Name: Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a caracterizar os efeitos de inibidores migrastáticos na invasão de esferoides tumorais 3D usando microscopia confocal de alta resolução. Este método permite avaliar a eficácia de drogas em modelos de glioma.

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Gostaríamos de agradecer ao professor Chris Jones por contribuir com a linha celular KNS42. O microscópio confocal de Zeiss LSM880 com AiryScan usado neste trabalho é parte do projeto da inovação e da incubação de Huddersfield (HIIP) financiado com o negócio de crescimento da parceria empresarial da região da cidade de Leeds (LEP). Crédito para a imagem do microscópio Figura 3: microscopia de Carl Zeiss GmbH, Microscopy@zeiss.com.

1. geração de spheroids da pilha
Dia 1
<ol><li>Prepare o meio de cultura padrão conforme exigido pela linha de célula investigação.</li>
	<li>Realize todas as etapas associadas à cultura tecidual em uma capa de cultura tecidual usando técnicas de manuseio estéril.</li>
	<li>Trypsinize e contagem de células cancerosas. Use 20 mL de suspensão celular por placa. Mantenha as suspensões da pilha em tubos universais estéreis claramente etiquetados.</li>
	<li>Adicione um número predeterminado de células a cada poço. Tanto o número inicial de células quanto o tamanho de esferóide final exigido dependem da taxa de proliferação da linha celular que está sendo investigada. Nota: Para linhas celulares de glioma estabelecidas como U251 e KNS429,10, 5 x 103 células/ml produzirá um esferóide microscopicamente visível (200 ou 800 μm) após 4 dias de incubação.</li>
	<li>Ressuscitar as células em tubos universais por inversão suave para evitar aglutina celular. Pipete 200 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Se todos os poços não são exigidos, é aconselhável adicionar 200 μL de 1X PBS a cada poço vazio para evitar a evaporação.</li>
	<li>Incubar as células em uma incubadora como normal em 37 ° c. Nota: As linhas celulares, como linhas de células de câncer de glioma, formarão esferóides dentro de 24 h. permita que a arquitetura celular 3D se forme incubando o esferoide por 72 h.</li>
</ol>Dia 2
<ol start="7"><li>Verifique as células por microscopia de campo brilhante após 24 h. dependendo da linha celular, as células podem ter formado um esferóide detectável na parte inferior do poço. Nota: Linhas de células de câncer de glioma estabelecidas prontamente formam esferóides dentro de 24 h. as linhas celulares de câncer de glioma derivado do paciente podem levar até 1-2 semanas.</li>
</ol>2. ensaio de invasão de colágeno
Dia 3
<ol><li>Coloc o colagénio, meio de cultura 5x, 1 M NaOH, e 1 20 mL de tubo no gelo.</li>
	<li>Cuidadosamente e lentamente adicionar 10,4 mL de colágeno frio em um tubo de cultura refrigerada. Evite bolhas. Esta quantidade de colágeno é suficiente para 1 96-bem placa. O upscaling é possível, mas recomenda-se que o tubo de 1 20 mL por a placa esteja preparado em um momento.</li>
	<li>Adicione suavemente 1,52 mL de meio de cultura de 5x estéril frio. Evite bolhas.</li>
	<li>Pouco antes de usar, adicione delicadamente 72 μL de NaOH estéril frio de 1 M. Mantenha a solução no gelo.</li>
	<li>Misture suavemente com pipetagem. Evite bolhas. A mistura eficiente conduz a uma mudança da cor (do vermelho ao alaranjado-vermelho (pH 7,4) no meio. Deixe a mistura no gelo até o uso.</li>
	<li>Etapa crucial: Remova 190 μL do sobrenadante da placa 96-well preparada no dia 1. Tenha muito cuidado para não perturbar os esferóides que se formaram no fundo do poço. Use a pipeta em um ângulo para o lado, não o centro, do poço.</li>
	<li>Adicione delicadamente 100 μL da mistura do colagénio a cada poço. Para evitar qualquer distúrbio esferóide, pipeta a mistura para baixo do lado do poço. Evite bolhas. Mantenha toda a mistura restante do colagénio no tubo de 20 mL na temperatura ambiente para avaliar a polimerização.</li>
	<li>Incubar a placa na incubadora por pelo menos 10 minutos para permitir que o colagénio polimerize. Como um Guideline, se o colagénio restante ajustou-se, tornando-se semi-sólido e esponja-como, os esferoides estão prontos para ser tratados com o inibidor.</li>
	<li>Adicione os fármacos ou inibidores na concentração de 2x para o meio de cultura. Adicione o meio suavemente a cada poço (100 μL por poço). Outra vez, pipeta o meio para baixo o lado do poço para evitar o distúrbio esferóide.</li>
	<li>Observe e imagem cada esferóide por microscopia de campo brilhante às vezes T = 0 h, 24 h, 48 h e 72 h para avaliar a atividade medicamentosa. Em seguida, devolva a placa para a incubadora. Nota: Dependendo do comportamento invasivo da linha celular, a migração para longe do núcleo esferóide original pode ser observada a partir de 24 h em diante.</li>
</ol>3. preparação de colágeno embutido spheroids e células migratórias para microscopia confocal
<ol><li>Coloc a placa em uma capa da cultura do tecido e remova delicadamente o sobrenadante (200 μL). Mais uma vez, tome cuidado para não perturbar o esferóide e evitar tocar o colágeno, pois isso pode interferir com o plugue de colágeno.</li>
	<li>Substitua o sobrenadante por 100 μL de 1X PBS. Repita este passo de lavagem 3x.</li>
	<li>Retire a lavagem final e substitua por 4% de formaldeído em 1X PBS (100 μL por poço). Atenção: O formaldeído é um potencial carcinógeno. Manuseie com cuidado de acordo com as diretrizes de saúde e segurança.</li>
	<li>Coloc a placa 96-well em um banco do laboratório, cubra com a folha, e deixe-a para 24 h na temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o formaldeído e substitua por 1X PBS. Repita este 1X PBS lavagem 3x.</li>
	<li>Prepare 0,1% Triton X-100 em 1X PBS. Retire a lavagem de 1X PBS e substitua-a por 100 μL da solução Triton X-100. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare a solução de bloqueio com 1X PBS e 0, 5% de leite em pó desnatado e misture completamente.</li>
	<li>Remova Triton X-100 e lave 3x com 1X PBS. Adicionar 100 μL de solução de bloqueio a cada poço e incubar durante 15 min.</li>
	<li>Diluir o anticorpo primário requerido no bloqueio do tampão na concentração predeterminada. Aqui, use anticorpo anti-rato IgG acetilado tubulina (1:100).</li>
	<li>Centrifugue a mistura principal do amortecedor do anticorpo-bloqueio por 5 minutos em 15.682 x g. Retire cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione o sobrenadante (25 − 50 μL) a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Retire a solução de anticorpos e lave 3x com 1X PBS (100 μL por poço).</li>
	<li>Diluir o anticorpo secundário no tampão de obstrução na concentração recomendada ou predeterminada além do que todas as manchas fluorescentes adicionais. Aqui, use 1:500 anticorpo conjugado fluorophore-488 do anti-rato, Phalloidin-594 (1:500) para a mancha do actina, e a mancha do ADN (DAPI).</li>
	<li>Mais uma vez, centrifugue a solução secundária do anticorpo por 5 minutos em 13.000 rpm.</li>
	<li>Remova a solução de obstrução de cada poço e adicione 25 − 50 μL da mistura secundária do anticorpo/Phalloidin/DAPI. Incubar no escuro para 1,5 h em temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova a solução secundária do anticorpo-corante e lave 3x com 1X PBS (100 μL por o poço).</li>
	<li>Levante com cuidado plugues individuais do colagénio pela sucção com uma pipeta plástica (200 μL) no centro de uma corrediça de vidro Lisa de alta qualidade.</li>
	<li>Adicione uma gota de um lamínula apropriado ao plugue do colagénio, assegurando-se de que a tomada esteja coberta completamente. Evite bolhas.</li>
	<li>Aplique a lamínula da espessura óptima para o objetivo do microscópio que será usado para a imagem latente e permita ajustar durante a noite. Guarde as lâminas à temperatura ambiente no escuro.</li>
</ol>4. microscopia de fluorescência
<ol><li>Capture imagens fluorescentes usando um microscópio confocal apropriado.</li>
</ol>

<ol><li>Gandalovičová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li>
<li>Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).</li>
<li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333(2017).</li>
<li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics+Technologies%22%5BJournal%5D)">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li>
<li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).</li>
<li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253(2018).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPont%C3%A9n%2C+J+%22Human+Tumor+Cells+in+Vitro%22">Human Tumor Cells in Vitro</a>. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).</li>
<li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line%2C+KNS-42%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologica+Medico+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li>
<li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li>
<li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li>
<li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors%2C+a+promising+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li>
<li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li>
<li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li>
<li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Härmä, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

Uma maneira nova de criar esferoides da pilha de cancro para a identificação da atividade migrastatic da droga usando a microscopia confocal de alta resolução é descrita. O uso de placas aderentes baixas sobre outras técnicas, como gotas suspensas15, facilitou um meio de gerar esferóides reprodutíveis e uniformes para uso nos ensaios de migração e invasão de colágeno. Os pontos críticos neste protocolo são a remoção do meio de crescimento da placa 96-well antes do esferóide da pilha que encaixa em...

As tecnologias esferóide tridimensionais para a descoberta pré-clínica da droga e o desenvolvimento de drogas cancerosas potenciais estão sendo favorecidas cada vez mais sobre telas convencionais da droga; assim, há mais desenvolvimento de migração migrastatic-e prevenção de invasão-drogas. A lógica subjacente a esses desenvolvimentos no tratamento do câncer são claras: ensaios de esferóide 3D representam uma abordagem mais realista para a triagem de drogas anti-câncer potenciais como eles imitam a arquitetura do tumor 3D mais fielmente do que as culturas monocamada celular, recapitular interações do droga-tumor (cinética) mais exatamente, e permita a caracterização da atividade da droga em um ajuste tumor-relacionado. Além disso, o aumento da resistência a medicamentos quimiotóxicos em muitos tipos de câncer e altas taxas de mortalidade entre pacientes oncológicos devido à metástase potenciada pela capacidade das células cancerosas de migrar para sítios tumorais distantes suporta a inclusão de agentes quimioterapêuticos visando o potencial migratório das células cancerosas como tratamento adjuvante em futuros ensaios clínicos de câncer1. Este é particularmente o caso em cânceres altamente invasivos, tais como glioblastomas de alto grau (GBM). A gerência de GBM inclui a cirurgia, a radioterapia, e a quimioterapia. No entanto, mesmo com o tratamento de combinação, a maioria dos pacientes recaída dentro de 1 ano do diagnóstico inicial com uma sobrevida mediana de 11-15 meses2,3. Enormes avanços no campo da tecnologia 3D foram feitos ao longo dos últimos anos: sistemas rotativos, estruturas microfabricadas e scaffolds 3D, e outros ensaios individuais estão sendo continuamente melhorados para permitir testes de rotina em uma grande escala4, 5,6,7. No entanto, os resultados obtidos desses ensaios devem ser analisados de maneira significativa, pois a interpretação dos dados é muitas vezes dificultada pelas tentativas de analisar dados gerados em 3D com sistemas de análise de imagem 2D.
Apesar de ser preferível em termos de velocidade de aquisição de imagem e redução de foto-toxicidade, a maioria dos sistemas de campo largo permanecem limitados pela resolução8. Assim, além dos dados lidos-outs relacionados à eficácia da droga, os efeitos detalhados da ação da droga em estruturas celulares 3D de células migratórias são inevitavelmente perdidos se imaged usando um sistema de campo largo. Por outro lado, a microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) captura imagens de alta qualidade, opticamente seccionadas que podem ser reconstruídas e renderizadas em 3D pós-aquisição usando software de computador. Assim, o CLSM é prontamente aplicável às estruturas celulares 3D complexas da imagem latente, assim permitindo a interrogação dos efeitos de inibidores antimigrastatic em estruturas 3D e em análises detalhadas de mecanismos da migração da pilha. Isto indubitavelmente guiará o desenvolvimento migrastatic futuro da droga. Aqui, um fluxo de trabalho combinado da geração do esferóide, do tratamento da droga, do protocolo de mancha, e da caracterização pela microscopia confocal de alta resolução é descrito.

<table><tbody><tr><td>Colágeno I, cauda de rato, 100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>para ensaio de invasão de glioma; isso é oferecido por muitos distribuidores / fabricantes e precisará ser determinado para o tipo de ensaio pretendido e as linhas celulares usadas. Para linhagens de células de câncer de glioma, o colágeno de cauda de rato tipo 1 (por exemplo, Corning) é a escolha preferida. O colágeno deve ser armazenado a 4 & C, no escuro, até que seja necessário. Não é aconselhável misturar colágeno de diferentes lotes, pois isso pode afetar a consistência do colágeno polimerizado. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>várias</td><td></td><td>para imagens de microscopia</td></tr><tr><td>DMEM em pó</td><td>Sigma</td><td>D5648</td><td>necessário na concentração de 5x para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma; &nbsp; Este pode ser adquirido em pó, feito em água bidestilada e, dependendo da composição final do meio de cultura, completado com quaisquer aditivos necessários. A solução 5x completa deve ser filtrada através de um sistema de filtro de seringa (0,22 &mu; m) antes do uso.</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td>necessário para cultura celular de linhas celulares de glioma</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>vários</td><td>vários</td><td>para imagens microscópicas</td></tr><tr><td>Alta glicose DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>necessário para cultura celular de linhas celulares de glioma</td></tr><tr><td>Inibidor</td><td>Tocris</td><td>vários</td><td>vários - de acordo com o projeto experimental; os inibidores podem ser adquiridos de fabricantes como Selleckchem e Tocris. Esses fabricantes oferecem descrição detalhada das características do inibidor, links para referências associadas e sugestão de concentrações de trabalho. Tal como acontece com todos os inibidores, eles podem ser potencialmente tóxicos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes de saúde e segurança. Os inibidores são preparados como soluções de estoque, conforme recomendado pelo fabricante. Como exemplo, usamos o inibidor de enxaqueca MI-192 para demonstrar o uso de tais inibidores. Testamos uma variedade de inibidores da enxaqueca dessa maneira com resultados comparáveis.</td></tr><tr><td>Montagem</td><td>de vários</td><td></td><td>para imagens microscópicas</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>vários&nbsp;</td><td>vários</td><td>NaOH podem ser adquiridos na molaridade necessária ou preparados a partir da forma sólida. A solução preparada deve ser esterilizada por filtro usando um sistema de filtro de seringa. One M NaOH é corrosivo e deve-se tomar cuidado durante a preparação da solução.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>vários</td><td>vários</td><td>para fixar esferoides e células; maquiagem a 4%, cuidado com o risco à saúde, garantir que os regulamentos de saúde e segurança sejam cumpridos para a solução de colágeno para ensaio</td></tr><tr><td>de invasão Pastettes (pipeta graduada, 3 mL)</td><td>vários</td><td>vários para</td><td>ensaio de invasão, remoção de solução</td></tr><tr><td>PBS, estéril para cultura de tecidos</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td>necessário para cultura celular de linhagens celulares de glioma e lavagens para coloração</td></tr><tr><td>Pen/estreptococos (antibióticos)</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>necessário para a cultura celular de linhas celulares de glioma</td></tr><tr><td>Anticorpo primário, anticorpo secundário, DAPI, Faloidina</td><td>vários</td><td>vários existem</td><td>muitos fabricantes para esses reagentes, para anticorpos marcados secundários, recomendamos Alexa Fluor (Sondas Moleculares). Aqui usamos para anticorpos primários anticorpo de tubulina anti-acetilada de camundongo (1/100, Abcam). Para anticorpos secundários, usamos 1/500 anticorpo conjugado Alexa Fluor 488 anti-camundongo, Sondas Moleculares. Para a coloração nuclear, usamos DAPI (muitos fabricantes) e a coloração de actina Faloidina (muitos fabricantes), ambos usados na diluição recomendada de 1/500.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>necessário para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma na concentração de 5x</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>necessário para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma na concentração de 5x</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>para tripsinização</td></tr><tr><td>Placas de fixação ultra baixa</td><td>Sigma/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>para ensaio de invasão de glioma; É necessária uma placa de baixa aderência, com placas de 96 poços preferidas para permitir a triagem em larga escala dos compostos sob investigação. Existem várias placas de baixa aderência disponíveis comercialmente; É aconselhável testar uma variedade de placas para uma geração ideal de esferóides. Em nossa experiência, o Costar Ultra Low Cluster com tampa, fundo redondo, funciona melhor para a geração de esferóides a partir de células cancerígenas de glioma em termos de 100% de formação e reprodutibilidade de esferóides. Essas placas também foram usadas com sucesso para a geração de esferóides de glioma a partir de material derivado de pacientes, células de câncer de bexiga e ovário em nosso laboratório. Além disso, neuroesferas de caule ou progenitoras podem ser usadas nessas placas para facilitar a geração de esferoides de neuroesferas padronizados</td></tr><tr><td>Stripettes (pipetas sorológicas, estéreis, 5 mL e 10 mL)</td> <td>vários, por exemplo, Costar</td><td>CLS4488-50; CLS4487-50</td><td>para cultura de tecidos e preparação de colágeno</td></tr><tr><td>Vários multicanais (50 - 250 &mu; L) e pipetas monocanal (10 &mu; L, 50 &mu; L, 200 &mu; L 1 mL)</td><td>vários</td><td>vários</td><td>para manuseio de células e esferoides</td></tr><tr><td>Microscopia de campo amplo</td><td>vários&nbsp;</td><td>várias</td><td>para observação da geração de esferóides e imagens de esferóides; aqui imagens de fluorescência de campo amplo foram capturadas usando um sistema de imagem de células EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)</td></tr> <tr><td>Zeiss LSM 880 CLSM equipado com uma objetiva de óleo Plan Apochromat 63x 1.4 NA</td> Citação <td>Zeiss</td><td>do fabricante</td><td>As imagens confocais foram capturadas usando uma objetiva de óleo Zeiss LSM 880 CLSM equipada com uma objetiva de óleo Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Lasers de diodo 405nm, 458/488/514nm argônio multilinha e HeNe 594nm foram usados para excitar Faloidina 594, Alexa Fluor 488 e DAPI, respectivamente. Para cada imagem, uma única seção óptica representativa foi capturada, com todas as configurações, pré e pós-captura de imagem, mantidas para fins comparativos. Todas as imagens foram posteriormente processadas usando o software de imagem Zen associado e o Adobe Photoshop.</td></tr></tbody></table>

caracterização dos efeitos de inibidores de migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3d pela microscopia confocal de alta resolução

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Descoberta de drogas e desenvolvimento em pesquisa de câncer está sendo cada vez mais baseado em telas de drogas em um formato 3D. Os inibidores novos que visam o potencial migratório e invasor de pilhas de cancro, e conseqüentemente a propagação metastática da doença, estão sendo descobertos e considerados como tratamentos complementares em cancros altamente invasores tais como gliomas. Assim, é necessário gerar dados que permitam a análise detalhada das células em um ambiente 3D após a adição de uma droga. A metodologia descrita aqui, combinando ensaios de invasão esferóide com captura de imagem de alta resolução e análise de dados por microscopia de varredura por laser confocal (CLSM), permitiu a caracterização detalhada dos efeitos do potencial inibidor antimigratório MI-192 em células de glioma. Os spheroids foram gerados das linhas de pilha para ensaios da invasão em placas 96-well aderentes baixas e preparadas então para a análise de CLSM. O fluxo de trabalho descrito foi preferível em relação a outras técnicas geradoras de spheroóides comumente usadas, devido à facilidade e reprodutibilidade. Isto, combinado com a definição aumentada da imagem alcançada pela microscopia confocal comparada às aproximações convencionais do largo-campo, permitiu a identificação e a análise de mudanças morfológicas distintas em pilhas migratórias em um ambiente 3D que segue tratamento com a droga migrastatic MI-192.

A tecnologia de esferóide tridimensional está avançando a compreensão de interações do droga-tumor porque é mais representativa do ambiente cancro-específico. A geração de esferóides pode ser alcançada de várias maneiras; as placas da baixa aderência 96-well foram usadas neste protocolo. Depois de testar vários produtos de diferentes fabricantes, as placas usadas aqui foram escolhidos porque eles consistentemente realizada melhor em termos de produção de esferóide bem sucedida e uniformid...

Os efeitos de inibidores migrastatic na migração da pilha do cancro do glioma em ensaios tridimensionais da invasão (3D) usando um inibidor do do histone do histona (HDAC) são caracterizados pela microscopia confocal de alta resolução.

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Este protocolo está demonstrando que agora podemos determinar o efeito dos inibidores migratáticos em detalhes em modelos de câncer 3D. A principal vantagem é a facilidade e abordagem all-in-one com a qual essa técnica pode ser realizada. Esta técnica permite a avaliação de medicamentos migratáticos em pesquisas de câncer em um ambiente 3D, permitindo o teste de drogas em um ambiente mais relevante para o tumor.Este método pode ser aplicado ao teste de drogas citotóxica em câncer ou, por exemplo, para avaliar o efeito da radiação na proliferação do câncer e migração celular. É útil praticar a etapa de remoção média e substituição de colágeno com placas comuns de 96 poços para se tornar confiante. Além disso, o treinamento em um microscópio confocal é essencial.A demonstração visual dessa técnica é fundamental para que os pesquisadores entendam o manejo delicado necessário dos esferoides e seu uso na microscopia confocal. No primeiro dia de experimentação, tenha o meio de cultura padrão, neste caso, U251, pronto para a linha celular apropriada. Em uma capa de cultura de tecido, adicione 0,5 mililitros de trippsina na cultura para tentarpsinizar as células cancerígenas.Conte as células cancerígenas em um hemócito, e dilua para uma concentração de cinco vezes 10 para a terceira célula por mililitro. Mantenha as suspensões celulares em tubos universais claramente rotulados e estéreis. Resuspend as células por inversão suave para evitar a aglomeração celular.Use uma pipeta para adicionar 200 microliters da cultura celular a cada poço em uma placa de 96 poços. Adicione 200 microliters de 1X PBS a cada poço vazio para evitar a evaporação. Incubar as células em uma incubadora a 37 graus Celsius.Após 24 horas, verifique as células por microscopia de campo brilhante. Linhas celulares como linhas de células cancerígenas de glioma formam esferoides no fundo do poço dentro de 24 horas. Incubar os esferoides por mais 48 horas para permitir que uma arquitetura celular 3D se forme.No terceiro dia, coloque colágeno, 5X de cultura média, hidróxido de sódio de um molar e um tubo de 20 mililitros no gelo. Adicione cuidadosamente e lentamente 10,4 mililitros de colágeno frio no tubo de cultura resfriado. Evite bolhas.Em seguida, adicione suavemente 1,52 mililitros de meio de cultura 5X estéril a frio. Evite bolhas. Pouco antes do uso, adicione suavemente 72 microliters de hidróxido de sódio estéril frio e um molar, e mantenha a solução no gelo.Misture suavemente por pipetar e evitar bolhas. A mistura eficiente leva a uma mudança de cor de vermelho para vermelho-laranja no meio. Deixe a mistura no gelo até usar.Em seguida, para remover 190 microliters de supernacer da placa de 96 poços preparados no primeiro dia, use uma pipeta em um ângulo em direção ao lado do poço. Tenha muito cuidado para não perturbar os esferoides que se formaram no fundo do poço. Adicione suavemente 100 microliters da mistura de colágeno a cada poço, escoando pelo lado do poço.Evite bolhas e qualquer perturbação esferoide. Mantenha qualquer mistura de colágeno restante no tubo de 20 mililitros à temperatura ambiente para avaliar a polimerização. Incubar a placa na incubadora por pelo menos 10 minutos para permitir que o colágeno polimerize.Quando o colágeno restante se torna semisólida e esponja, os esferoides estão prontos para serem tratados com inibidor. Adicione os inibidores na concentração de 2X a cinco mililitros de meio de cultura. Pipeta 100 microliters do meio suavemente para baixo do lado de cada poço para evitar perturbação esferoide.Observe e imagem cada esferoide por microscopia de campo brilhante em momentos de zero hora, 24 horas, 48 horas e 72 horas para avaliar a atividade medicamentosa. Em seguida, devolva a placa para a incubadora. Agora, coloque a placa em uma capa de cultura de tecido, e substitua suavemente o supernatante por 100 microliters de 1X PBS.Tome cuidado para não perturbar o esferoide, e evite tocar no colágeno. Repita este passo de lavagem mais três vezes. Remova a lavagem final em cada poço e substitua por 100 microlitrais de 4% de formaldeído em 1X PBS.Coloque a placa de 96 poços em um banco de laboratório, cubra com papel alumínio e deixe por 24 horas em temperatura ambiente. No dia seguinte, remova cuidadosamente o formaldeído e substitua por 1X PBS. Repita esta lavagem mais três vezes.Em seguida, substitua a lavagem 1X PBS por 100 microliters de solução Triton X-100 recém-preparada. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare a solução de bloqueio com 50 mililitros de 1X PBS e 05% de leite em pó desnatado em um tubo de 50 mililitros, e misture bem.Após 30 minutos, remova o Triton X-100 e lave três vezes com 1X PBS. Adicione 100 microliters da solução de bloqueio a cada poço e incubar por 15 minutos. Em seguida, diluir o anticorpo de tubulina acetilado anti-rato IgG no tampão de bloqueio a uma proporção de 1 a 100.Centrifugar a mistura primária de tampão de bloqueio de anticorpos por cinco minutos a 15,682 vezes g. Remova cuidadosamente a solução de bloqueio em cada poço e adicione de 25 a 50 microliters do supernatante tampão de bloqueio de anticorpos do tubo. Incubar no escuro à temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, remova a solução de anticorpos de cada poço e lave três vezes com 100 microliters de 1X PBS. Diluir o anticorpo secundário no tampão de bloqueio na concentração recomendada, além de quaisquer manchas fluorescentes adicionais. Novamente, centrifugar a solução de anticorpos secundários por cinco minutos a 15,682 vezes g.Remova a solução de bloqueio de cada poço e adicione 25 a 50 microliters do supernatante de anticorpos secundários. Incubar no escuro por 1 1/2 horas em temperatura ambiente. Remova a solução secundária de corante de anticorpos e lave três vezes com 1X PBS, 100 microliters por poço.Levante cuidadosamente os plugues individuais de colágeno por sucção com uma pipeta de plástico de 200 microliter no centro de uma lâmina de vidro. Adicione uma gota de um montador adequado para cobrir o plugue de colágeno. Posicione uma mancha de cobertura em cima da amostra e armazene o slide à temperatura ambiente no escuro.A tecnologia esferoide tridimensional está avançando na compreensão das interações medicamentosa-tumoral porque é mais representativa do ambiente específico do câncer. Neste estudo, foram detectados potenciais efeitos anti-ou pró-migratórios. Isto é especialmente perceptível no KNS42, aparentemente sem migração no controle ou nos esferoides tratados.A morte celular foi observada na maior concentração inibidora de 10 micromolar. A fragmentação nuclear e as células migratórias foram evidentes nas células U251. Os esferoides de células U251 tinham picos irradiando para longe do esferoide original, com o aumento do arredondamento celular em células aparentes com a crescente concentração inibidora.Microtúbulos colapsados e fragmentação nuclear foram observados no KNS42. Saliências de folha com picos de célula única indicam migração KNS42. Na menor concentração inibidora, este fenótipo foi pronunciado, mas foi perdido com o aumento da concentração inibidora.É crucial deixar todos os reagentes no gelo até ficarem prontos. Caso contrário, o colágeno começa a polimerizar antes de tudo ser adicionado aos esferoides. Há escopo para quantificar as imagens geradas pela microscopia confocal para avaliar os efeitos de, por exemplo, drogas migratórias na morfologia celular.Permitiu-nos, pela primeira vez, confirmar o efeito do inibidor migratático MI-192 nos níveis de acetilação de microtúbulos e explorar isso ainda mais em termos de migração celular. Deve-se tomar cuidado extra ao lidar com o formaldeído para a etapa de fixação. Aplicam-se as diretrizes habituais de saúde e segurança.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Modelos de invasão das células tumorais em três dimensões da matriz extracelular melhor refletir...

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Fonte: Guyon, J., et al. Um modelo esferóide 3D para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)O vídeo demonstra a geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais. Os esferóides são formados a partir de células tumorais cerebrais humanas e incorporados em uma matriz de colágeno. As células tumorais na periferia esferóide adotam um fenótipo invasivo, secretando proteases para degradar o colágeno e avançando para invadir a matriz circundante.

Geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

O objetivo do presente protocolo é avaliar o efeito dos factores pro e anti migratory na migração de células dentro de uma matriz tridimensional de fibrina.

Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

O microambiente tumoral é uma parte essencial do crescimento e invasão do câncer. Para imitar a progressão da carcinoma, uma matriz humana biologicamente relevante é necessária. Este protocolo introduz uma melhoria para in vitro o ensaio tridimensional da invasão do esferóide aplicando uma matriz leiomyoma-baseada humana. O protocolo também introduz uma análise de invasão de células baseada em computador.

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

Aprenda a caracterizar os efeitos de inibidores migrastáticos na invasão de esferoides tumorais 3D usando microscopia confocal de alta resolução. Este método permite avaliar a eficácia de drogas em modelos de glioma.

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

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