Name: Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a entrega intratecal de oligonucleotídeos antisense no sistema nervoso central de ratos usando implante de cateter. Este método seguro e acessível permite avaliar farmacocinética e eficácia de terapêuticas.

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Gostaríamos de agradecer à Ionis Pharmaceuticals por fornecer os ASOs descritos no artigo.

Todos os procedimentos in vivo foram realizados no âmbito do Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) protocolos aprovados que seguem as diretrizes estabelecidas pelo Guia dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Preparação de materiais e instrumentos
<ol><li>Prepare as cânulas guia especial.<ol>
<li>Use uma ferramenta rotativa com roda de corte (ou uma serra afiada) para cortar as duas extremidades de uma agulha de 19 G, resultando em uma cânula guia de ~ 1,5-2 cm de comprimento (Figura 1Aiii). Use a roda de moagem da ferramenta rotativa para suavizar as duas extremidades. NOTA: Alternativamente, cânulas guia pré-fabricados e estéreis podem ser comprados a partir de um fornecedor comercial(Mesa de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a montagem do cateter/fio.<ol>
<li>Corte um pedaço de 8 cm de comprimento de tubos PE-10 (tubos de polietileno, diâmetro 0,011 polegada) para servir como cateter intratário. Faça uma marca de 2 cm de uma extremidade com uma caneta marcador resistente ao etanol. Corte um fio de estilo de 11 cm de comprimento de fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoroetileno. Insira o fio stylet(Figura 1Aii)no lumen do cateter PE-10 (Figura 1Ai). NOTA: Um cateter / conjunto de montagem de fio(Figura 1Av) é necessário para cada animal. Alternativamente, cateteres e fios stylet podem ser comprados de um fornecedor comercial(Mesa de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a montagem do cateter de entrega.<ol>
<li>Corte um pedaço de cateter PE-50 (5 a 10 cm, tubos de polietileno, diâmetro de 0,023 polegadas) (Figura 1Bi). Para uma extremidade do cateter PE50 inserir um adaptador de tubos 23 G(Figura 1Biv). Esta extremidade será conectada a uma seringa de 100 μL(Tabela de Materiais)durante a cirurgia. Insira uma agulha de 30 G modificada com o cubo cortado(Figura 1Biii)em um pedaço de aproximadamente 0,5 cm de tubos PE-10(Figura 1Bii)e conecte a tubulação PE-10 à outra extremidade do cateter.</li>
		<li>O final da agulha de 30 G da montagem do cateter de entrega(Figura 1Bv)estará ligado à extremidade distal do cateter PE-10 implantado no rato durante a cirurgia. NOTA: Alternativamente, a montagem do cateter de entrega(Figura 1Bv)pode ser comprada de um fornecedor comercial(Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o guia de montagem de cânula-agulha (Figura 1Avi),colocando uma cânula guia(Figura 1Aiii)ao longo do final de uma agulha de 23 G.</li>
	<li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo a cânula guia e os conjuntos de fio / cateter usando um esterilizador de óxido de etileno para 12 h. NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos, exceto o cateter pode ser autocllaved; Cateter vai derreter em alta temperatura.</li>
</ol>2. Preparação para a cirurgia
NOTA: Este procedimento é rotineiramente realizado em ratos Sprague Dawley masculinos e femininos com pesos corporais entre 200 g e 400 g. Dois ratos são alojados por gaiola um ciclo de luz /escuridão de 12 h com acesso gratuito a comida e água.
<ol><li>Peso de um rato e colocá-lo em uma câmara de isoflurane para induzir anestesia (1-5% isoflurano em O2, titrated ao efeito). NOTA: O rato é então continuamente anestesiado com isoflurano para manter anestesia profunda através de um cone de nariz durante todo o procedimento. Um método alternativo de anestesia (por exemplo, administração de cetamina 100 mg/kg e xilamina 10 mg/kg) pode ser usado conforme aprovado pela IACUC.</li>
	<li>Quando o rato não responde a uma pitada do dedo do pé, raspe suas costas da cauda para a coluna torácica caudal e coloque o rato raspado no uma folha estéril colocada em cima de uma almofada de aquecimento.</li>
	<li>Posicione um tubo cônico de centrífuga de 50 ml o abdômen do rato para flexionar a coluna vertebral na região lombar(Figura 2A)e aplique pomada oftalmológica nos olhos.</li>
	<li>Injetar buprenorfina de liberação sustentada (1,0 mg/kg; Tabela de Materiais) subcutâneamente no rato. Limpe a pele exposta com povidona alternada e esfoliação de álcool e repita isso três vezes. NOTA: Um alívio alternativo da dor pode ser usado como aprovado pelo protocolo IACUC.</li>
	<li>Arque o animal com uma cortina transparente estéril que foi fenestrated sobre o local cirúrgico.</li>
</ol>3. Cirurgia
<ol><li>Com o rato suportado pelo tubo cônico de 50 mL, identifique os dois poços naturais entre os músculos acima da pelve (setas na Figura 2A). Com uma mão segurando esses poços, use a outra mão para pressionar suavemente e sentir a coluna vertebral da direção caudal à rostral e encontre o primeiro grande recuo entre vértebras e este é o espaço intervertebral entre vértebras S1 e L6 (Figura 2B ).</li>
	<li>Mova-se ligeiramente rosado para identificar o próximo recuo, o espaço intervertebral entre as vértebras L5 e L6 e o local da injeção (* na Figura 2A). Use um bisturi para fazer uma incisão não mais do que 2 cm de comprimento na pele ao longo da linha média de rostral para caudal para que o local da injeção está no centro da incisão (linha pontilhada na Figura 2A).</li>
	<li>Use tesouras de dissecação para dissecar o tecido conjuntivo, a fim de visualizar a camada muscular. Em seguida, faça uma incisão de 1 cm na cápsula muscular imediatamente lateral para o processo dorsal espinhal da vértebra lombar L6. NOTA: Os ossos da vértebra lombar L6 podem ser visualizados neste momento.</li>
	<li>Posicione o guia de montagem de cânula-agulha perto do aspecto anterior da vértebra lombar 6 e empurrá-lo para o espaço intervertebral ao longo do aspecto anterior da vértebra 6 para que a extremidade da agulha penetra no canal espinhal. Empurre a cânula guia no lugar ao longo da agulha e retire a agulha 23 G deixando apenas a cânula guia no lugar. NOTA: É útil usar fórceps contundentes para localizar o processo dorsal da vértebra lombar L6 antes de inserir a agulha. Geralmente, o fluido CSF pode ser visto entrando no centro da agulha (este fluido pode ser tingido com uma pitada de sangue, mas isso não indica que o dano tenha sido feito ou que a agulha não seja colocada corretamente). Os autores não viram a grande quantidade de sangue ou de sangramento severo durante este procedimento. Se ocorrer, um veterinário deve ser contatado para determinar o tratamento adequado e se os animais devem ser sacrificados.</li>
	<li>Insira a montagem do cateter-fio na cânula guia. Anule para baixo o conjunto do cateter-fio em aproximadamente um ângulo de 45° ao canal espinal e force a extremidade aproximadamente 0.3 cm no canal espinal.</li>
	<li>Retire a cânula guia, deixando o cateter com o fio stylet no lugar. Retire o fio stylet aproximadamente 2,5 cm da ponta intrateral do cateter e avançar o cateter para o canal espinhal até que a marca de 2 cm está na entrada do canal (apenas visível abaixo do músculo), como mostrado na Figura 1Bvi. NOTA: O cateter inserido deve estender-se rosatrally no espaço subaracnoide. A colocação bem sucedida deve permitir a livre circulação do cateter nesse espaço.</li>
	<li>Retire completamente o fio stylet, e CSF pode ser visto entrando no cateter implantado.</li>
	<li>Conecte a montagem do cateter de entrega à extremidade distal do cateter implantado através da extremidade da agulha de 30 G(Figura 1Bv,vi).</li>
	<li>Carregue 60 μL de soro soro para isela estéril em uma seringa de 100 μL (seringa de rubor). Carregue um bolus de 30 μL do composto de teste (por exemplo, solução ASO) em uma segunda seringa (seringa de injeção).</li>
	<li>Conecte a seringa de descarga (carregada com soro soro) ao adaptador de tubos final da montagem do cateter de entrega (Figura 1Bv). Injete 20 μL de soro lógico estéril no espaço intratésico (rubor pré-injeção).</li>
	<li>Conecte a seringa de injeção (carregada com composto de teste) ao adaptador de tubos final da montagem do cateter de entrega(Figura 1Bv). Injete 30 μL de composto de teste no espaço intratário acima de 30 s. NOTA: O volume de injeção de rotina de ASO é de 30 μL para alcançar um bom knockdown na medula espinhal e no córtex. Tem sido relatado que os volumes de injeção podem afetar a distribuição composta12,embora diferentes volumes de injeção não tenham sido testados. Se outros compostos ou volumes forem usados, a segurança e a eficácia precisam ser determinadas empiricamente.</li>
	<li>Repita o passo 3.10 e lave o cateter com outros 40 μL de soro soro estéril (rubor pós-injeção). Em seguida, retire a montagem do cateter de entrega do cateter implantado. NOTA: O flush pré e pós-injeção é pensado para reduzir o sequestro local dos compostos e melhorar a sua distribuição para as estruturas rostrais12.</li>
	<li>Séptico corte e calor selar o cateter implantado: Coloque um par de fórceps dissecação estéril em um esterilizante de contas até que estejam muito quentes, em seguida, reprimir a tubulação com a extremidade quente dos fórceps. NOTA: Esta ação derrete o cateter. Assim, o buraco no tubo é desmoronado e todos os lados se ater uns aos outros, selando a tubulação de uma forma asséptica e, em seguida, ele é colocado no espaço subcutâneo.</li>
	<li>Use suturas monofilamento absorvíveis para proteger o cateter selado pelo calor restante para o tecido conjuntivo. Em seguida, use suturas monofilamento não absorvíveis para fechar a pele sobre o cateter garantido selado pelo calor. NOTA: Clipes de feridas também podem ser usados como aprovados pelo protocolo IACUC. A técnica é compatível com injeções repetidas, embora tenha sido usada apenas para injeções únicas em nossas mãos. A viabilidade de injeções repetidas deve ser avaliada empiricamente com a aprovação da IACUC.</li>
	<li>Use gaze e soro para lavar qualquer sangue da pele e permitir que o animal se recupere da anestesia em uma incubadora aquecida até ser móvel, momento em que é devolvido à sua gaiola doméstica (dois ratos por gaiola). NOTA: Ao realizar cirurgias em vários ratos no mesmo dia, ferramentas limpas usando água para remover o sangue e reesterilizar usando um esterilizador de contas secas aquecida (por pelo menos 20 s, com tempo para esfriar) entre os animais. Um novo conjunto de instrumentos é usado a cada 5 animais.</li>
	<li>Monitore os animais diariamente por pelo menos 3 dias após a cirurgia e continue monitorando os animais semanalmente após a recuperação da cirurgia de acordo com o protocolo da IACUC. NOTA: Se ocorrerem complicações de urina (retenção de urina, infecções por incisão, distúrbios neurológicos como convulsão ou paralisia), um veterinário deve ser contatado para determinar o tratamento adequado e se os animais devem ser sacrificados. Se a buprenorfina de liberação sustentada não for usada, o alívio da dor deve ser administrado diariamente após a cirurgia de acordo com o protocolo da IACUC.</li>
</ol>4. Avaliação de tecido específico knockdown após injeção de TI
<ol><li>Duas semanas após a injeção de IT bolus de ASOs, coletar diferentes regiões do cérebro (ou seja, córtex cerebral, estriado e cerebelo), bem como diferentes segmentos da medula espinhal (ou seja, cervical, torácico e lombar). Extraia rna total do tecido usando um kit de extração de RNA comercial e execute reação de síntese de CDNA, conforme descrito anteriormente13. NOTA: Reagentes padrão foram usados para qPCR com os seguintes ensaios: rato Malat1 e rat GAPDH. Os níveis relativos de transcrição foram calculados através do método CT 2-ΔΔ (CT = ciclo limiar).</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li>
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<li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li>
</ol>

Os autores são todos funcionários da Biogen, Inc. ou Ionis Pharmaceuticals. Os autores recebem os oligonucleotídeos antisenso descritos no artigo da Ionis Pharmaceuticals.

O artigo atual mostra um método poderoso para entregar agentes terapêuticos diretamente no CNS do rato. Em teoria, uma técnica semelhante também pode ser realizada em camundongos, embora devido ao tamanho menor, o método pode ser mais desafiador. Portanto, nosso grupo realiza injeções intracerebroventriculares (ICV) em camundongos para entrega de medicamentos do SNC, que atingem os mesmos objetivos por meio de uma rota de administração diferente. Esse método foi descrito em outro estudo16.
<p ...

O sistema vascular do sistema nervoso central (SNC) evoluiu como um regulador crítico da homeostase, controlando o tráfego de moléculas, fornecendo nutrientes e livrando-se do desperdício. Este sistema é também a primeira linha de defesa de ataques de patógenos externos, graças a uma densa distribuição de junções apertadas ao longo das paredes das células endotélias. Estas junções apertadas compõem um aspecto da barreira cerebral do sangue (BBB). Enquanto o BBB permite o transporte de moléculas necessárias para atender demandas de nutrientes e energia (por exemplo, íons, glicose), também limita seletivamente a passagem de patógenos, bem como produtos químicos tóxicos1,2,3.
Ironicamente, a mesma função protetora do BBB que limita a passagem de patógenos e produtos químicos tóxicos também é o principal obstáculo à nossa capacidade de acessar facilmente o SNC com tratamentos terapêuticos após a administração sistêmica para o organismo2, 4,5. Esse papel do BBB levou ao desenvolvimento de uma infinidade de novas tecnologias de distribuição de medicamentos e abordagens6.
Uma maneira de superar esse obstáculo é injetar as drogas diretamente no líquido cefalorraquidiano (CSF) que continuamente perfunde tanto o cérebro quanto a medula espinhal7,8,9,10. Neste artigo, descrevemos um método para entregar com sucesso os agentes para o espaço intratelal lombar, colocando a extremidade interna do cateter completamente no espaço cauda equina da coluna vertebral do rato. Uma descrição deste procedimento foi publicada previamente por Mazur et al. em outra parte11.
O protocolo é muito eficaz e produz uma taxa de sucesso superior a 90% de entrega de oligonucleotídeos antisenso (ASO) ao SNC quando avaliada pela análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase (qPCR) do knockdown de genes-alvo8. O procedimento causa desconforto mínimo para os animais, já que 100% dos ratos sobrevivem à cirurgia e mostram inchaço mínimo em torno da ferida cirúrgica e sem sinais de angústia (por exemplo, hiperatividade, desidratação, circulando, perda de equilíbrio, diminuição da ingestão de alimentos e desidratação) durante a observação pós-operatório. Outra vantagem do método descrito aqui é que ele não requer equipamentos caros, nem quaisquer ferramentas especiais.

<table><tbody><tr><td>Campo Pequeno para Cortina Steri-Drape 3M com Abertura Adesiva</td><td>3M</td><td></td><td>1020</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Decon Laboratories, Inc</td><td></td><td>8416-160Z</td></tr><tr><td>Bastões de cotonete com álcool</td><td>Dynarex</td><td></td><td>NO 1204</td></tr><tr><td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD Seringas de Uso Geral 1 mL Ponta Luer-Lok</a></td><td>BD</td><td>1ml TB Ponta Luer-Lok</td><td>BD 302830</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE Tubing</td><td>BD</td><td>Tubulação de polietileno BD PE50 Diâmetro 0,023 in</td><td>BD 427400 (10 pés, Fischer Scientific 22-204008) ou 427401 (100 pés, Fischer Scientific 14-170-12P)</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE Tubing</td><td>BD</td><td>Tubulação de polietileno PE10 Diâmetro 0,011 in</td><td>BD 427410 (10 pés, Fischer Scientific 14-170-11B) ou 4274011 (100 pés, Fischer Scientific 14-170-12B)</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE Tubing Adapters</td><td>BD</td><td>23 gauge intramedic luer stub adaper</td><td>BD 427565 ou Fisher Scientific 14-826-19E</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Agulhas de uso único 30G</td><td>BD</td><td></td><td>BD</td></tr> 305128 <tr><td>Buprenorfina Liberação Sustentada - laboratório</td><td>ZooPharm</td><td>Prescrição necessária</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de óxido de etileno</td><td>Andersen Sterilizer INC.</td><td>AN 74i, esterilizador a gás</td><td>AN 74i</td></tr><tr><td>Cânula guia</td><td>BD</td><td>19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) agulha</td><td>BD 305186</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 100ul</td><td>Empresa Hamilton</td><td>Seringa Hamilton 100ul</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas quentes</td> Ferramentas de <td>ciências</td><td></td><td>finas ESTERILIZADOR MODELNO FST 250</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Produto veterinário Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Pocket Pro Pet Trimmer</td><td>Braintree Scientific</td><td></td><td>CLP-9931 B</td></tr><tr><td>Esfoliante de povidona</td><td>PDI</td><td></td><td>S48050</td></tr><tr><td>Solução salina</td><td>Baxter</td><td>Cloreto de sódio 0,9% Infusão intravenosa BP 50ml</td><td>FE1306G</td></tr><tr><td>bisturi</td><td>descartável de penas</td><td></td><td>No. 10</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento para pequenos animais</td><td>K & H Manufacturing</td><td></td><td>Modelo # 1060</td></tr><tr><td>Estilete de Fio</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T14</td><td>LH-36233780</td></tr> Campo cirúrgico para <tr><td>toalha</td><td>Dynarex</td><td></td><td>4410</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica e fórceps</td><td>FST e Suturas Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon</td><td></td><td></td><td>4-0 ou 5-0</td></tr><tr><td>Ferramenta para fazer o canular guia</td><td>Ferramenta rotativa Grainger</td><td>(Dremel)</td><td>14H446 (Mfr: EZ456)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Disco de corte de bloqueio EZ</td><td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Rebolo, Óxido de Alumínio</td><td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Mandril de bloqueio EZ</td><td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Piso de roda diamantada Azulejo</td><td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td></tr><tr><td><forte>Fonte alternativa de materiais pré-fabricados e esterilizados para este procedimento</forte>Sistema de</td> cateter de dosagem Sistemas de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>infusão</td><td></td> SAI Cânula guia <td>RIDC-01</td></tr><tr><td></td> Sistemas <td></td> de <td>infusão SAI</td><td>RIDC-GCA</td></tr><tr><td>Cateteres internos</td> Sistemas de <td>infusão SAI</td><td>RIDC-INC Sistemas de</td>infusão <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>SAI de fio estilete</td><td>CEPID-STY</td></tr></tbody></table>

entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

A barreira hematola (BBB) é uma defesa importante contra a entrada de agentes potencialmente tóxicos ou patogênicos do sangue para o sistema nervoso central (SNC). No entanto, sua existência também reduz drasticamente a acessibilidade dos agentes terapêuticos administrados sistemicamente ao SNC. Um método para superar isso, é injetar esses agentes diretamente no líquido cefalorraquidiano (CSF), ignorando assim o BBB. Isso pode ser feito através da implantação de um cateter para infusão contínua usando uma bomba osmótica, ou para entrega única bolus. Neste artigo, descrevemos um protocolo cirúrgico para a entrega de oligonucleotídeos antisenso (ASOs) através de um cateter implantado diretamente no espaço cauda equina da coluna de ratos adulta. Como resultados representativos, mostramos a eficácia de uma única injeção intrathecal (TI) de ASO através deste sistema de cateterismo em derrubar o RNA alvo em diferentes regiões do CNS de ratos. O procedimento é seguro, eficaz e não requer equipamentos caros ou ferramentas cirúrgicas. A técnica descrita aqui pode ser adaptada para entregar drogas em outras modalidades também.

Usando o método descrito aqui, injetamos dois grupos de ratos fêmeas adultos (250-300 g; n = 10/group) com um único bolus de PBS salina tampão de fosfato ou 300 μg de ASO visando o longo não codificação (linc) RNA Malat1; em nosso laboratório, usamos rotineiramente o Malat1 ASO como um composto de ferramenta, porque Malat1 é expressa onipresente e em altos níveis em todos os tecidos14, incluindo cérebro e medula espinhal. O Malat1 ASO funciona através de um mecanis...

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Este protocolo permite a entrega direta de terapêuticas no sistema nervoso central do rato para avaliar a farmacocinética, a farmacodinâmica e a eficácia de novas terapêuticas em modelos de doenças de ratos. Este procedimento é seguro, eficaz e não requer equipamentos caros ou ferramentas cirúrgicas. Demonstrando o procedimento estarão Yi Chen e Yi Luo, cientistas de pesquisa do meu laboratório.Para preparar as cânulas guias especiais, use uma ferramenta rotativa com uma roda cortada para cortar ambas as extremidades de uma agulha de calibre 19 para obter uma cânula guia de aproximadamente um ano e meio a dois centímetros de comprimento. Em seguida, use a roda de moagem da ferramenta rotativa para suavizar ambas as extremidades. Para preparar o conjunto do fio do cateter, corte uma peça de oito centímetros de comprimento de tubo PE10 de diâmetro de 011 polegadas para servir como cateter intratecal para cada animal.Use uma caneta marcadora resistente ao etanol para fazer uma marca de dois centímetros de uma extremidade de cada pedaço de tubo. Para cada animal, insira um fio de estilo de 11 centímetros de comprimento cortado do fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoroetileno no lúmen do cateter PE10 de oito centímetros. Para preparar o conjunto do cateter de entrega, corte um pedaço de cateter PE50 de 5 a 10 centímetros de diâmetro e insira um adaptador de tubulação calibre 23 em uma extremidade do cateter.Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 com um hub cortado em um pedaço de aproximadamente 0,5 centímetros de tubulação PE10 e conecte a tubulação PE10 à outra extremidade do cateter. Para preparar um conjunto de agulhas-cânulas guia, coloque uma cânula guia sobre a extremidade de uma agulha de calibre 23. Antes de começar a cirurgia, coloque uma almofada de aquecimento na mesa de cirurgia e cubra a almofada com uma folha de cortina estéril.Coloque um tubo de centrífuga cônica de 50mL sobre a folha e confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo no rato experimental anestesiado. Depois de pesar o animal, raspe as costas da cauda até a coluna torácica caudal e coloque o rato raspado na folha estéril na posição propensa. Posicione o tubo de 50mL sob o abdômen para flexionar a coluna vertebral na região lombar e aplique pomada oftalmica nos olhos.Em seguida, injete subcutâneamente um miligrama por quilograma de liberação sustentada Buprenorphine e limpe a pele exposta com povidone sequencial e esfoliantes de álcool. Drape o animal com uma folha transparente estéril fenestrada. Para colocação do cateter e injeção do composto, identifique os dois poços naturais entre os músculos acima da pelve raspada, e com uma mão segurando os poços, use a outra mão para pressionar suavemente e sentir a coluna vertebral da direção caudal para rostral para localizar a primeira grande recuo entre as vértebras.Depois de identificar o espaço intervertebral entre as vértebras S1 e L6, mova-se ligeiramente rostrally para identificar o espaço intervertebral entre as vértebras L5 e L6. Use um bisturi para fazer uma incisão de no máximo dois centímetros de comprimento na pele e cápsula muscular neste local ao longo da linha média do rostral à direção caudal para que o local da injeção esteja no centro da incisão. Use uma tesoura de dissecção para dissecar o tecido conjuntivo até que a camada muscular possa ser visualizada.Faça uma incisão de um centímetro na cápsula muscular imediatamente lateral ao processo espinhal dorsal da vértebra lombar L6. Posicione o conjunto da agulha da cânula guia perto do aspecto anterior da sexta vértebra lombar e empurre o conjunto para o espaço intervertebral ao longo do aspecto anterior da sexta vértebra para que a extremidade da agulha penetre o canal espinhal. Use fórceps contundentes para localizar o processo espinhal dorsal da vértebra lombar L6 e empurre a agulha ao longo do aspecto anterior da sexta vértebra para o espaço invertebrata.Empurre a cânula guia no lugar ao longo da agulha, remova a agulha e insira o conjunto do fio do cateter na cânula guia. Angling do cateter em um ângulo de aproximadamente 45 graus para o canal espinhal, forçar a extremidade do cateter aproximadamente 0,3 centímetros no canal. Remova o fio de esfogem aproximadamente 2,5 centímetros da ponta intratecal do cateter e avance o cateter para dentro do canal espinhal até que a marcação de dois centímetros no cateter seja visível abaixo do músculo.Quando o cateter estiver no lugar, remova a cânula guia para deixar o cateter e o fio de estomado no lugar. Avance o cateter para dentro do canal espinhal até que a marca de dois centímetros esteja na entrada do canal e retire completamente o fio de estom. O fluido espinhal cerebral pode ser visualizado entrando no cateter implantado.Em seguida, conecte o conjunto do cateter de entrega à extremidade distal do cateter implantado através da extremidade da agulha de calibre 30. Em seguida, carregue 60 microliters de soro fisiológico estéril em uma seringa de 100 microliteres e carregue um bolus de 30 microliters do composto de teste em uma segunda seringa. Conecte a seringa salina à extremidade adaptador de tubulação do conjunto do cateter de entrega e lave 20 microliters de soro fisiológico estéril no espaço intratecal.Quando toda a solução salina tiver sido lavada, substitua a seringa salina pela seringa carregada de bolus e injete 30 microliters do composto de teste no espaço intratecal durante um período de 30 segundos. Quando todo o bolus tiver sido entregue, substitua a seringa carregada de bolus por outra seringa carregada salina e lave o cateter com mais 40 microlitadores de soro fisiológico. Quando o segundo volume de soro fisiológico tiver sido entregue, retire o conjunto do cateter de entrega do cateter implantado e use um par de fórceps de dissecção esterilizados pelo calor muito quente para fixar na tubulação para cortar asepticamente e selar o cateter implantado.Use suturas de monofilamento absorvíveis para fixar o cateter selado a calor no tecido conjuntivo e, em seguida, use suturas nãoabsorbáveis para fechar a pele. Em seguida, use gaze e soro fisiológico para lavar qualquer sangue da pele e coloque o rato em uma incubadora aquecida com monitoramento até a recomposição total. Neste experimento representativo, foi obtido um knockdown muito bom em todas as regiões coletadas após a entrega de oligonucleotídeos de bolonucleotídeo único, como demonstrado.No entanto, algum grau de variabilidade regional foi medido com a medula espinhal apresentando o maior percentual de knockdown. Após uma injeção bem sucedida do oligonucleotídeo antissamo- americano, ou outras terapêuticas, em um modelo apropriado, pode-se avaliar a farmacocinética, a farmacodinâmica e a eficácia da terapêutica.

intrathecal-delivery-antisense-oligonucleotides-rat-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Chen, Y., et al. Entrega intratecal de oligonucleotídeos antisense no sistema nervoso central de ratos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a entrega de um composto de teste no líquido cefalorraquidiano (LCR) por meio de um cateter implantado na coluna vertebral lombar de um modelo de rato. O composto circula ao longo do LCR até o cérebro e a medula espinhal, entra nos neurônios e oferece potencial terapêutico.

Entrega intratecal de um composto de teste ao sistema nervoso central de ratos

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Descreve-se um método para alvejar fármacos para o sistema nervoso central por qualquer implante de um cateter ou realizar uma injecção de bolus no ventrículo lateral direito de ratos. Nós nos concentramos especificamente na entrega de oligonucleotídeos antisense. Esta técnica é facilmente adaptável a outros fármacos e a ratos.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Este relatório descreve uma técnica simples e rápida de punção intratecal para a transfecção localizada de siRNA na medula espinhal lombar em rato sob anestesia luz de curta duração.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Aqui, nós apresentamos um protocolo usando um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada dos ratos para a administração intranasal de uma formulação do peptide-siRNA do cérebro-alvejando permitindo o silenciamento de gene eficaz no sistema nervoso central.

Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega de siRNA intranasal ao sistema nervoso central

O presente protocolo descreve instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em camundongos neonatais para edição gênica e liberação de drogas.

Injeção Intratecal de Camundongos Recém-Nascidos para Edição do Genoma e Liberação de Fármacos

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Este artigo detalha métodos de administração intratecal para terapias direcionadas ao SNC em camundongos adultos, focando na precisão do protocolo e na possibilitade de injeções repetidas. Inclui descobertas de um estudo de validação em que oligonucleotídeos antissenso reduziram a expressão mutante de SOD1 em camundongos modelo SOD1-ALS, apoiando a utilidade da abordagem em pesquisas pré-clínicas sobre doenças neurodegenerativas.

Injeção intratecal lombar de SOD1-ASOs para direcionamento preciso do SNC e eficácia preditiva em camundongos humanos SOD1-G93A ALS

Aprenda a entrega intratecal de oligonucleotídeos antisense no sistema nervoso central de ratos usando implante de cateter. Este método seguro e acessível permite avaliar farmacocinética e eficácia de terapêuticas.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

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