Name: Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Aprenda a medir a respiração mitocondrial e glicólise em células progenitoras de células-tronco hematopoiéticas murinas. Este protocolo otimizado melhora a viabilidade celular e permite análises metabólicas precisas para estudos de hematopoiese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho é, em parte, apoiado pelo apoio financeiro dos Institutos Nacionais de Saúde (HL131645, CA016058), da Fundação St. Baldrick e da Fundação Pelotonia.

Este protocolo foi aprovado pelo Nationwide Children's Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC).
Nota: O protocolo é descrito em ordem cronológica que se estende ao longo do período de dois dias. Use novos reagentes, conforme descrito no protocolo abaixo.
1. Preparação de reagentes no dia anterior ao ensaio
<ol><li>
Hidrate o cartucho do sensor.
	<ol>
<li>Incubar 5 mL do calibrante(Tabela de Materiais)em uma incubadora não CO2 37 °C durante a noite.</li>
		<li>Abra o kit de ensaio de fluxo(Mesa de Materiais)e separe o cartucho de sensor (verde; superior) da placa de serviço público (transparente; inferior). Em seguida, coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo e adjacente à placa de serviço público.</li>
		<li>Usando água estéril, preencha os poços da placa de serviço público (200 μL) e as câmaras ao redor dos poços (400 μL).</li>
		<li>Submergir o cartucho do sensor na placa de serviço público certificando-se de que os sensores estão cobertos completamente pela água. Toque 3x para evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Coloque o cartucho submerso na placa de serviço público em uma incubadora não CO2 37 °C durante a noite. Para evitar a evaporação da água, certifique-se de que a incubadora é devidamente umidificada. Coloque um copo aberto contendo H2O como uma precaução extra ao lado da placa de cartucho-utilitário, especialmente se estiver usando um forno regular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare a placa de ensaio.
	<ol>
<li>Esterilizar a superfície do armário de biossegurança classe 2 usando 70% de etanol. Abra a placa de ensaio o capô.</li>
		<li>Adicione 40 μL de 0,01% (w/v) poli-L-lisina (PLL) solução para cada poço da placa de ensaio o capô.</li>
		<li>Cubra a placa de ensaio com a tampa fornecida no kit. Incubar a placa de ensaio fechado à temperatura ambiente (RT) o capô por 1 h. Nota: O objetivo da incubação é deixar pll revestimento da superfície da placa de ensaio para facilitar a adesão de células de suspensão para a superfície da placa de ensaio.</li>
		<li>Após 1 h de incubação da placa de ensaio, retire o excesso de solução com um aspirador estéril à base de vácuo e ar seque o poço o capô. Nota: Leva ~ 30-60 min para secar o ar os poços da placa de ensaio após a remoção pll excessiva usando o aspirador.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dia do Ensaio
<ol><li>Prepare o cartucho.
	<ol>
<li>Levante o cartucho do sensor. Coloque-o de cabeça para baixo na capa da cultura do tecido e descarte a água da placa de serviço público.</li>
		<li>Encha os poços de placas de serviço público com 200 μL do calibrante pré-aquecido.</li>
		<li>Encha as câmaras ao redor dos poços com 400 μL do calibrante.</li>
		<li>Submergir o cartucho do sensor na placa de serviço público, certificando-se de que os sensores estão cobertos completamente pelo calibrante. Toque 3x para evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Equilibre o cartucho de sensor submerso na placa de serviço público em uma incubadora não CO2 37 °C por 45 a 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Cspcs derivados da medula da urina.
	<ol>
<li>Para acomodar réplicas biológicas suficientes, planeje usar HSPCs derivados de um mouse por poço da placa de ensaio. Nota: Este método de colheita de medula óssea fornece ~ 50.000 a 80.000 LSK HSPCs de cada mouse. Este protocolo para medir o fluxo extracelular é otimizado para ~ 70.000 HSPCs LSK por poço de 96 bem-placa.</li>
		<li>Eutanásia ratos usando overdose de CO2 e luxação cervical, seguindo métodos aprovados pelo IACUC local.</li>
		<li>Esterilizar a superfície das ferramentas de dissecação e do banco usando 70% de etanol.</li>
		<li>Para cada rato, pré-preencher uma placa de Petri com soro fisiológico 1x fosfato-buffered (PBS) contendo 2% de calor inativado soro bovino fetal (FBS) na RT. Nota: Não use PBS pré-refrigerados, pois ele irá criar grupos nas seguintes etapas.</li>
		<li>Spray 70% etanol (v/v) em todo o rato eutanasiado. Isolar todos os ossos, incluindo membros superiores e inferiores, ossos do quadril, esterno, caixa torácica e coluna vertebral, do rato17,18. Retire a matéria branca da medula espinhal do rato, pois pode contaminar as células LSK. Coloque todos os ossos em 1x PBS (+ 2% FBS), como eles estão sendo coletados, em uma placa de Petri até novo uso.</li>
		<li>Inverter um tubo cônico de 50 mL (novo a cada vez) e usá-lo para triturar ossos submersos em 1x PBS (+ 2% FBS) na placa de Petri.</li>
		<li>Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, pipeta para cima e para baixo (~10x) para expulsar uniformemente as células dos ossos, depois de esmagar ossos.</li>
		<li>Coloque um filtro de célula de 40 μm em um tubo cônico de 50 mL. Pré-molhe a superfície do filtro, passando 1 mL de 1x PBS (+ 2% FBS).</li>
		<li>Harvest suspensão celular derivada da medula óssea do passo 2.2.7 e passá-la através da superfície pré-molhada do filtro celular para remover detritos ósseos.</li>
		<li>Repita os passos 2.2.6 a 2.2.9 até que todos os materiais ósseos ficam brancos como um marcador que a maioria das células da medula óssea são coletadas no tubo cônico de 50 mL. Nota: Muitas vezes leva dois tubos cônicos de 50 mL por mouse para coletar todas as células derivadas da medula óssea.</li>
		<li>Tubos cônicos centrífugas 50 mL contendo células derivadas de medula óssea por 5 min a 500 x g e RT.</li>
		<li>Retire o supernatant. Resuspender as células derivadas da medula óssea (combinar conteúdo de ambos os tubos de 50 mL) em 5 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) como um volume final e manter as células em RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Colher células mononucleadas de medula óssea murina.
	<ol>
<li>Adicione 5 mL de gradiente médio de densidade (ou seja, Ficoll) a um tubo cônico de 15 mL. Em seguida, adicione lentamente 5 mL da suspensão da célula da medula óssea. Certifique-se de que as células permanecem como uma camada acima do meio gradiente de densidade.</li>
		<li>Centrífuga por 30 min a 500 x g e RT. Não use um freio na centrífuga. Certifique-se de que a centrífuga esteja na menor aceleração possível (por exemplo, 1 aceleração e 0 desaceleração).</li>
		<li>Colha a interface média das células mononucleadas (cor branca) após a centrífuga em um tubo cônico fresco de 15 mL.</li>
		<li>Células lavadas, colhidas a partir de meio gradiente de densidade, com 5 mL de 1x PBS (+ 2% FBS). Centrífuga por 5 min a 500 x g e 4 °C. Retire o supernatant.</li>
		<li>Repita o passo 2.3.4.</li>
		<li>Resuspender o conteúdo celular do tubo em 300 μL de 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL de suspensão celular por controle não manchado ou de cor única em um tubo FACS.</li>
	</ol></li>
	<li>Colheita HSPCs LSK de células mononucleated murine medula óssea.
	<ol>
<li>Faça um coquetel de anticorpos biotina misturando 3 μL por amostra dos seguintes anticorpos: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Adicione 15 μL do coquetel de biotina-anticorpo a 300 μL de células mononucleadas de medula óssea. Nota: Cada anticorpo é usado em 1:100 diluição.</li>
		<li>Incubar células com o coquetel de biotina-anticorpo por 30 min a 4 °C com agitação para evitar que as células se aglutinem no fundo do tubo.</li>
		<li>Adicione 10 mL de 1x PBS pré-refrigerados (+ 2% FBS) a células misturadas com o coquetel de biotina-anticorpo.</li>
		<li>Centrífuga do tubo por 5 min a 500 x g e 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota celular em 400 μL de 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL para controle de cores simples de streptavidina.</li>
		<li>Microesferas antibiotina vórtice brevemente vórtices(Tabela de Materiais)antes do uso. Adicione 80 μL de microesferas a cada amostra de célula (de 400 μL). Misture bem e incubar para adicional 20 min em 4 °C, com agitação.</li>
		<li>Adicione 10 mL de 1x PBS pré-refrigerados (+ 2% FBS) às células. Centrífuga do tubo por 5 min a 500 x g e 4 °C.</li>
		<li>Descarte o supernatant e resuspenda a pelota de celular em 1 mL de 1x PBS (+ 2% FBS). Guarde a 4°C durante a criação da unidade de separação magnética.</li>
		<li>Coloque uma coluna(Tabela de Materiais)no campo magnético do separador de células assistidas magnéticas (MACS) a 4 °C. Prepare a coluna para a separação magnética enxaguando-a com 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) o fluxo de gravidade em 4 °C.</li>
		<li>Adicione a suspensão celular do passo 2.4.7 à coluna pré-molhada a 4 °C. Permita que as células passem pela coluna a 4 °C e coletem efluentes em um tubo cônico de 15 mL. Nota: A fração com células não rotuladas em tal efluente representa as células negativas de linhagem enriquecidas.</li>
		<li>Coluna de lavagem com 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) a 4 °C. Repita 3x. Colete o fluxo e mantê-lo em 4 °C. Conte as células viáveis eluted por exclusão azul trypan usando um hemocytometer.</li>
		<li>Centrífuga o tubo cônico de 15 mL contendo o fluxo para 5 min a 500 x g e 4 °C. Descarte o supernatant. Resuspender as células em 0,5 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) e transferir o conteúdo para um tubo FACS.</li>
		<li>Adicione 24 μL do coquetel de anticorpos LSK a cada 107 células. O coquetel de anticorpos contém concentração igual de anticorpos de 450 streptavidin, anticorpo PE-CY7-Sca1 e anticorpo APC-c-Kit.</li>
		<li>Incubar por 1 h a 4 °C com agitação o escuro (coberto com folha de estanho).</li>
		<li>Adicione 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) ao tubo FACS. Centrífuga por 5 min a 500 x g e 4 °C. Descarte o supernatant.</li>
		<li>Resuspender as células com rótulo de anticorpos em 1 mL de 1x PBS (+ 2% FBS). Adicione 1 μL de 1 mg/mL propidium iodeto à suspensão celular pouco antes da classificação.</li>
		<li>Filtrar o conteúdo do tubo FACS usando um filtro de 40 μm logo antes de classificar as células LSK.</li>
		<li>Coletar células LSK, via classificação FACS, em tubo de 1,5 mL contendo 0,5 mL de mídia completa complementada com glutamina de 2 mM, 3 mg/mL de glicose, 1 mM piruvate, 1x tromboietina (TPO), fator de células-tronco 1x (SCF), 0,5 x penicilina/estreptomicina (P/S), pH 7.4 (Tabela 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Respiração mitocondrial e ensaios de glicolíse de LSK HSPCs
<ol><li>
Semeades de LSK na placa do ensaio
	<ol>
<li>Células Centrífugas LSK do passo 2.4.17 para 5 min a 500 x g e RT. Descarte o supernatant.</li>
		<li>Resuspenda as células em completa mídia para uma concentração final de pelo menos 70.000 células/40 μL.</li>
		<li>Teor de sementes de 40 meios μL (contendo 70.000 células) na placa de 8 poços revestida de PLL do passo 1.2.4. Deixe todos os poços de canto vazios.</li>
		<li>Centrífuga por 1 min a 450 x g e RT. Não aplique o freio. Certifique-se de que as células estão ligadas ao fundo do poço usando o microscópio invertido.</li>
		<li>Adicione 135 μL de mídia completa para as células em cada poço para um volume final de 175 μL. Adicionar 175 μL de mídia completa para os 2 cantos da placa como espaços em branco.</li>
		<li>Incubar as células da incubadora não-CO2 por 2 h a 37 °C.</li>
		<li>Configure um programa para adicionar medicamentos a cada poço da placa de poço no analisador usando uma métrica descrita na Tabela 2 (teste de estresse mitocondrial) e na Tabela 3 (teste de estresse de glicolyse). NOTA: Enquanto as células estão incubando, ligue o instrumento e certifique-se que está em 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Teste de estresse mitocondrial
	<ol>
<li>Prepare 45 μM soluções de estoque de oligomicina, 50 μM carbonilcial cianeto 4-(trifluromethoxy) fenixizona (FCCP) e 25 μM soluções de estoque de rotenone / antimicina A. Para preparar a solução de estoque de oligomicina de 45 μM, dissolva o conteúdo da bolsa comercialmente disponível em 280 μL da mídia completa. Para preparar a solução de ações 50 μM FCCP, dissolva o conteúdo da bolsa disponível comercialmente em 288 μL da mídia completa. Para preparar 25 μM rotenone/antimicina Uma solução de ações, dissolva o conteúdo da bolsa disponível comercialmente em 216 μL da mídia completa.</li>
		<li>Tire o cartucho de sensor na placa de serviço público da incubadora e carregue suas portas (A, B e C) de modo que cada poço teria concentração final de 2 μM oligomicina, 1,5 μM FCCP e 0,5 μM de rotenone/antimicina A conforme necessário, seguindo métricas de diluição descritas na Tabela 4 (para taxa de consumo de oxigênio).</li>
		<li>Retire a tampa do cartucho do sensor montado na placa de serviço público e coloque-a na bandeja do instrumento. Iniciar a calibração que levará 20 min.</li>
		<li>Após a calibração, retire a placa de serviço público e substitua-a por placa de ensaio contendo células LSK, que agora são aderidas ao fundo do poço.</li>
		<li>Imprensa Continue a iniciar o programa descrito na Tabela 2. Após a conclusão do programa, recuperar os dados e analisá-los usando o software Wave Desktop. Nota: Os dados gerados a partir dos ensaios de fluxo extracelular podem ser traçados usando o gráfico de pontos do software Wave Desktop ou exportados para o programa de estatísticas baseado na web.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Teste de estresse de glicolyse
	<ol>
<li>Reconstituir glicose em 300 μL (100 mM), oligomicina em 288 μL (50 μM), glicose 2-D (2-DG) em 300 μL (500 mM) de mídia completa da bolsa comercialmente disponível.</li>
		<li>Delicadamente pipeto para cima e para baixo (~ 10x) para solubilizar os compostos. Vortex o 2-DG para aproximadamente 1 min para assegurar a dissolução apropriada em meios.</li>
		<li>Retire o cartucho do sensor da incubadora. Carregue portas A a C após métricas de diluição descritas na Tabela 5 para obter uma concentração final de 10 mm de glicose, 2 μM oligomicina e 50 mM 2-DG.</li>
		<li>Repita os passos 3.2.3 e 3.2.4.</li>
		<li>Imprensa Continue a iniciar o programa descrito na Tabela 3. Após a conclusão do programa, recuperar os dados e analisá-los usando o software Wave Desktop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, demonstramos o isolamento de uma quantidade máxima de população de HSPCs lspcs de urina pura e viável, bem como a medição de sua glicolíse e respiração mitocondrial com um analisador de fluxo extracelular. Especificamente, o protocolo supera as seguintes questões técnicas para o uso de LSK HSPCs : i) a baixa frequência de LSK HSPCs na medula óssea de urina14, ii) baixa atividade metabólica basal de LSK HSPCs26, iii) a fragilidade dos LSK HSPCs27</sup...

Uma vez que a vida útil da maioria dos glóbulos maduros é curta, a homeostase do sangue depende da auto-renovação e diferenciação de uma população de longa duração, mas rara de células-tronco hematopoiéticas (HSPCs)1. HSPCs são quiescentes, mas eles são rápidos a proliferar e sofrer diferenciação após a estimulação para sustentar as demandas do sistema sanguíneo. Como cada estado celular HSPC requer uma demanda bioenergética única, as mudanças metabólicas são os principais impulsionadores das decisões de destino HSPC. Portanto, a perda da plasticidade metabólica, alterando o equilíbrio entre quiescência, autorenovação e diferenciação de HSPCs, muitas vezes leva a distúrbios mielo ou linfoproliferativos. Juntos, a compreensão da regulação metabólica do desenvolvimento do HSPC é fundamental para descobrir mecanismos subjacentes malignidades hematológicas2,3,4,5.
A respiração mitocondrial e a glicolíse geram ATP para conduzir reações intracelulares e produzir os blocos de construção necessários para a síntese de macromoléculas. Como os HSPCs têm baixa massa mitocondrial em comparação com células diferenciadas6 e sustentam quiescência em nichos de medula óssea hipóxico, os HSPCs dependem principalmente de glicolíse. A ativação de HSPCs aumenta seu metabolismo mitocondrial que leva à perda de quiescência e sua subsequente entrada no ciclo celular. Tal plasticidade metabólica dos HSPCs permite a manutenção dapiscina HSPC ao longo da vida adulta6,7,8,9,10,11,12. Portanto, é fundamental investigar suas atividades metabólicas, como a taxa de consumo de oxigênio (OCR; índice de fosforilação oxidativa) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR; índice de glicolyse) para analisar a ativação do HSPC e o estado de saúde. Tanto o OCR quanto o ECAR podem ser medidos simultaneamente, em tempo real, usando um analisador de fluxo extracelular. No entanto, o método atual requer um grande número de células e é otimizado para células aderentes13. Uma vez que os HSPCs não podem ser isolados em grandes quantidades de camundongos14,exigem a classificação para obter uma população pura, são células não aderentes15,e não podem ser cultivadas durante a noite sem evitar a diferenciação16, tem sido difícil medir o OCR e o ECAR de HSPCs. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para acompanhar tutoriais baseados em vídeo sobre como medir a respiração metabólica e a glicolíse de poucos milhares de HSPCs de medula óssea de urinasca1+c-Kit+ (LSK).

<table><tbody><tr><td>0,01% (p/v) solução de poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>Usado para fixação LSK</td></tr><tr><td>40 &micro; filtro de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Usado para filtração celular após esmagamento ósseo</td></tr><tr><td>Anti-Biotina MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Usado para separação de linha</td></tr><tr><td>Biotina Rato Anti-Rato CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Usado para separação de</td></tr><tr><td>linha Biotina Rato Anti-Rato CD5 Clone 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>Usado para Lin- separação</td></tr><tr><td>Biotina Rato Anti-Rato CD8a Clone 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>Usado para Lin- separação</td></tr><tr><td>Biotina Rato Anti-Rato Ly-6G e Ly-6C Clone RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>Usado para Lin- separação</td></tr><tr><td>Biotina Rato Anti-Rato TER-119/Células Eritróides Clone TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>Usado para Lin- separação</td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) Anticorpo Monoclonal (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Usado para classificação LSK</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Usado no isolamento celular</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Usado no isolamento celular</td></tr><tr><td>Falcon Tubos de Polipropileno de Fundo Redondo</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>Usado para LSK classificando</td></tr><tr><td>Fetal bovino</td><td>Serum Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>Usado em FACS buffer</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>Usado para separação de gradiente de ficoll</td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Usado para os meios de ensaio</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Usado para separação de linha</td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Anticorpo (D7), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Usado para classificação LSK</td></tr><tr><td>Fator de células-tronco murinas (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>Usado para o meio de ensaio</td></tr><tr><td>Trombopoetina murina (TPO)</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>Usado para o meio de ensaio</td></tr><tr><td>PBS 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Usado para tampão FACS</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina ( 10.000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Usado para o meio de ensaio</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>Usado para classificação LSK Cavalo-marinho</td></tr><tr><td>Miniplaca de cultura de células XFp Agilent</td><td>Technologies</td><td>103025-100</td><td>Usado para semeadura LSK</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>Usado para o meio de ensaio</td></tr><tr><td>Estreptavidina eFluor 450 Conjugado</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>Usado para classificação LSK</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>Usado para equilíbrio de cartucho</td></tr><tr><td>Meios XF</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Usado para o meio de ensaio</td></tr><tr><td>Kit de teste de estresse de glicólise XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>Medicamentos para teste de estresse de glicólise</td></tr><tr><td>XFp Mitocondrial Drogas</td><td>do 103010100</td><td>das tecnologias de Agilent</td> do jogo do teste de esforço <td>para o teste de esforço mitocondrial</td></tr><tr>Tecnologias <td>103022-100</td> de<td>XFp</td><td>Agilent do</td> teste <td>usadas para a glicólise e o teste de esforço mitocondrial</td></tr></tbody></table>

análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) têm plasticidade metabólica distinta, o que lhes permite fazer a transição de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar as demandas da formação sanguínea. No entanto, tem sido difícil analisar o estado metabólico (respiração mitocondrial e glicolíse) dos HSPCs devido aos seus números limitados e à falta de protocolos otimizados para HSPCs frágeis não aderentes. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para medir a respiração metabólica (taxa de consumo de oxigênio; OCR) e glicolyse (taxa de acidificação extracelular; ECAR) de murine osso medula-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo fornece uma maior quantidade de HSPCs LSK da medula óssea da urina, melhora a viabilidade dos HSPCs durante a incubação, facilita análises de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece protocolos de injeção otimizados (concentração e tempo) para medicamentos que visam a fosforilação oxidativa e vias glicolíticas. Este método permite a previsão do estado metabólico e da saúde dos HSPCs durante o desenvolvimento do sangue e doenças.

Nosso método de extração nos permitiu colher até ~ 80.000 HSPCs LSK por mouse. A viabilidade e o número de células LSK foram melhorados com o nosso método, porque nós: (1) medula óssea combinada dos membros superiores e inferiores, ossos do quadril, esterno, caixa torácica e coluna vertebral(2) evitado o uso de tampão de lyse de células vermelhas que teria aumentado a morte celular e aaglomeração, (3) usou a separação média de gradiente de densidade de células mononucleadas, e (4) evitou o uso de tampão pré-refrigerado q...

As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.

Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Mudanças metabólicas nas células hematopoiéticas e progenitoras permitem que elas transitem de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar demandas de formação sanguínea. A alteração na plasticidade metabólica das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras leva a distúrbios hematológicos. Nosso protocolo ajudará a medir a regulação metabólica e a saúde das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras durante o desenvolvimento sanguíneo e doenças.A análise da respiração mitocondrial e da glicolise das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras é difícil, pois são frágeis e raras populações. Nosso protocolo otimizado permite o isolamento de uma maior quantidade de células hematopoiéticas de haste e progenitor da medula óssea murina, melhora sua viabilidade durante a incubação, facilita a análise de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece parâmetros de injeção otimizados para a segmentação de fábulas oxidativas, bem como vias glicólticas. Para iniciar este procedimento, encha os poços da placa de utilidade e as câmaras ao redor dos poços com água estéril.Submergir o cartucho do sensor na placa de utilidade, certificando-se de que os sensores estão completamente cobertos por água. Em seguida, coloque o cartucho submerso na placa de utilidade em uma incubadora não CO2 a 37 graus Celsius para incubar durante a noite. Em um gabinete de biossegurança classe II, adicione 40 microliters de solução 0,1%PLL disponível comercialmente para cada poço da placa de ensaio.Cubra a placa de ensaio com a tampa fornecida no kit e incubar a placa fechada em temperatura ambiente sob o capô por uma hora. Depois disso, use um aspirador à base de vácuo estéril para remover a solução em excesso e secar a placa sob o capô. Para colher células mononucleadas de medula óssea de murina, adicione cinco mililitros de gradiente de densidade médio a um tubo cônico de 15 mililitros.Adicione lentamente cinco mililitros da suspensão da célula de medula óssea certificando-se de que as células permaneçam como uma camada acima do meio gradiente de densidade. Centrifugar a 500 vezes g e à temperatura ambiente por 30 minutos certificando-se de que a centrífuga está na menor aceleração possível. Colher a interface média das células mononucleadas em um tubo fresco de 15 mililitros.Em seguida, lave as células com cinco mililitros de 1X PBS contendo 2% de FBS. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernascer e resuspenja as células em 300 microliters de 1X PBS contendo 2% de FBS.Em seguida, alíquota de 10 microliters da suspensão celular para controle não detido ou de cor única em um tubo FACS. Para colher LSK HSPCs de células mononucleadas de medula óssea murina, adicione 15 microliters de coquetel de anticorpos biotina a 300 microliters de células mononucleadas de medula óssea. Para colher LSK HSPCs de células mononucleadas de medula óssea murina, adicione 15 microliters de coquetel de anticorpos biotina a 300 microliters de células mononucleadas de medula óssea.Coloque os tubos em um balde de gelo posicionado sobre um shaker em uma geladeira para incubar a quatro graus Celsius com agitação por 30 minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS 1X pré-refrigerado contendo 2% de FBS às células. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernascer e resuspenque a pelota celular em 400 microliters de 1X PBS contendo 2% de FBS. Brevemente vórtice das microesferas anti-biotina antes do uso. Adicione 80 microliters das microesferas a cada amostra e misture bem.Incubar por mais 20 minutos a quatro graus Celsius com agitação. Depois disso, adicione 10 mililitros de PBS pré-refrigerados contendo 2% de FBS às células. Centrifugar o tubo a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em um mililitro de PBS contendo 2%FBS. Armazene a suspensão da célula a quatro graus Celsius durante a configuração da unidade de separação magnética. Coloque a coluna em um campo magnético para o separador de células assistidas magnéticas a quatro graus Celsius.Prepare a coluna para a separação magnética enxaguando-a com três mililitros de 1X PBS contendo 2% de FBS sob fluxo gravitacional a quatro graus Celsius. Adicione a suspensão da célula à coluna pré-úmida a quatro graus Celsius. Deixe que todas as células passem pela coluna a quatro graus Celsius e coletem o efluente em um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, lave a coluna com três mililitros de 1X PBS e 2%FBS a quatro graus Celsius. Repita esta lavagem três vezes. Pegue o fluxo e mantenha-o a quatro graus Celsius.Centrifugar o tubo cônico contendo o fluxo através de 500 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascimento e resuspenque as células em 0,5 mililitros de 1X PBS com 2%FBS e transfira a suspensão para um tubo FACS. Em seguida, adicione 24 microliters do coquetel de anticorpos LSK a cada 10 milhões de células.Cubra o tubo com papel alumínio e incubar no escuro a quatro graus Celsius com agitação por uma hora. Depois disso, adicione três mililitros de 1X PBS com 2% de FBS ao tubo FACS. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernascimento e resuspenque as células rotuladas por anticorpos em um mililitro de 1X PBS contendo 2% de FBS. Pouco antes da triagem, adicione um microliter de um miligrama por iodeto de propídio mililitro à suspensão da célula e use um coador de 40 micrômetros para filtrar o conteúdo do tubo FACS. Primeiro, centrifugar as células LSK coletadas a 500 vezes g e à temperatura ambiente por cinco minutos.Descarte o supernascer e resuspenque as células em mídia completa para uma concentração final de pelo menos 70.000 células por 40 microliters. Sementes 40 microliters desta suspensão celular nos poços de uma placa pll revestida de oito poços certificando-se de deixar todos os poços de canto vazios. Centrifugar a placa a 450 vezes g e à temperatura ambiente por um minuto.Use um microscópio invertido para garantir que as células estejam presas à parte inferior dos poços. Depois disso, adicione 135 microliters de mídia completa às células em cada poço, trazendo o volume final de cada poço para 175 microliters. Adicione 175 microliters de mídia completa aos dois cantos da placa como espaços em branco.Incubar as células em uma incubadora não co2 a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, configure um programa para que o analisador adicione drogas a cada poço da placa conforme descrito na tabela dois e na tabela três do protocolo de texto. Para o teste de estresse mitocondrial, recupere o cartucho de sensor na placa de utilidade da incubadora de tal forma que cada poço tenha uma concentração final de duas oligomicina micromolar, 1,5 micromolar FCCP e 0,5 micromolar de rotenona e anti-mícina A conforme necessário.Retire a tampa do cartucho do sensor e coloque-a na bandeja do instrumento. Inicie o processo de calibração que levará 20 minutos. Quando a calibração estiver completa, remova a placa de utilidade e substitua-a pela placa de ensaio contendo as células LSK.A imprensa continua a iniciar o programa previamente definido. Quando o programa estiver concluído, recupere os dados e analise-os. Neste estudo, uma quantidade máxima de HSPCs murine lsk viável são isoladas e seu metabolismo glicólise e mitocondrial é medido com um analisador de fluxo extracelular.Embora a análise de fluxo extracelular seja tradicionalmente usada para células aderentes, este método torna os HSPCs LSK aderentes aos poços revestidos de PLL que permitem a medição do fluxo extracelular e, portanto, a saúde metabólica dos HSPCs LSK. A fim de medir a respiração mitocondrial através da taxa de consumo de oxigênio e glicolise através da taxa de acidificação extracelular em condições basais e de estresse, drogas que interferem com a glicolise e respiração mitocondrial são injetadas sequencialmente. Como esperado, o nível basal da taxa de acidificação extracelular é maior para HSPCs LSK cultivados em mídia positiva de glicose e piruvato em comparação com aqueles cultivados em mídia negativa.A injeção com glicose não alterou a taxa de acidificação extracelular para as células cultivadas na mídia positiva, mas aumentou a glicólise das células em mídia negativa. No entanto, o nível basal dessas células ainda permaneceu menor no grupo positivo. A injeção com oligomicina ativou a glicolise em seu nível máximo no grupo positivo, mas não afetou o grupo negativo.A injeção com o analógico de glicose em 2-DG devolveu a taxa de acidificação extracelular a níveis não glicolíticos. Para o teste de estresse mitocondrial, a injeção de oligomicina hiperpolarizou a membrana mitocondrial impedindo mais bombeamento de prótons através dos complexos etc e, assim, reduzindo a taxa de respiração mitocondrial. A injeção de FCCP eleva a taxa de consumo de oxigênio ao máximo à medida que as células tentam recuperar o potencial da membrana mitocondrial.A injeção com dois outros inibidores da cadeia de transporte de elétrons faz com que a respiração mitocondrial pare completamente e, assim, a taxa de consumo de oxigênio reverteu para seu nível mínimo. Evite o uso de tampão de lise celular vermelha para o isolamento da célula mononuclear. Recomendamos a separação de gradiente ficoll para evitar a formação de aglomerados e reduzir a perda de LSK.Usando nosso método otimizado, podemos medir a respiração mitocondrial e a glicolise de células-tronco e progenitoras raras e frágeis e o estudo de sinais metabólicos regulam hematopoiese normal e maligna.

analysis-of-hematopoietic-stem-progenitor-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

Este protocolo fornece diretrizes passo a passo para a criação de experimentos competitivos de transplante de medula óssea de camundongos para estudar a função das células-tronco/progenitoras hematopoiéticas sem purificação prévia de células-tronco por classificação de células.

Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Aqui, apresentamos um protocolo para medir metabólitos de forma precisa e confiável em tipos celulares raros. Melhorias técnicas, incluindo um fluido de bainha modificado para a triagem celular e a geração de amostras em branco relevantes, permitem uma quantificação abrangente de metabolitos com uma entrada de apenas 5000 células por amostra.

Metabolômica direcionada em células primárias raras

Aprenda a medir a respiração mitocondrial e glicólise em células progenitoras de células-tronco hematopoiéticas murinas. Este protocolo otimizado melhora a viabilidade celular e permite análises metabólicas precisas para estudos de hematopoiese.

Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste

Explorar mais vídeos