Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

Assim, as culturas da mamografia fornecem um sistema motor facilmente acessível para estudar e dissecar aspectos importantes do normal nos comportamentos das células-tronco de mama do câncer, incluindo sua capacidade de se renovar e diferenciar. Nossa abordagem quantitativa visa a avaliação da taxa de crescimento das culturas da mamografia de forma objetiva, permitindo uma comparação direta de diferentes tipos e condições celulares. Para o primeiro teste, eu aconselharia manter um controle rigoroso sobre os tempos de incubação para evitar a digestão excessiva e garantir uma contagem precisa de células antes de cada revestimento.

Demonstrando o procedimento com Charolaise Bull estará Errico D'Elia, um técnico do meu laboratório. Depois de colher as quatro glândulas mammorias torácicas abdominais e inferiores de 5 a 30, camundongos fêmeas de 8 a 10 semanas, coloque até 20 glândulas por placa de petri de 100 milímetros em um volume mínimo de DPBS. Pique os tecidos em pedaços menores e adicione 10 mililitros de meio digestivo aos fragmentos.

Use uma pipeta sorológica de 25 mililitros para transferir os pedaços de tecido em um tubo cônico de 50 mililitros e selar o tubo com filme de parafina. Em seguida, incubar os fragmentos em uma rotadora a 0,03 X G durante 2 horas e meia a 37 graus e 5% de dióxido de carbono com umidade. No final da incubação, se todos os fragmentos puderem passar pela ponta da pipeta P1000, sedimente o chorume tecidual por centrifugação e decante cuidadosamente o sobrenante.

Suspenda a pelota em 3 mililitros de PBS e filtre o conteúdo do tubo sequencialmente através de um coador de células de 100, 170, 140 micrômetros em um novo tubo cônico, lavando cada coador com 2 mililitros de DPBS frescos após cada filtro. Pelotar as células por centrifugação e decantar a remas sobrenante suspendendo as células nos demais DPBS. Misture as células com um volume igual de tampão de potássio de cloreto de amônio e lise os glóbulos vermelhos no gelo por até 5 minutos.

Ao final da incubação, prendam a lise com 10 mililitros de DPBS e recolhem as células por centrifugação. Confirme a presença de uma pelota branca e suspenda a pelota em 1 a 5 mililitros de meio de mamografia para contagem. Em seguida, coloque as células em uma cultura não-tecidual tratada com ultra baixa aderência seis placas de poço a um 2 x 10 para as quintas células viáveis por mililitro de concentração média de mammosfera para uma incubação de 7 a 10 dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Ao final da cultura de 7 a 10 dias, recolham os mammosféricos primários de cada poço da placa de cultura celular e sedimente as mammosféricas por cetrifugação. Depois de decantar o supernaspe, use uma pipeta P200 com uma ponta filtrada para pipetizar as mammospheres aproximadamente 100 vezes. A geração de pacientes de células únicas é fundamental para a quantificação precisa da célula da mamografia para uma nova capacidade.

Inspecione visualmente a extensão da segregação e use o coador celular, se necessário. Re suspender as mammosferas desassociadas com 1 a 5 mililitros de meio de mamografia fresco para contagem e placa 2 X 10 para a quarta célula viável por mililitro em polihema revestido de alta adesão seis placas de bem para uma cultura de 5 a 7 dias. Então, depois de 5 a 7 dias, conte o número de esferas por poço.

No final de cada passagem, use uma câmera digital montada em um estereóscópio para escanear toda a superfície de todos os poços para imagem das esferas. Depois de salvar as imagens, como arquivos tif, importe as imagens do estereóscópio como uma sequência de imagem para ImageJ e defina a escala e o tipo de imagem para 8 bits. Duplique a pilha de imagens e selecione Subtrair o fundo da guia Processo.

Verifique o plano de fundo Light e as opções paraboloides deslizantes e clique em OK para processar todas as imagens da pilha. Selecione Ajustar e Limiar na guia Imagem e clique em aplicar. Uma janela pop-up aparecerá.

Selecione Padrão como o Método e a Luz como plano de fundo. Verifique o limiar de cálculo de cada caixa de imagem e clique em OK. Para processar todas as imagens na pilha, selecione Watershed e clique em Sim. Selecione Abrir e clique em Sim e selecione Erode e clique em Sim.

Em seguida, selecione Analisar partículas do menu Analisar e definir o limite de tamanho mínimo em 10.000 micrômetros ao quadrado e a Circularidade entre 0,50 e 1,00. Selecione a opção Ellipses no menu Drop Down Show e verifique Resumo, Excluir nas bordas e In situ Show. Em seguida, clique em OK para processar todas as imagens da pilha.

Para calcular a curva de crescimento cumulativa para cada passagem registre o número de células emplacadas e o número de células em esferas contadas por poço e calcule o tamanho da esfera no final de cada passagem. Infera o número de esferas banhadas, dividindo o número de células banhadas para cada passagem pelo tamanho da esfera calculada no final da passagem anterior. Calcule o número de célula cumulativa para cada poço por passagem e o número da esfera cumulativa para cada poço por passagem e plote os pontos de dados em uma escala semi-logarítmica.

Em seguida, uma linha de tendência exponencial para os pontos de dados e calcular o coeficiente de determinação para medir a bondade do ajuste. Em seguida, retratam a equação da linha de tendência como uma função exponencial natural para inferir a taxa de crescimento da cultura. Neste experimento, foram determinados os números de esfera e célula de cinco passagens consecutivas, para três experimentos independentes.

Aqui na célula cumulativa e os números da esfera por passagem são mostrados. Como observado a ativação do Myc, leva ao aumento das taxas de crescimento da esfera e das células. Pontos de tempo biológicos e relevantes podem ser selecionados para coleta de células ou para a realização de análise de expressão genética ou outros ativos funcionais para avaliar a diferenciação celular, migração e invasão.

Esta é uma abordagem simples e econômica com vários aplicativos. Por exemplo, pode ser usado na descoberta direta para medir os efeitos na proliferação de células-tronco do câncer e na auto-renovação.