento.</li>
	<li>Repita os passos 2.5 − 2.7 para passagens subsequentes ou para placas astrócitos para microscopia. Nota: a pureza das culturas do astrocyte após a adição de AraC e após a purificação pode ser avaliada qualitativamente através da microscopia de brightfield, ou mais precisamente quantificando a porcentagem de proteína ácido fibrilary glial (GFAP)-positivo células por campo de visão em imagens fluorescentes (Figura 1B, C).</li>
</ol>3. transfection de plasmídeos cDNAs etiquetados
<ol><li>O dia antes do transfection ou da rotulagem, astrócitos da semente na densidade desejada para a imagem latente 24 − 48 h borne-transfection. Uma densidade recomendada para placas de 24 poços ou 14 mm de fundo de vidro é de 2 x 104 células/poço. Nota: Este protocolo é otimizado para a transfecção de astrócitos revestidos em coberturas de vidro de 12 mm em placas de 24 poços ou 14 mm de fundo de vidro, utilizando um método baseado em lipofection. Os reagentes devem ser dimensionados dependendo do tamanho do prato de cultura em que os astrócitos estão crescendo.</li>
	<li>Diluir o reagente de lipofecção (tabela de materiais) em meios séricos reduzidos (tabela de materiais). Para optimizar a relação entre o reagente de lipofecção e o ADN, teste uma gama de diluições adequadas. Por exemplo, se utilizar o reagente empregado neste protocolo (tabela de materiais), diluir 2, 3, 4 e 5 μl do reagente de lipofecção em 50 μL de meios séricos reduzidos.</li>
	<li>Diluir 5 μg de ADN de alta pureza em 250 μL de meios séricos reduzidos. Adicionar 5 μL de reagente de potenciador de lipofecção (tabela de materiais). Combine o tubo que contém o reagente da lipofecção com um volume igual da mistura do potenciador do ADN-lipofecção. Misture com pipetagem e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 15 min.</li>
	<li>Remova os meios de cultura do astrocyte e adicione a mistura do transfection (etapa 3,3) às células Dropwise. Após uma incubação de 6 h a 37 ° c e 5% CO2, substitua o complexo de transfecção por um volume adequado de meios de cultura astrocícitos (2 ml para pratos inferiores de vidro de 14 mm). Incubar por um adicional 24 − 72 h antes de prosseguir para a aquisição de imagem. Monitore atentamente a duração da etapa de incubação para alcançar o melhor equilíbrio entre a expressão protéica e a viabilidade celular.</li>
</ol>4. rotulagem de endosomes/lisossomos atrasados usando sondas fluorescentes
Nota: algumas cargas podem ser rotuladas usando corantes fluorescentes com alta afinidade para proteínas específicas da carga. O exemplo a seguir permite a rotulagem de endosomas/lisossomas tardios com uma sonda acidópica fluorescente.
<ol><li>Diluir a sonda de rotulagem lisossomal (tabela de materiais) em 200 μL de meios de cultura astrocitária para uma concentração de trabalho de 1 μm e aplicar aos astrócitos do passo 3,1 a uma densidade de 2 x 104 células/poço. Incubar por 30 min a 37 ° c.</li>
	<li>Lave as células uma vez com os meios de cultura de astrocite quentes e substitua por meios de imagem (tabela de materiais). Prossiga para imagens ao vivo imediatamente.</li>
</ol>5. aquisição de imagens usando um sistema de imagem de lapso de tempo
Nota: a imagem latente viva do lapso de tempo deve ser feita usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade, um foco definitivo, uma câmara da incubação, e um objetivo do óleo 40x com uma abertura numérica elevada (por exemplo, Plan-apochromat 1.4 NA). Uma variedade de software de aquisição está disponível para imagens de lapso de tempo. A seleção do sistema de microscopia e software de aquisição deve basear-se na sua disponibilidade e adequação para os objetivos do estudo em particular. Algumas diretrizes gerais são fornecidas abaixo.
<ol><li>Coloc a câmara ou o prato da cultura no adaptador apropriado na fase do microscópio. Usando a luz epifluorescência, selecione as células que expressam proteínas fluorescentes ou sonda para gravar. Ajuste a iluminação da amostra fluorescente para visualizar as células selecionadas usando a câmera digital. Evite usar alta iluminação que pode causar fotobranqueamento e fototoxicidade. Ajuste o foco e o zoom.</li>
	<li>Adquira uma série de lapso de tempo de pilha Z em uma frequência de 1 quadro a cada 2 s para intervalos de tempo variando entre 300 s e 500 s usando o zoom e funções de foco definidas. Nota: a dinâmica do tráfico (velocidade, frequência de movimento, etc.) variará dependendo da proteína de interesse, portanto, o curso de tempo de aquisição pode exigir ajuste. Por exemplo, as mitocôndrias são menos motile do que lisossomos e exibem pausas freqüentes. Neste caso, é mais apropriado ajustar os parâmetros de aquisição para 1 quadro a cada 5 s para 800 s.</li>
	<li>Salve imagens de lapso de tempo e exporte-as como arquivos de pilha AVI ou TIFF.</li>
</ol>6. análise de imagem
Nota: a análise de imagem foi realizada usando o plugin KymoToolBox para ImageJ/Fiji16. Detalhado passo-a-passo instruções escritas estão disponíveis on-line17. As seguintes etapas abreviadas devem ser suficientes para criar os kymographs e extrair os parâmetros de transporte de partículas.
<ol><li>Abra a sequência de imagens de lapso de tempo no software ImageJ/Fiji. Importe imagens do menu arquivo como arquivos AVI ou TIFF Stack. Converta as imagens para 8 bits ou 16 bits, selecionando um desses tipos de imagem usando a ferramenta de tipo no menu de imagem . Se estiver trabalhando com arquivos RGB, divida os canais usando a ferramenta dividir canal disponível no recurso cor no menu imagem .</li>
	<li>Para gerar um quimógrafo (representação em posição e tempo de trajetórias de partículas), desenhe cada faixa na qual as partículas estão se movendo traçando uma linha ao longo das trajetórias das partículas usando a ferramenta de linha segmentada . Para atribuir corretamente a direcionalidade do movimento, desenhe a polilinha usando a mesma convenção direcional desejada para todos os filmes para que a polaridade seja consistente dentro e entre todas as células que estão sendo estudadas. Por exemplo, desenhe a polilinha do centro da célula em direção à periferia ou vice-versa. Ajuste a largura da linha para corresponder à espessura da faixa clicando duas vezes na ferramenta linha .</li>
	<li>Execute o draw Kymo macro do plugin KymoToolBox usando uma largura de linha de 10. Um prompt pedindo para calibrar a imagem no tempo (número de quadros, taxa de quadros) e espaço (x, y resolução) aparecerá. Uma vez calibrado, os kymographs são gerados e podem ser conservados como limas do TIFF para a apresentação dos dados ou a análise de partícula mais adicional.</li>
	<li>Atribua trajetórias de partículas rastreando manualmente cada partícula no quimógrafo usando a ferramenta de linha segmentada para a duração total da aquisição. Registre cada trajetória de partícula como uma região de interesse (ROI) usando a ferramenta ROI Manager encontrada no menu Analyze/Tools . Salve todos os ROIs por cada vídeo de lapso de tempo para análise posterior. Nota: é crítico atribuir a trajetória correta para as partículas individuais no quimógrafo para conseguir o cálculo o mais exato de parâmetros do transporte.<ol>
<li>Execute a macro analisar Kymo do plugin KymoToolBox. Uma janela abrirá pedindo para definir a direção "externa" do movimento de partículas (da esquerda para a direita ou vice-versa) no menu suspenso. Esta seleção depende da posição das cargas fluorescentes imaged em relação ao núcleo ou à periferia celular, conforme estabelecido na etapa 6,2. Por exemplo, se o núcleo está posicionado à esquerda das cargas, e a polilinha na etapa 6,2 foi desenhada para longe do núcleo, definir o movimento de partículas externas como "da esquerda para a direita".</li>
		<li>Defina a velocidade limite (velocidade mínima na qual uma carga é considerada motile) na janela analisar Kymo . Para cargas que se movem em velocidades de transporte intracelulares rápidas, 0,1 μm/segundo é uma escolha apropriada. Modifique esse valor para ajustar a sensibilidade do software a cada carga de juros. Ajuste a largura da linha para corresponder à espessura de cada trajetória de partícula.</li>
		<li>Selecione o log de todos os dados e registre as opções de coordenadas extrapoladas na janela analisar kymo . Isso calculará vários parâmetros de transporte de carga, incluindo velocidade média, velocidade interna, velocidade externa, distância cumulativa percorrida, distância percorrida no sentido interno ou externo, número de switches para cada partícula, percentual de tempo movendo-se em cada direção ou em pausa, etc. Os dados calculados para faixas individuais são agrupados por quimógrafo e salvos em arquivos de texto específicos para cada imagem. Nota: a opção Mostrar Kymo colorido de analisar macro kymo gera uma sobreposição codificada por cores do caminho sobre o kymograph original. As partículas que viajam para fora são coloridas no verde, para dentro no vermelho, e as partículas estacionárias no azul. A opção coordenadas de relatório na pilha original da macro analisar kymo gera uma sobreposição codificada por cores da posição do objeto extrapolado no vídeo de lapso de tempo original e no kymograph.</li>
	</ol></li>
</ol>

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 <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos uma abordagem experimental para expressar, Visualizar e rastrear organelas fluorescentamente marcadas e proteínas de membrana de interesse usando a microscopia de vídeo de lapso de tempo em astrocytes de MD cortical do mouse primário de alta pureza. Também Delineamos uma metodologia para medir a dinâmica das partículas. A visualização direta da dinâmica protéica e organela nos astrócitos primários fornece uma poderosa ferramenta para estudar a regulação do transporte intracelular nessas células in vitro...

Os astrocytes são as pilhas as mais abundantes no sistema nervoso central adulto, onde executam funções desenvolventes e homeostático originais1. Os astrócitos modulam o desenvolvimento sináptico através do contato direto com terminais pré e pós-sinápticos como parte da sinapse Tri-partite, que contém receptores de neurotransmissores, transportadores e moléculas de adesão celular que facilitam a formação de sinapse e comunicação do Neuron-astrocyte2. Além disso, os astrócitos controlam ativamente a transmissão sináptica e impedem a excitotoxicidade neuronal removendo rapidamente neurotransmissores excitatórios da fenda sináptica, reciclando neurotransmissores e participando da poda sináptica3 , 4. º , 5. º , 6. para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si, com outras células gliais, e com neurônios através de proteínas de membrana especializadas, incluindo moléculas de adesão celular, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Os astrocytes mudam ativamente os níveis de superfície destas proteínas em resposta às flutuações em seu ambiente intra e extracelular7. Além disso, mudanças nos níveis e na distribuição de mitocôndrias, gotículas lipídicas e organelas degradantes e recicladoras modulam o suprimento energético, a disponibilidade de metabolito e os processos de compensação celular que são essenciais para a função de astrocite e Sobrevivência.
As mudanças dinâmicas na proteína da membrana e no tráfico de organelas e posicionamento em astrócitos são facilitadas pela função concertada das proteínas motoras e dos adaptadores que promovem a motilidade de carga8,9. Da mesma forma, os níveis superficiais das proteínas da membrana são modulados através de eventos de internalização e reciclagem10. Estas cargas são transportadas através de uma intrincada rede de actina, microtúbulos e, possivelmente, faixas de filamentos intermediários8. Os estudos baseados na coloração da imunofluorescência da proteína de ligação final 1 (EB1), que se acumula no microtubule mais extremidades crescentes, sugerem que nos astrócitos os feixes dos microtúbulos irradiam para fora do perinucleus e estenda sua extremidade mais para a periferia11. Entretanto, uma examinação detalhada da organização e da polaridade dos microtúbulos e de outros elementos cytoesqueléticos usando a imagem latente da vivo-pilha é ainda falta. Embora muitos dos mecanismos subjacentes à dinâmica das organelas e das proteínas da membrana tenham sido extensivamente estudados em neurônios e outros tipos de células, a motilidade da carga nos astrócitos é menos bem compreendida. A maioria de nosso conhecimento atual sobre mudanças na distribuição da proteína e do organela nos astrócitos é baseada na rotulagem anticorpo-baseada tradicional da preparação fixa, que impede o exame espacial e temporal preciso da dinâmica de carga7, doze anos.
Aqui, nós descrevemos um método para etiquetar proteínas e organelas da membrana para a imagem latente viva em culturas preliminares do astrocyte do rato da pureza elevada. Usando este protocolo, nós fornecemos exemplos em que nós rastreamos a localização dinâmica de proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetada proteínas de membrana em astrocytes transfected, incluindo a junção de Gap proteína conexina 43 (Cx43-GFP) e o aminoácido excitatória transportador 1 (EAAT1-GFP). Nós igualmente descrevemos o uso de uma ponta de prova acidotropic fluorescente para visualizar organelas ácidos e para seguir sua dinâmica do tráfico em astrocytes vivos. Finalmente, demonstramos como analisar os dados de lapso de tempo para extrair e avaliar os parâmetros de transporte para cargas individuais.

<table><tbody><tr><td>2,5% Tripsina (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Bancada</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-203-637</td><td>Sorvall ST8 Centrífuga</td></tr><tr><td>Grau de Cultura de Células Water</td><td>Gen Clone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Cultura de Células</td><td>Zeiss</td><td>WSN-AXIOVERT A1</td><td>Vert.A1 escopo invertido, microscópio de cultura de tecidos invertido com recursos</td></tr> <tr><td>fluorescentesCitosina Arabinoside</td><td>Sigma</td><td>C1768-100MG</td> <td>(AraC) Dissolva o pó liofilizado em água estéril de grau de cultura de células para fazer um estoque de 10mM, alíquota e congele para armazenamento a longo prazo</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td>Dissolva o pó liofilizado em água deionizada a uma concentração máxima de 20 mg / ml, aqueça ou sonice conforme necessário. Use a 300 nM para contracoloração.</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Stemi 305</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>F.S.T</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gen Clone</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td>FIJI inativado por calor</td></tr><tr><td>(Fiji é apenas a imagem J)</td> <td>NIH</td><td>Versão 1.52i</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de ponta fina</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td>Estilo #5</td></tr><tr><td>Fonte de luz de fluorescência</td><td>Excelitas</td><td>012-63000</td><td>X-Cite 120Q</td></tr><tr><td>GFAP anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>3670S</td><td>GFAP (GA5) anticorpo monoclonal de camundongo</td></tr><tr><td>Pratos com fundo de vidro</td><td>Mattek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Prato de 35 mm | Nº 1.5 Lamínula | Diâmetro do vidro de 14 mm | </td></tr><tr><td>Pinça Graefe</td> não revestida <td>F.S.T</td><td>11054-10</td><td>Pinça Graefe Iris com pontas curvas</td></tr><tr><td>Corante verde fluorescente que mancha compartimentos ácidos (endossomos tardios e lisossomos)</td> <td>Life Technologies</td><td>L7526</td><td>LysoTracker Verde DND 26. Pré-dissolvido em DMSOS para uma solução estoque de 1mM. Diluir até à concentração de trabalho final no meio de cultura ou tampão da sua escolha.</td></tr><tr><td>Solução de Sal Balanceada Hank's (10x)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td> Mídia de Imagem <td>Livre de Magnésio e Cálcio</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td><td>Solução de Imagem de Células</td></tr><tr><td>Vivas Microscópio Confocal Invertido</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>KymoToolBox</td><td></td><td></td><td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td></tr><tr><td>Reagente Potenciador de Lipofecção</td><td>Life Technologies</td><td>11514015</td><td>Plus Reagente</td></tr> de <tr><td>Lipofecção Reagente</td><td>Life Technologies</td><td>15338100</td><td>Lipofectamine LTX reagente</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação orbital</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>8261-30-1008</td><td>Innova 4230 , incubadora de agitação orbital com controle de temperatura e velocidade</td></tr><tr><td>Solução de penicilina/estrepomicina (100x)</td><td>Gen Clone</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (10x)</td> <td>Gen Clone</td><td>25-507x</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7405</td><td>Dissolver em tampão Tris, pH 8,5, a 1mg / mL. Congele para armazenamento a longo prazo. Evite ciclos de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>Meio de soro reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>OPTI-MEM</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>75 cm^2. 100% de acesso ao pescoço angulado, tampa de filtro ventilada hidrofóbica de 0,22um</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030285</td><td>HERAcell VIOS 160i, incubadora de cultura de tecidos com controle de</td></tr> <tr><td>temperatura, umidade e CO2Tris-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>8,402 g dissolvido a um litro em água com 4,829 g Tris HCl para fazer 0,1 M Tampão Tris, pH 8,5</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>4,829 g dissolvido em um litro em água com 8,402 g Tris Base para fazer 0,1 M Tampão Tris, pH 8,5</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelho</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de Filtro a Vácuo</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-227</td><td>500 ml, membrana PES, 0,22 &micro; m</td></tr><tr><td>Tesoura Vannas reta</td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Os astrocytes estão entre os tipos os mais abundantes da pilha no cérebro adulto, onde jogam papéis chaves em um multiplicidade das funções. Como um jogador central na homeostase cerebral, os astrócitos fornecem neurônios com metabólitos vitais e água tampão extracelular, íons e glutamato. Um componente integrante da sinapse "Tri-partite", os astrócitos também são críticos na formação, poda, manutenção e modulação das sinácias. Para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si e com outras células gliais, neurônios, vasculatura cerebral e o ambiente extracelular através de uma infinidade de proteínas de membrana especializadas que incluem células moléculas de adesão, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Para apoiar este fluxo dinâmico, astrocytes, como neurônios, dependem de transporte intracelular firmemente coordenado e eficiente. Ao contrário dos neurônios, onde o tráfico intracelular tem sido extensivamente delineado, o transporte baseado em microtúcitos em astrócitos tem sido menos estudado. No entanto, o tráfico EXO-e endocítico de proteínas da membrana celular e o transporte intracelular de organela orquestram a biologia normal dos astrócitos, e esses processos são freqüentemente afetados na doença ou em resposta a lesões. Aqui nós apresentamos um protocolo direto aos astrocytes murino da alta qualidade da cultura, às proteínas astrocytic da etiqueta cDNAs e aos organelas do interesse, e para gravar sua dinâmica intracelular do transporte usando a microscopia confocal do tempo-lapso. Também demonstramos como extrair e quantificar os parâmetros de transporte relevantes dos filmes adquiridos usando o software de análise de imagem disponível (ou seja, ImageJ/FIJI) plugins.

O protocolo para o estabelecimento de astrócitos primários de MD do mouse descritos acima deve produzir culturas reprodutíveis e de alta qualidade. Embora as culturas contenham inicialmente uma mistura de astrócitos, fibroblastos e outras células gliais, incluindo microglia e oligodendrócitos (Figura 1bi, Biv; pontas de seta vermelhas), a adição de arac à cultura mista entre DIV5-DIV7 minimiza proliferação dessas células contaminantes. O tratamento combinado com AraC e a est...

Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Nosso protocolo pode ser usado para investigar a motilidade e localização de organelas astrócticas ou proteínas em ambientes extracelulares controlados e estados de doenças leves. Ao contrário das preparações fixas do MHA, que fornecem instantâneos únicos de localização de proteínas e organelas, nossa técnica de imagem ao vivo pode ser usada para analisar a dinâmica das partículas em astrócitos vivos individuais. Um dia antes da transfecção de astrócitos com a densidade apropriada para imagem em 24 a 48 horas após a transfecção.Diluir o reagente de lipofecção em meio soro reduzido à concentração experimental apropriada. Diluir cinco microgramas de DNA de alta pureza em 250 microliters de meio soro reduzido e adicionar cinco microliters de reagente de lipofecção ao tubo. Misture o reagente de lipofecção com um volume igual da mistura de melhorador de lipofecção de DNA e incubar a solução por 15 minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, remova o sobrenasciente da cultura astrócito e adicione 100 microliters da mistura de transfecção dropwise às células. Após seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, substitua o complexo de transfecção por um volume apropriado de meio de cultura de astrócito e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 24 a 72 horas. 30 minutos antes da imagem, diluir uma sonda de rotulagem lysosômica adequada em 200 microliters de cultura de astrócito para uma concentração de trabalho de um micromolar e rotular os astrócitos com uma sonda por 30 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, lave as células uma vez com meio de cultura de astrócito quente e substitua a lavagem por meio de imagem. Imediatamente após a rotulagem da sonda, coloque o recipiente de cultura de astrócito no adaptador apropriado no estágio do microscópio e usando luz de fluorescência EBI, localize as células que expressam proteínas fluorescentes ou sonda. Use a câmera digital para ajustar a iluminação da amostra fluorescente para visualizar as células selecionadas e ajustar o foco e ampliar para uma única célula.Em seguida, use as funções Zoom e Definitive Focus para adquirir uma única série de lapso de tempo de pilha Z em uma frequência de um quadro a cada dois segundos para intervalos de tempo que variam entre 300 e 500 segundos. Salve e exporte as imagens de lapso de tempo como arquivos de pilha AVI ou TIFF. Para analisar as imagens de lapso de tempo, abra a sequência de imagem de lapso de tempo em ImageJ ou Fiji e use a ferramenta Split Channel para dividir os canais.Na imagem do canal verde de oito bits, use a ferramenta Linha Segmentada para traçar uma linha ao longo das trajetórias das partículas usando a mesma convenção direcional desejada para todos os filmes para que a polaridade seja consistente dentro e em todas as células que estão sendo estudadas. Clique duas vezes na ferramenta Linha para ajustar a largura da linha para combinar com a espessura da faixa e executar a macro Draw Kymo do plugin Kymo ToolBox usando uma largura de linha de 10. Um prompt pedindo para calibrar a imagem no tempo e no espaço aparecerá.Uma vez calibrados, os kymogramas serão gerados e podem ser salvos como arquivos TIFF. Para atribuir trajetórias de partículas, use a ferramenta Linha Segmentada para rastrear manualmente cada partícula no kymograph durante toda a duração da aquisição e usar o gerenciador de ROI para registrar cada trajetória de partícula como uma região de interesse. Salve todas as regiões de interesse por cada vídeo de lapso de tempo para análises adicionais e execute a macro Analyze Kymo do plugin Kymo ToolBox.Uma janela se abrirá pedindo para definir a direção externa do movimento de partículas a partir do núcleo da célula de interesse do menu suspenso. A velocidade limite deve ser definida de acordo com a sensibilidade do software para cada carga de interesse e a largura da linha deve ser ajustada para corresponder à espessura de cada trajetória de partículas. O Log All Data and Log Extrapolated Coordinates deve ser para o cálculo dos vários parâmetros de transporte de carga.Clique em Ok. Os dados calculados para as faixas individuais serão então agrupados por kymógrafo e salvos em arquivos de texto específicos para cada imagem. A combinação do tratamento arabinoside citosina com a estratégia de purificação baseada em agitação enriquece a pureza das culturas de astrócitos em relação aos protocolos tradicionais que incluem apenas o passo de purificação.A transfecção baseada em lipofecção permite a expressão transitória de proteínas em níveis ideais para imagens de células vivas sem causar toxicidade ou afetar a viabilidade dos astrócitos. Da mesma forma, o uso de uma sonda fluorescente permite a rotulagem rápida e eficiente de organelas endolysomais ácidas para o rastreamento da dinâmica organela e astrócitos. Os dados de lapso de tempo da imagem podem ser usados para gerar kymogramas que rastreiam o movimento de carga no tempo e no espaço.Nestes kymógrafos, o movimento anterograde da carga indicada é representado por trajetórias com encostas negativas, enquanto o movimento retrógrado é representado por trajetórias com encostas positivas. Vesículas estacionárias aparecem como trajetórias verticais. Nesta análise, a quantificação do fluxo de uma carga específica através de uma área do astrócito revelou diferenças no percentual de partículas modais entre cargas que são provavelmente representativas de sua motilidade de linha base normal na região do astrócito dentro do qual os filmes foram adquiridos.O mapeamento preciso da mudança na posição X, Y ao longo da escala de tempo total para cada partícula obtida a partir do kymograph também pode ser usado para avaliar outros parâmetros de movimento, como velocidade de carga e comprimento de execução. Como este protocolo requer culturas de astrócitos de alta qualidade e rotulagem eficiente de carga, o tempo de incubação do reagente de transfecção e o cronograma de aquisição devem ser ajustados para cada plasmídeo ou carga de interesse. Este protocolo pode ser modificado para caracterizar eventos de transporte em astrócitos em resposta a danos celulares, toxicidade, mutações patogênicas, atividade sináptica ou alterações no ambiente intra ou extracelular.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrevemos como medir perto da membrana e global a dinâmica do cálcio intracelular em astrócitos cultivados utilizando reflexão interna total e microscopia de epifluorescência.

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Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

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Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.

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Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

O pipeline descrito é projetado para a segmentação de conjuntos de dados de microscopia eletrônica maiores que gigabytes, para extrair morfologias de células inteiras. Uma vez que as células são reconstruídas em 3D, software personalizado projetado em torno de necessidades individuais pode ser usado para executar uma análise qualitativa e quantitativa diretamente em 3D, também usando a realidade virtual para superar a oclusão de visão.

Um método para reconstrução 3D e análise de realidade virtual de células gliais e neuronais

Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.

Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.

Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Este protocolo descreve métodos de seção, coloração e seções de tecido flutuante de imagem do cérebro do camundongo, seguido por uma descrição detalhada da análise do volume de território de astrócito e da sobreposição de território de astrócito.

Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa

Aprenda a técnica de imagem em células vivas para analisar o transporte intracelular de organelas em astrócitos murinos. Este método permite estudar dinâmicas de partículas em tempo real sob condições fisiológicas e patológicas.

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