Name: Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a detectar células tumorais circulantes de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústica com nanopartículas de sulfeto de cobre. Este método oferece detecção específica, baixo custo e simplicidade para aplicações clínicas.

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Os autores gostariam de reconhecer Madeleine Howell por sua ajuda com a síntese, Matthew Chest por sua ajuda para projetar o sistema de fluxo, e Ethan Marschall para assistência com SolidWorks.

1. Síntese e Funcionalização de Nanopartículas
NOTA: Síntese do FA-CuS NPs é alcançado usando um método de síntese de um pote adaptado de um protocolo publicado anteriormente21. CUIDADO: Toda a síntese deve ocorrer em uma capa química ventilada da emuman.
<ol><li>Antes da síntese, filtre aproximadamente 300 mL de água desionizada (DI) através de um filtro estéril de 0,2 μm.</li>
	<li>Limpe um frasco de fundo redondo de vidro de 250 mL com uma solução detergente e lave com água DI. Adicione 0,0134 g de CuCl2 em 100 mL de água DI para criar uma solução de 1 mM.</li>
	<li>Adicione 0,015 g de ácido fólico (FA) à solução CuCl2 e mexa por ~ 5 min usando uma barra de agitação magnética.</li>
	<li>Adicionar Na2S·9H2O (0,024 g em 100 μL DI água) mais de aproximadamente 10 s para a mistura de reação utilizando uma pipeta de 200 μL. NOTA: Após a adição do Na2S·9H2O, a solução vai mudar a cor de um amarelo claro para um marrom escuro.</li>
	<li>Tampe a reação e coloque em um banho de óleo, definido como 90 °C, e continue mexendo com uma barra de agitação magnética. Após aproximadamente 15 min, ou quando o banho de óleo atingiu 85 a 90 °C, permita que a reação prossiga por mais uma hora. Sua mistura deve gradualmente girar para uma cor verde escura. NOTA: Certifique-se de desabafar o sistema enquanto aquece a mistura de reação para evitar o acúmulo de pressão.</li>
	<li>Retire o vaso de reação do banho de óleo e arrefecer brevemente à temperatura ambiente por aproximadamente 10 a 15 min antes de se transferir para um banho de gelo.</li>
	<li>Uma vez que a mistura de reação esfriou abaixo de 20 °C, ajuste o pH para 10 utilizando 1M NaOH para dissolver o ácido fólico restante em solução.</li>
	<li>Purifique a mistura de reação FA-CuS usando uma coluna de centrífuga de 30 kDa. Adicione a solução em 15 lotes de mL para a coluna e centrífuga em 3.082 x g para 15 min.</li>
	<li>Uma vez que toda a mistura de reação tenha sido concentrada, recombine as frações concentradas e lave 4x com 15 mL de pH 10 NaOH na coluna de centrifugação de 30 kDa.</li>
	<li>Para medições em massa, pegue 1/3 da solução (~66 μL) e divida em três frascos de vidro. Seco em forno a vácuo durante a noite a 40 °C um vácuo de ~ 27 mmHg.</li>
	<li>Dissolva o outro 2/3 da solução concentrada em 250 μL de PBS e armazene em 4 °C até o uso mais adicional.</li>
	<li>Antes de utilizar o FA-CuS NPs, sonicate-los por 30 minutos em um sonicator banho em uma configuração alta.</li>
</ol>2. Caracterização np
<ol><li>Realize a dispersão dinâmica de luz (DLS) Adicione 10 μL de NPS FA-CuS concentrado na solução PBS do passo 1.1.14 a 2 mL de água DI. Antes da caracterização por DLS, sonicate as partículas para 30 min em um sonicator do banho em um ajuste elevado e filtraa através de um filtro estéril de 0.2 μm para remover a poeira residual.</li>
	<li>Realizar microscopia eletrônica de transmissão (TEM) : Adicione 10 μL de FA-CuS nps concentrado na solução PBS para um pedaço de papel de cera. Inverta uma grade de cobre revestida de formvar na parte superior da gotícula e deixe sentar-se por 2 min. Toque na borda da grade revestida de formvar para um pedaço de papel de filtro para remover o excesso de líquido. Deixe o ar secar. Imagem da grade de cobre utilizando um microscópio eletrônico em uma tensão acelerada de 80 kV. NOTA: Os resultados típicos da caracterização do NPS da FA-CuS são apresentados na Figura 1.</li>
</ol>3. Cultura celular
<ol><li>Este protocolo utiliza células SKOV-3. Salvo indicação em contrário, as células Cultura SKOV-3 no meio 5A de McCoy complementadas com 10% FBS, 100 u/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina, e mantêm-se a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2.</li>
</ol>4. Marcação fluorescente de FA-CuS NPS para microscopia
<ol><li>Adicione o succinimidyl succinimidyl ester do Texas-Vermelho-X (0,2 mg dissolvido em DMSO a uma concentração de 10 mg/mL) a uma solução contendo 2 mg de Fa-CuS NPs em 1 mL de 0,1 M NaHCO3 (pH ~9) buffer.</li>
	<li>Mexa a mistura de reação usando uma barra de agitação magnética por 1 h, longe da luz à temperatura ambiente.</li>
	<li>Concentre a mistura de reação em uma coluna de centrífuga de 4 mL 30 kDa MWCO girando a 4.000 x g por 10 min.</li>
	<li>Lave a solução concentrada 3x com 4 mL de 0,1 M NaHCO3 buffer (pH ~9) em uma coluna de centrífuga. Posteriormente, lave a solução concentrada com 4 mL de água DI 3x ou até que apenas uma quantidade de fluorescência permaneça visível no fluxo por UV-VIS.</li>
</ol>5. FA-CuS NPS Captação por células de câncer de ovário
<ol><li>Antes da incubação com FA-CuS NPs, incubar células SKOV-3 em um frasco T75 com 8-15 mL de hPMI-1640 sem ácido fólico com 10% FBS e 1% penicilina / estreptomicina por pelo menos 24 h.</li>
	<li>Células de sementes em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico a uma densidade de 0,1 x 106 células/mL em uma placa de 24 poços.</li>
	<li>No dia seguinte, incubam células com 400 μg/mL FA-CuS NPS em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico para 2 h.</li>
	<li>Após esta incubação, trippsinizar as células com 0,5 mL de 0,25% de tripsina com EDTA. Adicione pelo menos 1 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico para neutralizar a trippsina e centrífuga as células a 123 x g por 6 min.</li>
	<li>Retire o supernatant, resuspender as células em 2 mL de PBS, e centrífuga em 123 x g para 6 min. Executar este passo de lavagem 2x para remover qualquer NPs desvinculados.</li>
	<li>Resuspenda as células em 1 a 2 mL de PBS com solução tween de 2%.</li>
	<li>Conte as células usando um hemocytometer e trypan azul. Mais células diluídas se a contagem de células for muito alta. Diluir as células em PBS com 2% tween para a concentração escolhida para detecção.</li>
	<li>As células estão agora prontas para serem analisadas pelo sistema PAFC.</li>
</ol>6. Microscopia fluorescência da captação de FA-CuS NPS
<ol><li>Repita etapas listadas na etapa 5.1 e prossiga com o protocolo abaixo para microscopia.</li>
	<li>Células de sementes a uma densidade de 0,1 x 106 células/mL em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico em lábios de vidro em uma placa de 24 poços.</li>
	<li>No dia seguinte, incubam as células com NPs FA-CuS fluorescentemarcados em triplicado, em concentrações de 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL e 400 μg/mL em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico.</li>
	<li>Incubar as células com os NPs por 2 h na incubadora de 37 °C</li>
	<li>Após este período de incubação, lave as células 3x com PBS. NOTA: Para todas as etapas da lavagem, adicione com cuidado a solução no lado da placa do poço para não perturbar as pilhas. Após a adição, incline cuidadosamente a placa e retire a solução do lado do poço.</li>
	<li>Incubar as células com 0,5 mL de 3,7% de paraformaldeído (PFA) na PBS por 15 min e transferir os lábios de vidro para uma nova placa de 24 poços. CUIDADO: PFA é um agente cancerígeno conhecido. Faça toda a fixação em uma capa química ventilada da emumel e desgaste o equipamento protetor pessoal apropriado.</li>
	<li>Incubar as células em uma solução de 3,7% PFA com 0,1% Triton-X em PBS por 5 min.</li>
	<li>Lave as células com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada e transfira os lábios para uma nova placa.</li>
	<li>Incubar as células com 0,5 mL de uma solução PBS contendo DAPI (20 μL/mL de uma solução de estoque de 0,5 mg/mL é usada para coloração) por 5 min, longe da luz.</li>
	<li>Lave as células com PBS 3x.</li>
	<li>Após a lavagem final pbs, montar os coverslips em slides com montagem média.</li>
	<li>As células estão agora prontas para serem imagemdas por microscopia de fluorescência. A figura 2 mostra um exemplo de caracterização celular típica por microscopia de fluorescência.</li>
</ol>7. Arquitetura do sistema de fluxo
<ol><li>Construção da câmara de fluxo NOTA: Um arquivo SolidWorks de um tanque de fluxo impresso em 3D pode ser encontrado nos Materiais Suplementares.<ol>
<li>Usando o arquivo SolidWorks fornecido, impressão 3D do tanque de fluxo usando termoplástico ABS ou plástico PLA. As dimensões são fornecidas abaixo se a SolidWorks não estiver disponível. A Figura 3A mostra uma representação deste modelo. O corpo do tanque de fluxo é de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. As extremidades distantes do tanque de fluxo incluem furos de aproximadamente 5 mm de diâmetro para permitir a entrada de tubos contendo o tubo capilar. NOTA: O tanque de fluxo tem um buraco de 1 cm, perpendicular à orientação do tubo capilar, para a colocação do transdutor de ultra-som. Uma extrusão cilíndrica com o mesmo diâmetro interno que o buraco se estende 6 mm no tanque. Para imagens em tempo real, o tanque de fluxo tem um slot de 1 mm x 3 mm diretamente abaixo do tubo capilar.</li>
		<li>Depois de imprimir o tanque de fluxo 3D, limpe e monte o sistema para uso.</li>
		<li>Coloque os lábios de vidro sobre o slot de 1 mm x 3 mm e o buraco de 1 cm no sistema de fluxo.</li>
		<li>Selar cuidadosamente com silicone para evitar vazamentos.</li>
		<li>Coloque o tubo capilar nos tubos curados de silicone. Insira os tubos na câmara de fluxo, embora o lado do tanque de fluxo de tal forma que o tubo capilar de vidro está diretamente acima e na frente do slot de 3 mm e o buraco de 1 cm.</li>
		<li>Selar a tubulação usando silicone para evitar vazamentos.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração do sistema de fluxo fotoacústico NOTA: Figura 3B e Figura 3C mostram um exemplo da arquitetura do sistema de fluxo.<ol>
<li>Conecte o transdutor a um pulser/receptor do ultra-som. Amplificar o sinal com um ganho de 59 dB.</li>
		<li>Conecte a saída do filtro a um osciloscópio reconfigurável multiuso equipado com uma matriz de portão programável de campo embutido.</li>
		<li>Conecte um dos tubos provenientes da câmara de fluxo a uma junção T, conectada a duas bombas de seringa em cada ramo.</li>
		<li>Encha uma das bombas de seringa com ar e a outra bomba com a amostra a ser analisada. Defina a bomba contendo ar a uma taxa de fluxo de 40 μL/min e a bomba contendo a amostra a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. O fluxo de duas fases resultante produzirá volumes de amostra de 1 μL. Nessa taxa de fluxo, o sistema testará aproximadamente 6,4 amostras por minuto. NOTA: Para manter uma distribuição consistente das células, vórtice levemente cada amostra imediatamente antes de ser testado. Além disso, gire a seringa a cada poucos minutos, a fim de evitar que as células se estabeleçam na solução.</li>
		<li>Conecte o tubo restante que sae do sistema de fluxo a um recipiente com o descorante de 10%, para dispr das pilhas depois que saem do sistema de fluxo. NOTA: Antes de utilizar o sistema de fluxo, verifique se há vazamentos, pois estes podem afetar o fluxo. As células devem ser contidas dentro de um sistema fechado para manter a segurança biológica durante o procedimento.</li>
		<li>O projeto do tanque impresso em 3D permite um alinhamento consistente e repetível entre o transdutor e a luz laser com calibração mínima. Quando colocado corretamente dentro do tanque personalizado, o tubo capilar de quartzo garante que o transdutor e o laser estejam diretamente alinhados.</li>
		<li>Coloque a seção do tubo capilar de quartzo em alinhamento direto com o transdutor, no campo de visão do microscópio, permitindo a colocação cuidadosa da fibra óptica acima da amostra de tal forma que ilumina toda a largura do tubo.</li>
		<li>Irradiar a amostra usando uma fibra óptica canalizando um laser de estado sólido bombeado por diodo operando a um comprimento de onda de 1.053 nm. O incidente da luz laser na amostra e o transdutor usado para medir o efeito fotoacústico são ambos desfocados.</li>
		<li>A energia do incidente do laser na amostra é de aproximadamente 8 mJ e a taxa de laser de 10 Hz é suficiente para iluminar cada amostra várias vezes à medida que passa pelo sistema.</li>
		<li>Coloque o sistema de fluxo em cima de um microscópio invertido e certifique-se de que tanto o pulso de laser quanto o caminho da amostra sejam visíveis à medida que a amostra passa pelo sistema de fluxo. Fluxo de registro usando uma câmera montada no microscópio.</li>
		<li>Registre as aquisições de ultrassom utilizando software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais). Acione o ultra-som e o laser pulsado usando o FPGA. Utilize pbs com 2% tween, e FA-Cus NPs em uma concentração de 100 μg/mL em PBS 2% Tween, como controles negativos e positivos, respectivamente.</li>
		<li>Utilizando uma câmera montada em microscópio, grave o disparo do laser e a passagem de amostras através do sistema de fluxo. Estas gravações serão utilizadas para correlacionar o sinal acústico gravado pelo transdutor com o disparo do laser. À medida que as amostras passam na frente do disparo do laser, o sinal pode então ser correlacionado com o sinal fotoacústico resultante para análise. A uma taxa de amostragem de 10 Hz, o laser iluminará cada plugue várias vezes.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Pós-Processamento
<ol><li>Para cada aquisição de sinal, s(t), calcule a transformação hilbert, H[s(t)], a fim de criar um sinal analítico.</li>
	<li>Crie um envelope complexo, se(t), calculando <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"> a magnitude do sinal analítico, de modo que e integrar o envelope para medir o sinal total resultante de cada aquisição. Compare os sinais de cada grupo de teste (ou seja, PBS, células marcadas, FA-CuS NPs, células sozinhas) utilizando um t-test em software estatístico R. Os sinais fotoacústicos crus e suas transformações de Hilbert são apresentados na figura 4.</li>
	<li>Para a reconstrução de imagens, normalize o envelope complexo com base no pico máximo em toda a execução. Se comparar uma série de corridas, normalize o envelope complexo usando o pico máximo em toda a série. Após a normalização, converta cada aquisição em uma série de valores de pixel. Represente cada série de valores de pixel como uma coluna na reconstrução de imagem. Reconstruções representativas do PBS e os sinais de NPs DA FA-CuS são mostradas na Figura 5,onde ambas as imagens foram normalizadas usando o pico máximo em ambas as corridas.</li>
</ol>

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<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo é um método direto para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC e um agente de contraste CuS alvo. Muitos métodos têm sido explorados para a detecção de CTCs ovarianos, incluindo dispositivos microfluídicos, RT-PCR e citometria fluorescênciafluxo 23,24,25. Estes variam em complexidade, custo e precisão, limitando sua eficácia em ambientes clínicos. A PAFC introduz várias vantagens sobre esses métodos tradicio...

O câncer de ovário é uma das neoplasias ginecológicas mais mortais e resultou em cerca de 184.800 mortes em todo o mundo em 20181. Vários estudos têm mostrado a correlação entre a progressão do câncer de ovário (ou seja, metástase) e a presença de CTCs2,3,4. O método mais comum para detecção e isolamento de CTCs utiliza o sistema Cellsearch, que tem como alvo o receptor EpCam5. Expressão EpCam, no entanto, é downregulated em epitelial para transição mesenchymal, que tem sido implicado na metástase do câncer6. Apesar dos avanços, as tecnologias clínicas atuais ainda sofrem de baixa precisão, alto custo e complexidade. Devido a essas desvantagens, novas tecnologias para a descoberta e enumeração de CTCs ovarianos tornou-se uma área importante para a pesquisa.
Recentemente, a PAFC surgiu como um método eficaz para a detecção não invasiva de células cancerosas, análise de nanomateriais e identificação de bactérias7,8,9. PAFC difere da citometria do fluxo de fluorescência tradicional, detectando anallítos no fluxo, utilizando fotoacústica. O efeito fotoacústico é gerado quando a luz laser é absorvida por um material que causa expansão termoelástica, produzindo uma onda acústica que pode ser detectada por um transdutor de ultrassom10,11. As vantagens da PAFC em relação aos métodos tradicionais de citometria de fluxo incluem simplicidade, facilidade de tradução para ambientes clínicos e a detecção de CTCs em profundidades sem precedentes nas amostras de pacientes12,13. Estudos recentes têm utilizado sistemas de PAFC para a detecção de células usando contraste endógeno e exógeno14,15. Agentes de contraste de absorção de luz próximos ao infravermelho (NIR), como corante verde de indocianina, e NPs metálicos (por exemplo, ouro e CuS) têm sido usados para a rotulagem seletiva de células e tecidos em combinação com imagens fotoacústicas16,17,18. Devido à profundidade melhorada da penetração da luz nir dentro dos tecidos biológicos, a detecção fotoacústica de absorventes pode ser realizada em maiores profundidades para aplicações clínicas. Devido ao seu grande potencial de utilização na clínica, a combinação de agentes de contraste nir alvo com PAFC tem gerado um interesse considerável para a detecção de CTCs.
A PAFC em combinação com agentes de contraste direcionados fornece uma abordagem melhorada para análise de alta taxa de taxa de taxa de avaliação de amostras de pacientes com maior precisão e detecção direcionada de CTCs. Uma das principais estratégias de detecção para CTCs é a segmentação específica das proteínas de membrana presentes na célula de interesse. Uma característica notável dos CTCs ovarianos é a superexpressão dos receptores de folato localizados em sua membrana externa19. A segmentação do receptor de folato é uma estratégia ideal para a identificação de CTCs ovarianos no sangue porque as células endógenas, que têm maior expressão de receptores de ácido fólico, são geralmente luminais e têm exposição limitada à corrente sanguínea20. NPs sulfeto de cobre (CuS NPs) foram recentemente reconhecidos por sua capacidade de atingir receptores de folato expressos em células cancerosas21. Combinados com sua biocompatibilidade, facilidade de síntese e absorção profunda no NIR, esses agentes de contraste np fazem uma estratégia de segmentação ideal para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC.
Este trabalho descreve a preparação de FA-CuS NPs e seu uso para a detecção de células cancerosas ovarianas em um sistema de fluxo fotoacústico. Os PNNs CuS são modificados com ácido fólico para atingir especificamente CTCs ovarianos e emitem um sinal fotoacústico quando estimulados com um laser de 1.053 nm. Os resultados indicam a detecção bem sucedida de células cancerosas ovarianas incubadas com esses agentes de contraste fotoacústico dentro do sistema PAFC. Estes resultados mostram a detecção de células cancerosas ovarianas até concentrações de 1 célula/μL, e microscopia fluorescência confirma a captação bem sucedida dessas partículas por células cancerosas ovarianas SKOV-322. Este trabalho fornece uma descrição detalhada da síntese fa-cus nps, preparação de amostras para microscopia de fluorescência, construção do sistema de fluxo fotoacústico, e a detecção fotoacústica de células cancerosas ovarianas. O método apresentado mostra a identificação bem sucedida de CTCs ovarianos no fluxo que utiliza FA-CuS NPs. O trabalho futuro centrar-se-á sobre a aplicação clínica desta tecnologia para a deteção adiantada da metástase ovariana do cancro.

<table><tbody><tr><td>0,025% de tripsina com EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m Unidade de filtração a vácuo de 1.000 mL</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>Para filtrar grandes volumes de água DI.</td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtro de seringa estéril</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr>Tanque <td></td><td>impresso em 3D</td><td>Cartão de aquisição feito sob medida</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8 canais, 14 bits</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>Detergente usado para limpar vidraria.</td></tr><tr><td>Filtros Centrífugos Amicon Ultra-15 Filtros Centrífugos</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4</td><td>Hematocitômetro Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cobre(II)</td><td>ACROS ORGANICS</td> Objetivo <td>de</td> Acoplamento 206532500 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>LMH-10x-532</td><td>Para acoplar luz pulsada para fibra óptica.</td></tr><tr><td>Estágio de acoplamento</td><td>Newport</td><td>F-91-C1-T</td><td>Estágio para acoplamento de luz pulsada à objetiva. Contém FP-1A e LMH-10x-532</td></tr><tr><td>CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath</td><td>Fisherbrand</td><td>Modelo CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de dados</td><td>National Instruments</td><td>NI LabVIEW 2017 (32 bits)</td> <td>LabVIEW usado para sincronizar pulsos de laser com aquisição de dados.</td></tr><tr><td>Software de Processamento de Dados</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Reconstruções e gráficos produzidos com o software Matlab.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mandril de Fibra</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td>Usado para segurar a fibra nua.</td></tr><tr><td>Acoplador de fibra</td><td>Newport</td><td>FP-1A</td><td>Estágio de 3 eixos para posicionar o mandril de fibra e a fibra óptica no foco da objetiva.</td></tr><tr><td>Ácido Fólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Revestido TEM Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF300--SB</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject Seringas de 10 mL</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Fibra Óptica</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>Usado para expor a amostra à luz pulsada.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Laser Pulsado</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>Fonte de laser pulsado com especificações 1053 nm, pulso de 8 ns, máximo de 10 Hz.</td></tr><tr><td>Pulsador/Receptor</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>Recebe, filtra e amplifica sinais fotoacústicos. Operado com ganho de 59 dB.</td></tr><tr><td>Instrumento de Tubo Capilar de Quartzo</td><td></td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) Livre de Ácido Fólico</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 Células</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de Hidróxido de Sódio</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfeto de Sódio Nonahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Bombas</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl éster</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>Detector de ultrassom com frequência central de 50 MHz e largura de banda fracionada de -6 dB de 82%.</td></tr><tr><td>Solução azul de Trypan 0,4%</td> <td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrassom</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>Aquasonic 100</td><td>Gel de ultrassom para acoplamento de transdutor</td></tr></tbody></table>

detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Muitos estudos sugerem que a enumeração das células tumorais circulantes (CTCs) pode mostrar a promessa como uma ferramenta prognóstico para o câncer de ovário. As estratégias atuais para a detecção de CTCs incluem citometria de fluxo, dispositivos microfluídicos e reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR). Apesar dos avanços recentes, os métodos para a detecção da metástase precoce do câncer de ovário ainda não têm a sensibilidade e especificidade necessárias para a tradução clínica. Aqui, um novo método é apresentado para a detecção de células tumorais circulantes ovarianas por citometria de fluxo fotoacústico (PAFC) utilizando um sistema impresso tridimensional personalizado (3D), incluindo uma câmara de fluxo e uma bomba de seringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfeto de cobre tampados com ácido fólico (FA-CuS NPs) para atingir células cancerosas ovarianas SKOV-3 pela PAFC. Este trabalho demonstra a afinidade destes agentes de contraste para pilhas ovarianas do cancro. Os resultados mostram caracterização de PN, detecção de PAFC e captação de NP por microscopia de fluorescência, demonstrando assim o potencial deste novo sistema para detectar CTCs ovarianos em concentrações fisiologicamente relevantes.

A Figura 1A mostra uma imagem TÍPICA DE TEM das nanopartículas sintetizadas. O tamanho médio da nanopartícula típica é de aproximadamente 8,6 nm ± 2,5 nm. A medição de nanopartículas foi realizada no ImageJ. As funções do ponto inicial e da bacia hidrográfica foram aplicadas para separar as partículas para medição. Os diâmetros horizontais e verticais de cada partícula foram medidos perpendiculares uns aos outros e mais em média. Para dls, um...

Um protocolo é apresentado para detectar células tumorais ovarianas circulantes utilizando um sistema de fluxo fotoacústico feito medida e nanopartículas de sulfeto de cobre cobertas de ácido fólico.

Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

As atuais medidas clínicas de detecção de câncer de ovário são inespecíficas e faltam pontos de detecção de cuidados de células tumorais circulantes. Nosso sistema de fluxo fotoacoustic permite testar amostras de pacientes para marcadores específicos de câncer de ovário na corrente sanguínea. Este procedimento fornece uma tecnologia de plataforma única com melhorias em relação às técnicas atuais em termos de simplicidade, baixo custo, limites promissores de detecção e capacidade de ser aplicado a aplicações amplas.Através deste trabalho, pretendemos construir a partir do nosso sistema de nanopartículas direcionadas para câncer de ovário para testar amostras de pacientes ex vivo para CTCs. Este sistema PAFC altamente versátil é capaz de expandir para uso clínico, testando a presença de uma ampla gama de biomarcadores no sangue. O alinhamento óptico adequado é fundamental para a detecção de alvos dentro do sistema de citometria de fluxo fotoacâmico.Além disso, para garantir o acoplamento acústico adequado, certifique-se de que não há bolhas entre o escorregador de vidro e o transdutor. Devido à natureza personalizada do sistema de fluxo e seus componentes, a visualização do método é benéfica para uma reprodução precisa. Em uma capa de fumaça química ventilada, filtrar aproximadamente 300 mililitros de água deionizada através de um filtro estéril de 0,2 micrômetros.Adicione 0,0134 gramas de cloreto de cobre e 100 mililitros de água deionizada a um frasco fundo redondo limpo de 250 mililitros para criar uma solução de cloreto de cobre mililitro. Adicione 0,015 gramas de ácido fólico ao frasco e use uma barra de mexiça magnética para misturar a solução por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, misture 0,024 gramas de nonahidrato de sulfeto de sódio com 100 microliters de água deionizada.Use uma pipeta de 200 microliter para adicionar lentamente esta solução à mistura de reação durante uma duração de aproximadamente 10 segundos. Tampe a nave de reação. Coloque o navio em um banho de óleo a 90 graus Celsius e continue mexendo.Após aproximadamente 15 minutos ou quando o banho de óleo atingiu a faixa de temperatura entre 85 e 90 graus Celsius, permita que a reação prossiga por mais uma hora. Quando a reação estiver completa, remova o recipiente de reação do banho de óleo e deixe esfriar à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos antes de transferi-lo para um banho de gelo. Uma vez que a reação seja resfriada, ajuste o pH para aproximadamente 10 usando um hidróxido de sódio molar.Adicione a mistura a uma coluna centrífuga de 30 quilodalton em lotes de 15 mililitros e centrífuga a 3.082 vezes g por 15 minutos para purificar a mistura de reação. Primeiro, misture as nanopartículas de sulfeto de cobre com ácido fólico na concentração adequada em mídia RPMI fresca. Adicione esta solução de nanopartículas a cada poço da placa preparada de 24 poços que contém células SK-OV-3 a uma concentração de 400 microgramas por mililitro.Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas horas. Depois disso, experimentpsinize as células com 0,5 mililitros de 0,25% de trippsina e EDTA. Para neutralizar a trippsina, adicione pelo menos um mililitro de RPMI 1640 sem ácido fólico e centrifuge as células a 123 vezes g por seis minutos.Para lavar as células, remova o supernaspeico, resuspenja as células em dois mililitros de PBS e centrífuga a 123 vezes g por seis minutos. Repita esta etapa de lavagem duas vezes para remover quaisquer nanopartículas não ligadas. Em seguida, resuspende as células com um a dois mililitros de uma solução de 2%Tween em PBS.Conte as células usando um hemócito e o Trypan Blue. Diluir as células em uma solução de 2% Tween em PBS para a concentração escolhida para detecção. Use o arquivo STL tridimensional fornecido para imprimir em 3D o tanque de fluxo com plástico termoplástico ABS ou PLA.Depois de imprimir o tanque, limpe e monte o sistema para uso. Coloque tampas de vidro sobre a ranhura de um milímetro por três milímetros e o buraco de um centímetro no sistema de fluxo e lacre cuidadosamente com silicone para evitar vazamentos. Em seguida, coloque o tubo capilar nos tubos curados de silicone.Insira os tubos na câmara de fluxo através do lado do tanque de fluxo de tal forma que o tubo capilar de vidro esteja diretamente acima e na frente da ranhura de três milímetros e do buraco de um centímetro. Sele a tubulação com silicone. Em seguida, conecte o transdutor a um pulsar e receptor de ultrassom.Amplie o sinal com um ganho de 59 decibéis. Conecte a saída do filtro a um osciloscópio reconfigurável multiuso equipado com uma matriz de portão programável de campo embutido. Conecte um dos tubos provenientes da câmara de fluxo a uma junção T que está conectada a duas bombas de seringa em cada ramo.Encha uma das bombas de seringa com ar e a outra bomba com a amostra a ser analisada. Coloque a bomba contendo ar a uma taxa de fluxo de 40 microliters por minuto e coloque a bomba contendo a amostra para uma taxa de fluxo de 20 microliters por minuto. Em seguida, conecte o tubo restante que sai do sistema de fluxo a um recipiente de 10% de alvejante para descartar células depois que elas saírem do sistema de fluxo.Coloque a seção do tubo capilar de quartzo em alinhamento direto com o transdutor na visão de campo do microscópio para permitir a colocação cuidadosa da fibra óptica acima da amostra de tal forma que ilumine toda a largura do tubo. Irradie a amostra usando uma fibra óptica canalizando um laser de estado sólido bombeado por diodo operando a um comprimento de onda de 1.053 nanômetros. Use uma câmera montada no microscópio para registrar o fluxo, o disparo do laser e a passagem de amostras através do sistema de fluxo.Neste estudo, a citometria de fluxo fotoacústico e o agente alvo de sulfeto de cobre alvo são usados para detectar células tumorais de circulação ovariana. Uma imagem típica de TEM das nanopartículas sintetizadas mostra que o tamanho médio de uma nanopartícula típica é de aproximadamente 8,6 nanômetros. Os diâmetros horizontais e verticais de cada partícula são então medidos perpendiculares entre si e mais mediados.O diâmetro hidrodinâmico médio dessas partículas é de 73,6 nanômetros. As nanopartículas de sulfeto de cobre têm uma curva de absorção característica que se estende até o infravermelho próximo. Há um pequeno artefato em torno de 850 nanômetros que é causado pela troca de lasers pelo espectrômetro.Imagens de microscopia de fluorescência de células incubadas com nanopartículas fluorescentes marcadas mostram que a absorção de nanopartículas pode ser visualizada pela presença de fluorescência em toda a célula. Células não incubadas com nanopartículas não mostram sinal fluorescente. A presença deste sinal fluorescente indica a absorção bem sucedida das partículas e sua capacidade de serem detectadas no sistema de fluxo.Exemplos de sinais típicos de aquisição de dados são mostrados aqui. Os dados brutos indicam as diferenças de sinal entre as células marcadas por nanopartículas, PBS e nanopartículas de sulfeto de cobre com ácido fólico. Utilizando a visão de laboratório personalizada e o software MATLAB, as reconstruções de imagem são feitas dos controles positivos e negativos em tempo real e pós-aquisição, respectivamente.Os envelopers individuais são posteriormente convertidos em valores de pixel e exibidos como colunas independentes. Diferenças claras no sinal fotoacústico ocorrem entre PBS e as nanopartículas de sulfeto de cobre com ácido fólico a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Durante este procedimento, é fundamental alinhar adequadamente o transdutor de ultrassom, microscópio e fibra óptica dentro do sistema de citometria de fluxo fotoacústico.Confirme o alinhamento do sistema testando controles positivos e negativos. Devido à versatilidade das técnicas de segmentação fotoacoustica e à ampla gama de aplicações possíveis utilizando PAFC, essa técnica abre caminho para aplicações clínicas e de pesquisa de importância transtracional. Para garantir a aplicação clínica, novos estudos devem focar no teste de amostras de pacientes e na redução das etapas processuais.A síntese das nanopartículas deve ocorrer em um capô de fumaça química utilizando o equipamento de proteção adequado. As linhas de células humanas devem ser tratadas de acordo com as diretrizes da sua instituição. O uso do laser requer treinamento de segurança de radiação e EPI apropriado.O uso de laser e os testes fotoacâmicos só devem ser realizados por pessoal altamente treinado.

ovarian-cancer-detection-using-photoacoustic-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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