Name: Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a quantificar a auto-renovação em culturas de mamoesfera murina usando células de glândulas mamárias de camundongos fêmeas. Este método permite avaliar taxas de crescimento celular de forma objetiva em pesquisa de câncer.

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Agradecemos a Bruno Amati pelo presente gentil do modelo de rato transgênico Rosa26-MycER. Este trabalho foi financiado por doações da WWCR, AIRC, ERC e do Ministério da Saúde italiano para P.G.P. T.V. e X.A. foram apoiados pela FIRC e A.S. por uma subvenção fuv.

Os procedimentos in vivo foram realizados de acordo com a diretiva da UE 2010/63 e após a aprovação do nosso comité de ética institucional (Organismo para o Bem-Estar Animal --OPBA) e do Ministério da Saúde italiano (IACUC Numbers 762/2015 e 537/2017).
1. Murine Mammary Gland Collection e Digestão
<ol><li>Para um experimento típico, sacrifique 8-10 semanas de idade ratos fêmeas virgens por inalação de CO2. Dependendo dos objetivos do experimento, use 5-30 camundongos. Coloque os ratos em placas de dissecação um capô. Use agulhas para esticar os membros dianteiros e lavar a pele do animal com etanol.</li>
	<li>Levante a pele com fórceps e realize uma incisão vertical a partir do nível da área pélvica e movendo-se até o colo do útero, deixando o peritônio intacto. Para evitar romper a pele ou o peritônio, use uma tesoura de borda redonda.</li>
	<li>Cuidadosamente separar a pele do corpo com movimentos suaves da tesoura através do eixo lateral do corpo.</li>
	<li>Uma vez que a pele é totalmente separada da área torácica e abdominal, realizar quatro incisões em todos os quatro membros do animal e fixar a pele com agulhas. Use a tesoura e fórceps para separar totalmente o corpo do animal da pele estendida.</li>
	<li>Use os fórceps para levantar suavemente as almofadas de gordura mamárias que agora estão totalmente expostas e cuidadosamente desafiá-los da pele com a ajuda da tesoura. Colete as glândulas mamárias torácicas e abdominais inferiores de cada rato e mergulhe-as na sostena tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS), em um tubo cônico de 50 mL. Recolher até 20 glândulas por tubo. Mantenha os tecidos no gelo. Nota: Se necessário, as glândulas podem permanecer no gelo durante a noite. Este é um ponto de parada seguro. As seguintes etapas devem ser executadas circunstâncias estéreis.</li>
	<li>Prepare e filtre o meio de digestão: o meio modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco complementado com glutamina de 2 mM, 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina, 200 u/ml colagem e 100 μg/mL hyaluronidase (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Transfira até 20 glândulas para uma placa de Petri de 100 mm e pique o tecido usando um bisturi ou tesoura curva. Evite transferir grandes volumes de DPBS para o prato.</li>
	<li>Adicione 10 mL de digestão média para cada placa de Petri e transferir o tecido picado para um tubo cônico de 50 mL, usando uma pipeta sorológica de 25 mL.</li>
	<li>Selar os tubos com parafilme e colocá-los em um rotador. Defina o rotador a uma velocidade baixa (0,03 x g)e incubar por 2,5 h a 37 °C em uma atmosfera úmida contendo 5% de CO2.</li>
	<li>Inspecione visualmente a suspensão antes de prosseguir para os próximos passos. Se grandes pedaços de tecido permanecerem não digeridos, prolongue a incubação a 37 °C por mais 30 min. Nota: Como alternativa, a digestão pode ser realizada durante a noite a 37 °C, 5% CO2, usando uma mistura de enzimas colanase/hialuronidase suave13.</li>
</ol>2. Isolamento de MECs primários de murine
<ol><li>Pare o rotador e retire os tubos da incubadora. Ajuste uma ponta P1000 na abertura de uma pipeta serológica de 5 mL. Se a suspensão passar pela ponta P1000, prossiga para os próximos passos. Caso contrário, prolongue a incubação a 37 °C por mais 30 min.</li>
	<li>Centrífuga a 100 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e resuspender a pelota de cada tubo em 3 mL de DPBS. Nota: A baixa velocidade de centrífuga permite a remoção de linfócitos e células de tecido adiposo. A manipulação suave é necessária para evitar desalojar a pelota nesta etapa.</li>
	<li>Filtrar a suspensão celular em cada tubo separadamente, usando 100, 70 e 40 filtros de células μm. Em cada etapa de filtragem, lave os filtros com 2 mL de DPBS antes de coletar a passagem. Nota: A partir deste ponto, as suspensões celulares podem ser agrupadas e processadas juntas.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e resuspender as células no volume restante de DPBS.</li>
	<li>Vá para o glóbulo vermelho (RBC) lyse adicionando um volume igual de amônio-cloreto-potássio (ACK) lysis buffer (ver Tabela de Materiais). Misture por pipetting e incubar no gelo por até 5 min.</li>
	<li>Adicione 10 mL de DPBS e centrífuga a 300 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e inspecionar visualmente a pelota. Se a pelota é branca, prossiga para o próximo passo. Caso contrário, repita o passo de lyse RBC (passo 2,5).</li>
	<li>Resuspenda a pelota celular em 1-5 mL de mídia mamosphere: mamária células epitelia média basal (MEBM), complementada com glutamina 2 mM, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina, 5 μg/mL insulina, 0,5 μg/mL hidrocortisona, 2% B27, 20 ng/mL epidérmica fator de crescimento (EGF), 20 ng/mL fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF) e 0,4 IU/mL heparin (ver tabela de materiais).</li>
</ol>3. Serial Mammosphere Re-revestimento
<ol><li>Para o estabelecimento de culturas mamosphere, placa as células em cultura não-tecidotratados (adesão ultra-baixa) 6-bem placas em uma densidade de 200.000 células viáveis / mL em mamosphere médio. Incubar as células por 7-10 dias a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Prepare e filtre a solução poli-HEMA de 1% em 95% de etanol (ver Tabela de Materiais). Casaco ultra-baixa adesão de 6 pratos de poço para as seguintes passagens, adicionando 400 μL de 1% de solução poli-HEMA por poço e permitindo que o etanol seque completamente. Para melhores resultados, repita o revestimento duas vezes. Nota: O uso de placas não revestidas durante a primeira passagem permite a remoção seletiva de fibroblastos da cultura.</li>
	<li>No final da cultura de 7 a 10 dias, recolher as mamoesferas primárias de todos os poços e centrífugas em 300 x g, por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Decantar cuidadosamente o supernatant e proceder à dissociação mecânica das mamoesferas usando uma pipeta P200 com dicas filtradas. Pipeta por aproximadamente 100 vezes e inspecionar visualmente a suspensão para a presença de grandes esferóides. Nota: Uma incubação curta (2-5 min) da pelota da esfera em um volume baixo (0.2-0.5 mL) do trypsin ou do Accutase em 37 °C, 5% CO2,pode ser usada para facilitar a dissociação mecânica. Prepare mammosphere médio fresco (passo 2.7) para o revestimento de cada passagem.</li>
	<li>Resuspenda em 1-5 mL de mammosphere fresco médio e contar as células viáveis. Se aplicável, divida as células em grupos de tratamento ou condições de cultura.</li>
	<li>Placa 20.000 células viáveis/mL em placas de adesão ultra-baixa revestidas de poli-HEMA de 6 poços e incubada a 37 °C, 5% CO2. Nota: Mammospheres atingir seu tamanho máximo dentro de 5-7 dias após o revestimento celular. Quando possível, distribua as células de cada amostra ou condição para vários poços para obter réplicas técnicas. A densidade de revestimento deve ser mantida baixa para evitar a agregação celular. Um máximo de 20.000 células/mL é recomendado para placas de 6 poços e 5.000 células/mL para placas de 24 poços.</li>
	<li>Após 5-7 dias, conte o número de esferas por poço. Isso pode ser feito manualmente, usando um microscópio equipado com uma lente de ampliação 10x ou usando análise de imagem digital (ver passo 4).</li>
	<li>Recolher as mamoesferas de cada poço separadamente e centrífuga em 300 x g, por 5 min em 4 °C.</li>
	<li>Decantar cuidadosamente o supernatant e proceder à dissociação mecânica das mamoesferas usando uma pipeta P200 com dicas filtradas. Pipeta por aproximadamente 100 vezes e inspecionar visualmente a suspensão para a presença de grandes esferóides.</li>
	<li>Resuspenda em 1 mL de mammosphere fresco médio e conte as células viáveis. Piscina as células de cada amostra ou condição e repita etapas 3.6-3.10. Registre o número de células banhadas e o número de esferas e células contadas por poço para cada passagem. Proceder à etapa 5 para o cálculo de crescimento cumulativo.</li>
</ol>4. Enumeração da esfera usando a análise digital da imagem (DIA)
<ol><li>No final de cada passagem, escaneie toda a superfície de todos os poços e adquira imagens das esferas usando uma câmera digital montada em um estereoscópio. Salve as imagens como arquivos .tif.</li>
	<li>Importe as imagens de estereoscópio como uma sequência de imagem usando o ImageJ14. Defina a escala e o tipo de imagem para 8 bits.</li>
	<li>Duplice a pilha de imagens e selecione Subtrair Background do processo de guia na barra do menu. Verifique as opções Fundo claro e deslizamento parabolide e clique no botão OK. Processe todas as imagens da pilha.</li>
	<li>Selecione ajustar e, em seguida, limite da imagem da guia da barra do menu. Ao clicar em Aplicar,uma janela de diálogo intitulada Converter Stack to Binary aparecerá. Selecione padrão como método e luz como pano de fundo. Verifique o limite de cálculo da caixa para cada imagem e clique no botão OK.</li>
	<li>Selecione sequencialmente os comandos Watershed, Abra e Corrmoa da lista Binária o processo de guia da barra de menu. Processe todas as imagens da pilha clicando no botão Sim da caixa de diálogo que aparece. Nota: Esses processos permitem a segmentação visual de objetos que tocam, suavizam objetos e remoção de pixels da borda dos objetos.</li>
	<li>Selecione a função Analisar partículas do menu Analise. Defina o limite de tamanho mínimo em 10.000 μm2 e circularidade entre 0,50 e 1,00. Selecione a opção Elipses do menu drop-down show. Verifique Resumo, Excluir nas bordas e In situ Show e clique no botão OK. Processe todas as imagens da pilha.</li>
	<li>Inspecione visualmente a correspondência das elipses com esferas e, se necessário, corrija a contagem de partículas em conformidade. Resuma as contagens de todos os quadros de cada poço para obter a contagem total de mamoesferas por poço.</li>
</ol>5. Cálculo da Curva de Crescimento Cumulativo
Nota: O número de mamoesferas contadas em cada poço no final de cada passagem (PN)reflete o número de células iniciando a mamoesfera semeadas no início do PN.
<ol><li>Para cada passagem (PN),registre o número de células banhadas e o número de células e esferas contadas por poço. Calcule o tamanho da esfera no final de cada passagem: tamanho da esfera PN (células / esfera) = células contadas PN / esferas contadas PN Nota: O tamanho da esfera em PN é uma medida do potencial proliferativo de cada célula iniciando mamosphere semeada em PN.</li>
	<li>Inferir o número de esferas banhadas dividindo o número de células banhadas para PN pelo tamanho da esfera calculado no final da passagem anterior (PN-1): esferas banhadas PN = células banhadas PN / esfera tamanho PN-1 Nota: Por convenção, o tamanho da esfera é assumido estável durante a primeira passagem da cultura (ou seja, esfera tamanho P0 = esfera tamanho P1). Se vários poços forem usados como réplicas técnicas, use o tamanho médio da esfera no PN-1 como denominador.</li>
	<li>Calcule o número cumulativo de células e esferas para cada poço por passagem: número acumulado PN = (contagem PN / banhado PN)X número cumulativoP-1. Nota: Por convenção, número cumulativo P0 = P1banhado. Se vários poços forem usados como réplicas técnicas, calcule o número cumulativo médio por amostra ou condição para cada passagem.</li>
	<li>Trace os pontos de dados em uma escala semilogarítica. Exibir o número de passagem (P0 a PN)no eixo x (escala linear) e o número cumulativo de células ou esferas no eixo y (escala logarítica).</li>
	<li>Ajuste uma tendência exponencial-linha aos pontos de dados e calcule o coeficiente da determinação (R2)para medir o goodness do ajuste. Nota: A linha de tendência instalada nos pontos de dados deve aproximar-se de uma curva exponencial, como esperado para uma população celular que cresce ou morre com uma taxa constante. R2 leva valores entre 0 e 1, com valores mais próximos de 1 indicando um melhor ajuste.</li>
	<li>Retratam a equação da linha de tendência como uma função exponencial natural para inferir a taxa de crescimento (GR) da cultura: y = y0 e(GR) x, onde y0 é o valor de y quando x = 0.</li>
</ol>

<ol><li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage+and+time+dictate+the+fate+of+Wnt%2Fbeta-catenin-responsive+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).</li>
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<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
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<li>Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+assay+from+human+breast+cancer+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+sphere+culture+cannot+maintain+a+high+ratio+of+cancer+stem+cells%3A+a+mathematical+model+and+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+of+Somatic+Stem+Cells+by+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, descrevemos um protocolo para a descrição quantitativa das propriedades de crescimento do MaSC in vitro. Como exemplo, apresentamos o efeito da expressão míctica constitutiva de baixo nível nos MaSCs normais de urina. Esta abordagem, no entanto, pode ser igualmente aplicada a vários contextos. As células primárias humanas ou murine, bem como linhas celulares estabelecidas, podem ser cultivadas em condições independentes de ancoragem para estabelecer culturas mamoesferas que podem ser seriamente passagens. A superexpressão gênica e a interferência de RNA podem ser facilmente introduzidas no protocolo com a adição de um passo de transdução viral no final da primeira passagem (após o passo 3.5). Alternativamente, as células podem ser infectadas em adesão e, em seguida, banhadas como mamoesferas.
Um aspecto crítico do ensaio apresentado aqui é a densidade celular de semeadura, que deve ser baixa o suficiente para evitar a geração de agregados interferindo com a interpretação dos resultados16,17. A morfologia das mamoesferas pode ser informativa para resolver essa ambiguidade. Apenas esferas compactas e redondas devem ser enumeradas no final de cada passagem. Tanto a circularidade dos esferóides como o tamanho devem ser levados em consideração. Utilizando o processo automatizado do DIA, esta etapa é assegurada com os limites adequados de forma objetiva e absoluta. Muitas vezes, os progenitores formarão estruturas acinares ou pequenos aglomerados de células que devem ser excluídos das contagens da mamosfera. Como regra geral, usamos um limiar de 100 μm de diâmetro. Finalmente, deve ser tomado cuidado para evitar a transferência de mammopsheres intactos ou não totalmente dissociados de uma passagem para a próxima. Por outro lado, o excesso de tubulação levará ao aumento da morte celular. Assim, se tais dificuldades forem encontradas, recomendamos o uso de trippsinização leve ou tratamento accutase e passar as esferas dissociadas através de um filtro de 40 μm para garantir a geração de suspensões unicelulares.
A eficiência de formação de esferas (SFE) tem sido usada alternativamente, como substituto da quantidade SC ou CSC ex vivo em culturas mamosphere. SFE é de fato uma medida de células-tronco como em uma determinada população celular. No entanto, representa uma abordagem menos consciente, uma vez que fornece informações apenas em pontos distintos do tempo. O cálculo dos números da esfera cumulativa e a geração de curvas cumulativas de crescimento, em vez disso, possibilita a inferência da taxa de crescimento da cultura a partir do passo inicial de semeadura celular até que a cultura esgote ou, no caso de culturas imortalizadas, para o número desejado de passagens. A avaliação das propriedades de crescimento permite a avaliação do desvio do crescimento exponencial através do coeficiente R2 e, em uma segunda etapa, a avaliação do próprio valor gr.
Importante, curvas cumulativas do crescimento da mammosphere podem ser usadas para avaliar o efeito de inibidores pequenos da molécula ou de outras drogas quimioterápicas seletivamente no nível6,11de CSC. Ao contrário das mamoesferas primárias normais, que funcionalmente esgotam em 5-7 passagens, as mamoesferas tumorais tendem a se expandir indefinidamente. Esse recurso está vinculado à capacidade ilimitada de autorenovação do CSC. Os efeitos sobre a proliferação e a auto-renovação do CSC podem ser dissociados através da geração de curvas de crescimento de células tumorais e mamoesferas, respectivamente. Espera-se que um efeito específico do CSC resulte em uma diminuição da taxa cumulativa de crescimento da mamoesfera, com ou sem efeito sobre a taxa de crescimento cumulativo das células6,11.
Finalmente, outra área de interesse é a do tecido adulto SC reprogramação. Mammospheres totalmente crescidos consistem em uma população de células fenotipicamente heterogêneas, em que apenas uma pequena fração retém características semelhantes às de tronco, incluindo a capacidade de iniciação da mamoesfera e regeneração da glândula mamária após o transplante in vivo6,9,11,18,19. Os progenitores mammary podem ser isolados assim usando ensaios in vitro da etiqueta-retenção6,9,11 ou, ex vivo, usando marcadores de superfície estabelecidos2,3. Notavelmente, progenitores mamárias não sobrevivem à anôikis e são incapazes de formar mamoesferas. A expressão forçada de Myc foi mostrada conferir o potencial da iniciação do mammosphere aos progenitores mammary isolados como PKHneg11,tendo por resultado a geração de uma cultura que possa ser passagem indefinidamente. Da mesma forma, a interferência de reguladores negativos da reprogramação fisiológica pode ser testada usando o mesmo ensaio. Neste contexto, um problema comum que pode surgir é o número limitado de entrada celular. Se a entrada da célula for inferior a 10.000 células, recomendamos a semeadura em placas de 24 poços (no máximo 5.000 células viáveis/mL). No entanto, as condições de cultura independente de ancoragem podem ser provadas como muito duras para marcar a reprogramação, especialmente nos casos em que o efeito de reprogramação não é imediato. Nesses casos, o uso de uma matriz de suporte e culturas organóides tridimensionais poderia ser mais apropriado20.
No geral, o ensaio mammosphere é uma opção rentável que pode ser facilmente empregado para marcar propriedades semelhantes a caules em populações mec normais e tumorais. A abordagem quantitativa tomada neste protocolo facilita as comparações entre culturas realizadas em diferentes condições ou expostas a diversos estímulos. Quando seguido rigorosamente, ele fornece um sistema de modelo ex vivo relativamente simples que permite a desacoplamento dos múltiplos jogadores que definem propriedades de haste in vivo, oferecendo a possibilidade de estudos mecanicistas mais detalhados.

O isolamento e a cultura in vitro das células-tronco e progenitoras epiteliais mamárias tornaram-se essenciais para a compreensão de suas propriedades na biologia celular mamária. O rastreamento de linhagem elegante e os ensaios de transplante em série permitiram o estudo de células-tronco (SCs) e outros subconjuntos de tecidos no contexto de seu nicho in vivo. No entanto, essa abordagem é demorada e requer a geração de modelos de mouse repórter1,2,3,4,5. Portanto, a cultura in vitro e a propagação de células-tronco mamárias (MaSCs), poupando características fundamentais de caule, ou seja, capacidade de auto-renovação e diferenciação, é um dos maiores desafios no campo. Nos últimos anos, o ensaio mammosphere tem sido amplamente utilizado para modelar tanto o tecido mamato normal e o crescimento do câncer de mama, para quantificar SCs normais ou câncer (CSCs) e avaliar a sua capacidade de auto-renovação como um repórter substituto de sua atividade em seu respectivo contexto in vivo6,7,8,9,10,11.
O ensaio mammosphere é uma abordagem eficiente e rentável, na qual as células epiteliais mamárias recém-isoladas (MECs) são cultivadas em condições não aderentes, com a premissa de que apenas os MaSCs sobreviverão e formarão esferas em suspensão, enquanto todos os outros tipos de células morrerão por anoikis. Além disso, a capacidade de formar várias gerações de mamoesferas em passagens não aderentes em série está relacionada à capacidade de auto-renovação dos MaSCs6,9,11. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado de um ensaio quantitativo mammosphere, que foi inicialmente desenvolvido por Dontu e colegas7 como uma modificação do ensaio pioneiro neurosfera12, permitindo o crescimento de SCs putativos em condições não-aderentes, livre de soro com a adição de fatores de crescimento adequados7,12.

<table><tbody><tr><td>Tampão de lise ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Bufer de lise de cloreto de amônio-potássio, 100 mL.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 suplemento 50X (10 mL). Concentração final 2% v/v.</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Fator de crescimento de fibroblastos recombinantes humanos - básico, 50 &mu;g. Solução de estoque 100 &mu; g/&mu; L em Tris 5 mM pH 7,6. Diluição final 0,02% v/v.</td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Colgenase de Clostridium histolyticum. Tipo I-A, pó liofilizado, 1 g. Estoque 20.000 U/mL em DMEM. Diluição final 1% v/v.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td>Dulbecco modificado Eagle's medium</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Microgem</td><td>S17859L0615</td><td>Dulbecco's fosfato tamponado solução salina</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-Bio</td><td>AF-100-15</td><td>Fator de crescimento epitelial humano recombinante. Solução de estoque 100 &mu; g/mL em dH2O. Estéril Diluição final 0,02% v/v.</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>L-Glutamina, 200 mM. Diluição final 1% v/v.</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>PharmaTex</td><td>34692032</td><td>Concentração de estoque 5.000 UI/mL. Diluição final 0,008% v/v.</td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Tipo IV-S, pó, 750-3.000 U / mg sólido, 30 mg. Solução de estoque 10 mg / mL em dH2O. Estéril Diluição final 1% v / v.</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Concentração de estoque 100 &mu; g/mL. Diluição final 0,5% v/v.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>SAFCBiosciences</td><td>91077C</td><td>Insulina humana recombinante, pó seco, 250 mg. Concentração de estoque 1 mg/mL. Diluição final 0,5% v/v.</td></tr><tr><td>Placas de 6 poços de fixação baixa</td><td>Corning</td><td>351146</td><td>Placas de cultura de células estéreis de 6 poços não tratadas com fundo plano transparente e tampa.</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>Crescimento de células epiteliais mamárias meio basal</td></tr><tr><td>Mistura Penicllin-Streptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>Contém 10.000 U de penicilina potássica e 10.000 &micro; g de sulfato de estreptomicina por mL em soro fisiológico a 0,85%. Diluição final 1% v/v.</td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>Dissolver em 95% de EtOH durante a noite a 55 °C. Concentração de estoque 12% p / v. Diluição final 1% v / v em 95% de EtOH. Filtrar (0,22 &mu; m) antes do uso.</td></tr></tbody></table>

quantificação da auto-renovação em culturas murine mammosphere

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

A glândula mamária é caracterizada por uma extensa capacidade de regeneração, uma vez que passa por enormes alterações hormonais ao longo do ciclo de vida de uma fêmea. O papel das células-tronco mamárias (MaSCs) é amplamente estudado tanto no contexto fisiológico/desenvolvimentico quanto no que diz respeito à carcinogênese mamária. Nesse aspecto, os estudos ex vivo focados em propriedades do MaSC são muito procurados. As culturas mammosphere representam um substituto da formação de órgãos e tornaram-se uma ferramenta valiosa para pesquisas básicas e translacionais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração de culturas mamoesferas primárias murina e a quantidade de propriedades de crescimento do MaSC. O protocolo inclui coleta e digestão de glândulas mamárias, isolamento das células epiteliais mamárias primárias (MECs), estabelecimento de culturas primárias de mamoesfera, passaging em série, quantidade de parâmetros de crescimento da mamosphere e interpretação dos resultados. Como exemplo, apresentamos o efeito da expressão de micmy constitutiva de baixo nível sobre mecs normais, levando a uma maior auto-renovação e proliferação.

Myc superexpressão em MECs normais, leva a um aumento da freqüência de células iniciando mamoesferas. Isto é conseguido através de um mecanismo duplo: Myc aumenta a taxa de divisões simétricas MaSC e a freqüência de reprogramação de progenitores em novos MaSCs11. Para testar o efeito da baixa expressão constitutiva de Myc, usamos o modelo de camundongo transgênico Rosa26-MycER, no qual a atividade myc pode ser induzida por 4-hidroxitamoxifen (4-OHT)15. Primeiro chapeado os MECs em placas de adesão ultra-baixa de 6 poços para remover fibroblastos, na ausência de 4-OHT. Após a primeira passagem, dividimos a cultura em dois: dois poços foram mantidos sem tratamento (controle) e dois poços foram tratados com 200 nM 4-OHT (MycER). Contamos a esfera e o número de células de 5 passagens consecutivas para três experimentos independentes(Tabela 1). Os números cumulativos de células e esferas por passagem são mostrados na Tabela 2. A indução com 4-OHT leva ao aumento da esfera e das taxas de crescimento celular, como mostrado na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> Figura 1: Resultados representativos. Esfera cumulativa (A)e células (B)curvas de crescimento de controle e mammospheres MycER. O desvio médio e padrão de 3 experiências independentes é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">1 o revestimento</td>
			<td colspan="3">2º revestimento</td>
			<td colspan="3">3º revestimento</td>
			<td colspan="3">4º revestimento</td>
			<td colspan="3">5o revestimento</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Células banhadas</td>
			<td>Contagem celular</td>
			<td>Contagem da esfera</td>
			<td>Células banhadas</td>
			<td>Contagem celular</td>
			<td>Contagem da esfera</td>
			<td>Células banhadas</td>
			<td>Contagem celular</td>
			<td>Contagem da esfera</td>
			<td>Células banhadas</td>
			<td>Contagem celular</td>
			<td>Contagem da esfera</td>
			<td>Células banhadas</td>
			<td>Contagem celular</td>
			<td>Contagem da esfera</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp1 Exp1</td>
			<td rowspan="2">Controle</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp2 Exp2</td>
			<td rowspan="2">Controle</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp3 Exp3</td>
			<td rowspan="2">Controle</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Números de esferas contadas e números de células banhadas e contadas em cada passagem.
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> Tabela 2: Cálculo de números de esferas banhadas e números cumulativos de esferas e celulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela. (Clique direito para download.)</a>

Aqui, descrevemos a implementação e interpretação dos resultados de um ensaio quantitativo de auto-renovação in vitro mammosphere.

Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Assim, as culturas da mamografia fornecem um sistema motor facilmente acessível para estudar e dissecar aspectos importantes do normal nos comportamentos das células-tronco de mama do câncer, incluindo sua capacidade de se renovar e diferenciar. Nossa abordagem quantitativa visa a avaliação da taxa de crescimento das culturas da mamografia de forma objetiva, permitindo uma comparação direta de diferentes tipos e condições celulares. Para o primeiro teste, eu aconselharia manter um controle rigoroso sobre os tempos de incubação para evitar a digestão excessiva e garantir uma contagem precisa de células antes de cada revestimento.Demonstrando o procedimento com Charolaise Bull estará Errico D'Elia, um técnico do meu laboratório. Depois de colher as quatro glândulas mammorias torácicas abdominais e inferiores de 5 a 30, camundongos fêmeas de 8 a 10 semanas, coloque até 20 glândulas por placa de petri de 100 milímetros em um volume mínimo de DPBS. Pique os tecidos em pedaços menores e adicione 10 mililitros de meio digestivo aos fragmentos.Use uma pipeta sorológica de 25 mililitros para transferir os pedaços de tecido em um tubo cônico de 50 mililitros e selar o tubo com filme de parafina. Em seguida, incubar os fragmentos em uma rotadora a 0,03 X G durante 2 horas e meia a 37 graus e 5% de dióxido de carbono com umidade. No final da incubação, se todos os fragmentos puderem passar pela ponta da pipeta P1000, sedimente o chorume tecidual por centrifugação e decante cuidadosamente o sobrenante.Suspenda a pelota em 3 mililitros de PBS e filtre o conteúdo do tubo sequencialmente através de um coador de células de 100, 170, 140 micrômetros em um novo tubo cônico, lavando cada coador com 2 mililitros de DPBS frescos após cada filtro. Pelotar as células por centrifugação e decantar a remas sobrenante suspendendo as células nos demais DPBS. Misture as células com um volume igual de tampão de potássio de cloreto de amônio e lise os glóbulos vermelhos no gelo por até 5 minutos.Ao final da incubação, prendam a lise com 10 mililitros de DPBS e recolhem as células por centrifugação. Confirme a presença de uma pelota branca e suspenda a pelota em 1 a 5 mililitros de meio de mamografia para contagem. Em seguida, coloque as células em uma cultura não-tecidual tratada com ultra baixa aderência seis placas de poço a um 2 x 10 para as quintas células viáveis por mililitro de concentração média de mammosfera para uma incubação de 7 a 10 dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Ao final da cultura de 7 a 10 dias, recolham os mammosféricos primários de cada poço da placa de cultura celular e sedimente as mammosféricas por cetrifugação. Depois de decantar o supernaspe, use uma pipeta P200 com uma ponta filtrada para pipetizar as mammospheres aproximadamente 100 vezes. A geração de pacientes de células únicas é fundamental para a quantificação precisa da célula da mamografia para uma nova capacidade.Inspecione visualmente a extensão da segregação e use o coador celular, se necessário. Re suspender as mammosferas desassociadas com 1 a 5 mililitros de meio de mamografia fresco para contagem e placa 2 X 10 para a quarta célula viável por mililitro em polihema revestido de alta adesão seis placas de bem para uma cultura de 5 a 7 dias. Então, depois de 5 a 7 dias, conte o número de esferas por poço.No final de cada passagem, use uma câmera digital montada em um estereóscópio para escanear toda a superfície de todos os poços para imagem das esferas. Depois de salvar as imagens, como arquivos tif, importe as imagens do estereóscópio como uma sequência de imagem para ImageJ e defina a escala e o tipo de imagem para 8 bits. Duplique a pilha de imagens e selecione Subtrair o fundo da guia Processo.Verifique o plano de fundo Light e as opções paraboloides deslizantes e clique em OK para processar todas as imagens da pilha. Selecione Ajustar e Limiar na guia Imagem e clique em aplicar. Uma janela pop-up aparecerá.Selecione Padrão como o Método e a Luz como plano de fundo. Verifique o limiar de cálculo de cada caixa de imagem e clique em OK. Para processar todas as imagens na pilha, selecione Watershed e clique em Sim. Selecione Abrir e clique em Sim e selecione Erode e clique em Sim.Em seguida, selecione Analisar partículas do menu Analisar e definir o limite de tamanho mínimo em 10.000 micrômetros ao quadrado e a Circularidade entre 0,50 e 1,00. Selecione a opção Ellipses no menu Drop Down Show e verifique Resumo, Excluir nas bordas e In situ Show. Em seguida, clique em OK para processar todas as imagens da pilha.Para calcular a curva de crescimento cumulativa para cada passagem registre o número de células emplacadas e o número de células em esferas contadas por poço e calcule o tamanho da esfera no final de cada passagem. Infera o número de esferas banhadas, dividindo o número de células banhadas para cada passagem pelo tamanho da esfera calculada no final da passagem anterior. Calcule o número de célula cumulativa para cada poço por passagem e o número da esfera cumulativa para cada poço por passagem e plote os pontos de dados em uma escala semi-logarítmica.Em seguida, uma linha de tendência exponencial para os pontos de dados e calcular o coeficiente de determinação para medir a bondade do ajuste. Em seguida, retratam a equação da linha de tendência como uma função exponencial natural para inferir a taxa de crescimento da cultura. Neste experimento, foram determinados os números de esfera e célula de cinco passagens consecutivas, para três experimentos independentes.Aqui na célula cumulativa e os números da esfera por passagem são mostrados. Como observado a ativação do Myc, leva ao aumento das taxas de crescimento da esfera e das células. Pontos de tempo biológicos e relevantes podem ser selecionados para coleta de células ou para a realização de análise de expressão genética ou outros ativos funcionais para avaliar a diferenciação celular, migração e invasão.Esta é uma abordagem simples e econômica com vários aplicativos. Por exemplo, pode ser usado na descoberta direta para medir os efeitos na proliferação de células-tronco do câncer e na auto-renovação.

quantification-of-self-renewal-in-murine-mammosphere-cultures

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

HC11 lactogênica diferenciação pode ser caracterizada pela formação de estruturas de cúpula referido como mammospheres. As estruturas podem ser enumerados por microscopia de contraste de fase para ajudar a quantificar a diferenciação lactogênese.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

Este vídeo descreve o isolamento de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de câncer de mama. Cultivamos essas células-tronco cancerígenas para gerar mamosferas primárias para avaliar a auto-renovação e calcular a eficiência de formação de esferas, permitindo a comparação entre diferentes densidades de semeadura.

Geração de Mamosferas Primárias: Uma Técnica para Determinar a Potência Celular

Um método para processar o material de descarte mamária humana cirúrgico é descrito. Tecido transformado, sob a forma de Organóides, podem ser armazenadas congeladas indefinidamente ou colocadas em cultura para crescimento a longo prazo. Este método permite a análise experimental da biologia celular epitelial humana normal, e os efeitos das perturbações exógenas.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por&gt; 6 meses.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Os ensaios de mamosfera flutuante podem investigar o subconjunto de células-tronco de câncer de mama que sobrevivem em condições de suspensão e mostram tumorigênese aumentada quando implantadas em camundongos.  Este protocolo fornece uma medida in vitro conveniente da capacidade de formação de esferas, um proxy para a tumorigênese in vivo, ao mesmo tempo em que facilita a análise da paisagem transcricional associada ao tronco.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Disponibilidade de SCs somáticas é crucial para a medicina regenerativa, modelagem de doença e para ganhar a introspecção em Propriedades de SC. Aqui nós apresentamos estratégias experimentais para reprogramar, em vitro, células adultas diferenciadas em suas células tronco/progenitoras expansível do tecido-específica correspondente pela expressão transiente do único ativador transcricional co YAP.

De Novo Geração de células-tronco somáticas por YAP/TAZ

Um sistema de modelo in vitro foi desenvolvido para capturar alterações arquitetônicas teciduais durante a progressão do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) em uma cocultura tridimensional (3D) com fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Este sistema organóide fornece uma plataforma única para investigar os papéis de diversas alterações tumorais intrínsecas e extrínsecas que modulam o fenótipo tumoral.

Sistema de Cocultura Multidimensional para Modelar Progressão do Carcinoma Escamoso Pulmonar

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Este protocolo fornece ferramentas in vitro experimentais para avaliar a transformação das células mamárias humanas. São descritas etapas detalhadas para a taxa de proliferação celular de acompanhamento, capacidade de crescimento independente de ancoragem e distribuição de linhagens celulares em culturas 3D com matriz de membrana de porão.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Este protocolo descreve o método para configurar o ensaio de formação da mamosfera para estudar a estano do câncer induzida pelo Inibidor da Apoptose 5 (Api5) em células epiteliais mamárias não tumorigênicas. Lisados coletados de mamosferas de geração primária são analisados para diferentes marcadores de caule para avaliar a indução de propriedades semelhantes às células-tronco.

Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas

Aprenda a quantificar a auto-renovação em culturas de mamoesfera murina usando células de glândulas mamárias de camundongos fêmeas. Este método permite avaliar taxas de crescimento celular de forma objetiva em pesquisa de câncer.

Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

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