Name: Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a visualizar Candida albicans no trato gastrointestinal murino usando hibridização in situ fluorescente. Este método permite estudar a morfologia e localização do fungo em seu ambiente natural sem perturbar as interações tridimensionais.

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Os autores gostariam de agradecer carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg, e KC Huang para a orientação em desenvolver a técnica do PEIXE. Teresa O'Meara forneceu comentários úteis sobre o manuscrito, e Miriam Levy ajudou com a fotografia. Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede R01AI108992, R01DK113788, e um Burroughs Welcome Award na Patogênese de Doenças Infecciosas.

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Bacher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Anti-fungal+Th17+Immunity+and+Pathology+Rely+on+Cross-Reactivity+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans.</a> Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).</li>
<li>Shao, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Candida+albicans+Positively+Calibrates+Systemic+Th17+Immunological+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).</li>
<li>Jiang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Fungi+Recapitulate+the+Protective+Benefits+of+Intestinal+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).</li>
<li>Iliev, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+Commensal+Fungi+and+the+C-Type+Lectin+Receptor+Dectin-1+Influence+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis.</a> Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1+alpha+and+LL-37+by+Commensal+Bacteria+Inhibits+Candida+Albicans+Colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization.</a> Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Damage+and+Neutropenia+Are+Required+for+Candida+Albicans+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination.</a> PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>Yamaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Colonization+of+Candida+Albicans+Differs+in+Mice+Fed+Commercial+and+Purified+Diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets.</a> Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).</li>
<li>Kadosh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Antifungal+Treatment+in+a+Diet-Based+Murine+Model+of+Disseminated+Candidiasis+Acquired+via+the+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).</li>
<li>Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Fungal+Infections%3A+Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+and+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment.</a> Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).</li>
<li>Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Through+the+Mammalian+Gut+Triggers+a+Phenotypic+Switch+That+Promotes+Candida+Albicans+Commensalism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism.</a> Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).</li>
<li>Witchley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Morphogenesis+Programs+Control+the+Balance+between+Gut+Commensalism+and+Invasive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).</li>
<li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+Cell-Mediated+Immunity+in+Candida+Albicans-Colonized+Gnotobiotic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice.</a> Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).</li>
<li>Guarner, J., Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+Diagnosis+of+Fungal+Infections+in+the+21st+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).</li>
<li>Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+Mucus+in+Histological+Sections%2C+Immunostaining+of+Mucins+in+Fixed+Tissue%2C+and+Localization+of+Bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+and+Composition+of+the+Mucosal+Flora+in+Patients+with+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Amino+Acid+Liquid+Synthetic+Medium+for+the+Development+of+Mycelial+and+Yeast+Forms+of+Candida+Albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Sabouraudia%22%5BJournal%5D)">An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans.</a> Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).</li>
<li>Banerjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UME6%2C+a+Novel+Filament-Specific+Regulator+of+Candida+Albicans+Hyphal+Extension+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Gut+Microbiota+Spatial+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Microbiota+Dysbiosis+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD.</a> Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método descrito aqui permite a visualização de c. albicans leveduras e híteros nos tratos GI de camundongos colonizados commensally de qualquer sexo ou tensão. A sonda FISH hibridiza para 23S rRNA, que é distribuído por todo o citoplasma fúngico. Nosso método foi adaptado de um protocolo previamente relatado para visualizar as bactérias do intestino20. Como os c. albicans alteram sua morfologia dentro do hospedeiro, o método é útil para monitorar a forma das células fúngicas, bem como a localização. Por exemplo, usamos este método para refutar a hipótese de que as leveduras predominam em todo o trato digestivo, e para expor discrepâncias entre os fenótipos in vivo e in vitro de certos mutantes "defeituosos de filamento"12.
Existem vários modelos de camundongos para a colonização c. albicans commensal. A microbiota de camundongos e humanos de laboratório é distinta e, em camundongos, o uso de antibióticos ou uma dieta especializada é necessário para estabelecer a colonização estável. O tratamento com antibióticos também melhora a colonização de seres humanos em C. albicans e é um importante fator de risco para a doença10disseminada. Os antibióticos utilizados neste estudo são relativamente baratos e produzem diminuições confiáveis na microbiota bacteriana. Note-se que os antibióticos são usados para diminuir a carga de espécies bacterianas antagônicas, não para eliminar todas as bactérias dos animais. Se os pesquisadores desejam estudar c. albicans-host interações na ausência de bactérias ou para evitar o uso de antibióticos ou uma dieta especial, animais livres de germes podem ser substituídos por animais criados convencionalmente; no entanto, camundongos gnotobióticos exibem certas anormalidades imunes e anatômicas e, portanto, podem não ser adequados para todos os fins.
Várias etapas são importantes para a coloração bem sucedida de PEIXES: O método de fixação recomendado é fundamental para preservar a integridade estrutural dos tecidos GI, particularmente o conteúdo frágil do lúmen do intestino, como a camada de muco e o tridimensional organização de fungos e bactérias16. Por favor, note que muitas soluções de fixação comumente usadas que contêm água são altamente prejudiciais para a arquitetura luminal. Os fixativos e soluções para lavandes pós-fixação recomendados neste protocolo não contêm água, e é importante evitar a contaminação com água. Outro passo crítico é o passo de hibridização, onde é importante evitar a evaporação da solução de hibridização durante a incubação de slides no forno de hibridização. Sugerimos colocar os slides em um recipiente à prova d'água para evitar esse problema. Alternativamente, pode-se usar câmaras de hibridização estanques, como as originalmente usadas para hibridização de microarrays.
Uma sonda DE PEIXEs específica c. albicansé descrita nesteprotocolo. No entanto, como muitos camundongos criados em laboratório não contêm c. albicans ou outros fungos como parte de sua microbiota intestinal natural, uma sonda panfúngica pode especificamente manchar c. albicans em animais experimentalmente colonizados. A substituição de uma sonda panfúngica pode ser desejável devido às suas características superiores de hibridação e maior proporção de sinal/ruído. Se a sonda panfúngica é usada como uma sonda pseudoespecífica para C. albicans,é importante documentar a falta de coloração em animais não infectados (ou seja, tratados com antibióticos, mas não c. albicans). A coloração de um animal de controle não colonizado também é útil para avaliar a coloração de fundo que pode resultar da adesão de sondas DE PEIXE a partículas alimentares. No geral, o uso de sondas FISH oferece maior especificidade sobre a maioria dos outros métodos de coloração de fungos, como o branco Calcofluor (que mancha a quitina, um componente de parede celular que pode variar entre tipos de células), GMS ou anticorpos antifúngicos comercialmente disponíveis. Além disso, a coloração de PEIXEs permite a costaining de organismos múltiplos usando sondas FISH diferencialmente rotuladas para rRNAs específicos de espécies.
Uma ressalva desta técnica é que certos tipos de células de levedura c. albicans parecem muito semelhantes por PEIXE (por exemplo, os tipos opacos e de células GUT). Para distinguir entre esses tipos de células, seria útil desenvolver sondas de hibridização para mRNAs fúngicos específicos do tipo celular. No entanto, em sua forma atual, a técnica FISH já revelou discrepâncias surpreendentes entre os comportamentos in vivo e in vitro dos mutantes de C. albicans avaliados em ambas as condições12,indicando interações complexas no ambiente natural comensal que não são adequadamente imitados por ensaios in vitro existentes. Mais estudos de diferentes manchas de C. albicans em tipos selvagens adicionais e hospedeiros mutantes provavelmente produzirão insights adicionais sobre interações fúngicas-hospedeiros. Em particular, será instrutivo para o perfil C. albicans em modelos de doença inflamatória intestinal, que está associado com alto titers de C. albicans em seres humanos21, e outros modelos de C. albicans crescimento excessivo e doença. A técnica fish também pode ser combinada com imunohistoquímica para manchar células hospedeiras específicas. No geral, o método apresentado aqui fornece um meio razoavelmente rápido e confiável para determinar a localização e morfologia de C. albicans dentro do trato gastrointestinal de mamíferos.

Candida albicans é um commensal fúngico, bem como um patógeno humano oportunista. Este fermento carece de um nicho ambiental definido e, em vez se propaga dentro do trato gastrointestinal (GI), pele e trato geniturinário de seres humanos e outros mamíferos1. Considerando que as primeiras pesquisas sobre C. albicans se concentraram principalmente em seu potencial de virulência, vários relatórios recentes sugerem que a propagação de organismos commensally dentro do intestino pode desempenhar papéis importantes na saúde normal, incluindo o desenvolvimento imunológico do anfitrião2,3,4. Para facilitar as investigações do commensalismo de C. albicans dentro do intestino de mamíferos, desenvolvemos um modelo de camundongo de colonização gi estável e um método baseado em hibridização de fluorescência in situ (FISH) para visualizar células fúngicas de levedura e hícina dentro do lúmen intestinal.
Com algumas exceções5,os ratos laboratório-produzidos exibem tipicamente a resistência à colonização fungosa do intervalo digestivo. Acredita-se que a resistência à colonização seja mediada por espécies bacterianas específicas; no entanto, isso pode ser superado pelo tratamento dos animais com antibióticos6,7 ou uso de uma dieta quimicamente definida que, presumivelmente, altera a composição de espécies bacterianas8,9. Da mesma forma, em seres humanos, o uso de antibióticos de amplo espectro tem sido associado com c. albicans supercrescimento e disseminação10. Nosso modelo de colonização de urina usa antibióticos de amplo espectro para estabelecer a colonização de camundongos imunocompetentes e criados convencionalmente. Penicilina e estreptomicina são fornecidos na água potável dos animais por uma semana antes do gavage com 108 colônias formando unidades (CFUs) de C. albicans. Enquanto a água infundida com antibióticos for continuada, os c. albicans se propagarão através do trato gastrointestinal, atingindo titers fecais de 106-108 CFUs/g. Apesar do alto nível de colonização fúngica, os animais permanecem saudáveis e ganham peso na mesma taxa que os controles não infectados. Este modelo tem sido usado com sucesso para rastrear e caracterizar vários c. albicans commensalism fatores11,12.
Como outros membros do reino fúngico, C. albicans é capaz de plasticidade morfológica enorme13. condições in vitro, tem sido mostrado para a transição entre pelo menos seis tipos unicelulares de células de levedura, bem como hída multicelular e pseudohída. A transição de levedura para híha é um de seus atributos de virulência mais caracterizados, e a hifenha e pseudohhmeu predominam na maioria dos modelos de doenças de mamíferos, bem como em tecidos humanos infectados. Para determinar a localização de C. albicans e a morfologia celular dentro do trato digestivo murine, desenvolvemos uma técnica de PEIXE para colorir leveduras e hícinas em seções histológicas fixas. As sondas consistem em oligonucleotídeos de DNA com rótulo fluorescente que hibridizam o RNA ribossômico 23S (rRNA), que é distribuído por todo o citoplasma fúngico. Como os tecidos hospedeiros são fixados de uma forma que preserva a arquitetura tridimensional do intestino, incluindo a mucosa hospedeira, material digestivo, a microbiota bacteriana e o muco dentro do lúmen intestinal, esta técnica permite a localização de fungos células com relação a estes marcos quando manchado. A técnica FISH compara favoravelmente às manchas histológicas tradicionais para fungos, como o ácido periódico Schiff (PAS) ou a Methenamina-Prata (GMS) de Gomori, bem como anticorpos antifúngicos comercialmente disponíveis, porque esses reagentes não são específicos para C. albicans. Além disso, os fixativos padrão remover a camada de muco e perturbar outros conteúdos do intestino lumen14,15.
Neste artigo, fornecemos instruções detalhadas para o estabelecimento de alta qualidade C. albicans colonização do trato GI do rato, para dissecação do trato digestivo de animais eutanasiados, para fixação de tecidos de uma forma que preserva luminal arquitetura, e para a detecção de C. albicans dentro de tecidos hospedeiros usando PEIXE. Além do tipo selvagem e cepas mutantes de C. albicans, a técnica de gavage pode ser usada para entregar outros microorganismos. A técnica de fixação seria útil para qualquer estudo em que a preservação do conteúdo intestinal é desejada. O procedimento fish pode ser concluído dentro de um dia e pode ser usado para localizar várias espécies fúngicas usando várias sondas com rótulo diferencial.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td>pode ser substituída por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>O ágar</td><td></td><td></td> sangue BHI <td>pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>C. albicans Sonda FISH</td><td>IDT DNA</td><td>Technologies</td><td></td>encomenda personalizada</tr><tr><td>Câmara para hibridização incubação</td><td></td><td></td><td>câmara estanque destinada a reduzir a evaporação</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>>=99,5%</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>pode ser substituído por qualquer fornecedor Tecidos de</td></tr><tr><td>limpeza de tarefas delicadas</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Agulhas de alimentação</td><td>Cadência, Inc.</td><td>7910</td><td>metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; pode ser autoclavado para esterilizar</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>outros fluoróforos disponíveis</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>outros fluoróforos disponíveis Almofadas</td></tr><tr><td>de espuma</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>Encomende almofadas de espuma que se encaixam dentro de</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>reagente ACS, > = 99,5%</td></tr> <tr><td>Frasco de vidro Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>comporta até 10 slides costas com costas</td></tr><tr><td>de histologia</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>profundos para que o ceco não seja esmagado</td></tr><tr><td>Lamínulas de hibridização</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>Forno</td></tr> <tr><td></td><td>de hibridização sem RNase</td><td></td><td>pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td><td>pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Lee's media</td><td></td><td></td><td>preparado conforme descrito em Lee et al. 1975</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>reagente ACS, >=99,8%</td></tr><tr><td>Camundongos</td><td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>adulto BALB/c; 18-21 gramas (8-10 semanas)</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>16% solução</td></tr><tr><td>Cera de parafrabina</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Paraplast para incorporação de tecidos</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Unidade de produção de mídia da instalação de cultura de células UCSF</td><td>CCFAL003</td><td>cálcio, sem magnésio; pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud dextrose ágar</td><td></td><td></td><td>pode ser Cloreto</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de sódio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>pode ser substituído por qualquer fornecedor; manter</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td> livre de RNase <td>pode ser substituído por qualquer fornecedor; manter Estreptomicina Sigma</td></tr><tr><td></td><td></td><td>S9137-100G</td> <td>livre de RNase</td></tr><tr><td>A caneta Super PAP</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>pode ser substituída por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>pode ser substituída por qualquer fornecedor; manter Vectashield livre de RNase</td></tr><tr><td></td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>não contém</td></tr><tr><td>DAPI Xilenos</td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>grau de reagente</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td><td>pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr></tbody></table>

visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans é um componente fúngico da microbiota intestinal em seres humanos e muitos outros mamíferos. Embora os albicans de C. não causem sintomas em a maioria de anfitriões colonizados, o reservatório do commensal sere como um repositório para a doença infecciosa, e a presença de titers fungosos elevados no intestino é associada com a doença de entranhas inflamatório. Aqui, descrevemos um método para visualizar a morfologia e localização de células c. albicans em um modelo de camundongo de colonização gastrointestinal estável. A colonização é estabelecida usando uma única dose de C. albicans nos animais que foram tratados com os antibióticos orais. Segmentos de tecido intestinal são fixados de uma forma que preserva a arquitetura de conteúdo luminal (microorganismos e muco), bem como a mucosa hospedeira. Finalmente, a hibridização in situ fluorescente é realizada usando sondas contra rRNA fúngico para manchar para C. albicans e hícina. Uma vantagem chave deste protocolo é que permite a observação simultânea da morfologia da pilha de C. albicans e de sua associação espacial com as estruturas do anfitrião durante a colonização gastrintestinal.

Seguindo as instruções fornecidas, o resultado desta técnica será a rotulagem fluorescente dos núcleos no epitélio hospedeiro, muco e c. albicans em tecidos gastrointestinados seccionados. As células abicans candida do tipo selvagem devem aparecer como células de levedura redondas e unicelulares ou células de levedura altamente alongadas, às vezes ramificadas, de hídinas multicelulares (divisões célula-célula não será aparente na pasta). Mutantes de C. albicans podem adicionalmente aparecer como leveduras "cinzentas" menores, ligeiramente alongadas ou tão maiores, ligeiramente alongadas "GUT" (transição induzida por gastrointestinais) ou leveduras "opacas".
Figura 1 retrata a agulha de alimentação usada para gavage oral, bem como posições-chave da agulha durante o procedimento gavage. A figura 2 fornece uma configuração típica usada para a dissecação do órgão e a aparência de segmentos do GI do rato.
A figura 3 exibe coloração de PEIXE de diferentes tipos de células c. albicans após propagação in vitro e dentro do modelo do mouse. A Figura 3A mostra fluorescência e imagens de fase de pasta fixa, permeabilizada e propagada in vitro. A formação de hídvais foi induzida com o líquido de Lee médio18 com 2% N-acetilglucosamina, pH 6,8 a 37 °C. A Figura 3B mostra fluorescência e imagens de fase de células de levedura fixas, permeabilizadas e in vitro. A Figura 3C,D mostra células INTESTInais fixas, permeabilizadas, in vitro e células opacas, respectivamente. Intestino e tipos de células opacas são morfologicamente indistinguíveis, exceto quando visualizados pela microscopia eletrônica de varredura. Por favor, note que a coloração de peixede células in vitro propagadas será subótima se as células não estiverem bem permeabilizadas. Um exemplo de coloração fraca e difusa é mostrado na Figura 3C. Para obter melhores resultados, as condições de fixação celular e permeabilização devem ser determinadas empiricamente para que cada tipo de célula e espécie seja investigada. Felizmente, o protocolo recomendado para visualizar c. albicans em tecidos seccionados produz permeabilização mais consistente.
Figura 3E-G retratam C. albicans em intestinos grossos do rato, manchados com o C. albicans-sonda específica(Figura 3E)ou a sonda panfúngica(Figura 3F,G). C. albicans aparece vermelho nestas imagens, os núcleos da pilha do anfitrião são azuis, e a camada do muco é verde. Tanto as leveduras redondas quanto a pasta altamente alongada (pontas de flechas brancas) ocorrem no intestino grosso. Por favor, note que a coloração é mais brilhante com a sonda panfúngica. Figura 3G retrata um mutante ume6 no mesmo compartimento, manchado com a sonda panfúngica. Ume6 codifica um fator de transcrição que é necessário para a formação de hídvais em condições in vitro19 . Curiosamente, o fenótipo de fermento bloqueado exibido por este mutante em condições in vitro não é recapitulado dentro do intestino, sugerindo que um fator redundante deve ser ativado dentro do host12. Figura 4 retrata a aparência do tipo selvagem C. albicans em diferentes segmentos do trato gastrointestinal murine, incluindo as regiões imediatamente adjacentes à mucosa hospedeiro e regiões mais centrais do intestino lumen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> Figura 1: Principais posições de agulha de alimentação durante gavage. (A)Agulha de alimentação. (B)Alimentação agulha bola inserida para o lado da língua. (C)Agulha de alimentação na posição vertical com inserção no esôfago. (D)Agulha de alimentação inserida no estômago com alguns milímetros visíveis acima do nariz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo layout de dissecação. (A)Bloco de dissecação e ferramentas. (B) Trato GI extiruque. Proximal (esôfago) para seções distal (ânus): I. Estômago. II. Intestinos delgados proximal. III. Intestinos delgados mediais. Intestinos delgados distal. V. Cecum. VI. Intestino grosso. As caixas de beira tracejadas cor-de-rosa indicam os tecidos a ser reparados. (C)Tecidos posicionados em. Algarismos romanos são os mesmos que no painel B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> Figura 3: Imagens representativas de C. albicans manchadosdePEIXE. (A)PEIXE de C. albicans hyphae cultivados na mídia líquida de Lee18 com 2% n-acetilglucosamina, pH 6.8. (B) PEIXE de C. albicans células de levedura redondas cultivadas em YEPD + 2% placas de ágar. (C)PEIXE de C. albicans células GUT (ySN1045) cultivadas em Placas De YEPD + 2% ágar. (D)PEIXE de C. albicans células opacas cultivadas em YEPD + 2% placas de ágar. (E)Wild tipo C. albicans (ySN250) no intestino grosso, manchado com o C. albicans-sonda específica. (F)Wild tipo C. albicans no intestino grosso, manchado com a sonda panfúngica. (G) Ume6 mutante (ySN1479) no intestino grosso, manchado com a sonda panfúngica: vermelho é C. albicans,azul é núcleos epiteliais hospedeiros, e verde é mucin. As pontas das flechas indicam hifa. Flechas indicam levedura. Barras de escala = 20 μm. Imagens F e G são adaptadas de Witchley et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> Figura 4: Aparência de C. albicans FISH-manchados em compartimentos diferentes do intestino. O tipo selvagem C. albicans é mostrado nos segmentos indicados do trato do GI do rato. Dentro de cada compartimento, as imagens retratam a área adjacente à mucosa hospedeira e à região central do intestino. A coloração foi executada com a ponta de prova panfungal. Barra de escala = 20 μm. As imagens são adaptadas de Witchley et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Estoques de antibióticos (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicilina G</td>
			<td>181 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Estreptomicina</td>
			<td>400 mg/μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Methacarn Methacarn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estoque</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Unidades</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metanol</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Clorofórmio</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácido acético glacial</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solução de hibridização</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estoque</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Unidades</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M Nacl (M)</td>
			<td>0,9 m</td>
			<td>180</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% formamida</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL (mantido em pequenos alíquos a -20 °C entre os usos)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solução de lavagem de PEIXES</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M Nacl (M)</td>
			<td>0,9 m</td>
			<td>9</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solução de coloração mucin-núcleos</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI, 10 μg/mL</td>
			<td>20 ng/mL 20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>lectina, 40 μg/mL</td>
			<td>1,6 μg/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS, pH 7.4 PBS, pH 7,4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Volumes típicos e concentrações de soluções utilizadas neste protocolo.

O objetivo deste protocolo é visualizar candida albicans forma celular e localização no trato gastrointestinal de mamíferos.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Este protocolo deu algumas das melhores informações que temos até agora sobre como os albicanos candida habitam o trato gastrointestinal dos mamíferos. Por exemplo, até recentemente, não sabíamos realmente onde Candida está localizada dentro do intestino ou qual de suas muitas formas morfológicas ela assume dentro desse nicho. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite visualizar a Candida dentro de seu ambiente natural sem interromper as interações tridimensionais que o fungo tem com estruturas hospedeiras ou com bactérias na microbiota.Como o intestino é um ambiente complexo, é muito difícil modelar em laboratório e, portanto, tem sido muito gratificante encontrar uma maneira de sondar a biologia candida diretamente em um modelo hospedeiro. Alguns componentes da microbiota intestinal, incluindo candida albicans são suspeitos de desempenhar papéis em doenças como doenças inflamatórias intestinais. Essa técnica pode potencialmente ser usada para diagnosticar a presença de microrganismos específicos em amostras de biópsia obtidas de pacientes.O domínio da técnica de gavage e a capacidade de dissecar segmentos gastrointestinais sem rasgar os órgãos é importante para obter resultados ideais. Para começar, gavage cada animal com o volume calculado de um determinado inóculo. Conecte uma agulha de alimentação animal autoclaved a uma seringa de um mililitro e encha a seringa com um volume de gavage certificando-se de remover todas as bolhas.Coloque a seringa em uma superfície estéril. Para fixar o animal, segure-o na base da cauda com a mão dominante e deslize a mão nondominante até as costas do animal até a pele solta logo atrás das orelhas. Reúna o scruff com o polegar e o dedo indicador.Pegue o animal pelo escroto, vire-o e dê a volta no dedo pequeno da mesma mão ao redor da cauda para imobilizar o animal contra a palma da mão. Estique suavemente a cabeça do animal para que ele fique em linha reta com o corpo. Em seguida, pegue a seringa com a mão dominante e segure-a perpendicular ao animal com a agulha curva apontando para baixo.Use a bola da agulha para enganchar suavemente um canto interno da boca e avançar a agulha ao longo da lateral da boca para a parte de trás da garganta, em seguida, mova a agulha para o centro. Uma vez que a bola da agulha esteja na parte de trás da garganta do animal, incline a agulha para cima para que ela esteja paralela à linha corporal do animal e deixe-a deslizar suavemente pela garganta. Se a agulha não deslizar suavemente pela garganta, a agulha pode não estar devidamente posicionada e deve ser retirada para reposicionar e tentar novamente.Avance suavemente a agulha permitindo que o animal engula a agulha até que apenas alguns milímetros permaneçam visíveis. Teste que a bola da agulha está no estômago avançando suavemente o êmbolo e se não houver resistência, continue entregando o inóculo. Retire lentamente a agulha uma vez que o inóculo tenha sido administrado e coloque o animal em sua gaiola.Continue monitorando o animal por cinco a 10 minutos para sinais de respiração ou angústia e verifique se ele retoma a atividade normal logo após o gavage. Se o mesmo inóculo for usado para o próximo animal, limpe a agulha com um lenço de álcool. Se for usado um inóculo diferente, substitua a agulha.Use fórceps sem corte para beliscar uma seção da pele abdominal e incisar a pele e a fáscia subjacente perto da base da pelve usando uma tesoura. Estique a incisão em forma de U ao longo de cada lado da cavidade peritoneal e até a caixa torácica, em seguida, levante a pele para fora do caminho. Use fórceps sem corte para extrair suavemente o ceco da cavidade peritoneal usando uma tesoura para cortar as conexões entre o ceco e os intestinos pequeno e grande.Coloque todo o ceco em uma fita de histologia para que ela não seja girada e fique plana. Coloque a segunda almofada de espuma por cima e feche o. Em seguida, coloque o em um frasco de tampa de parafuso contendo methacarn.Extireta a seção dos intestinos grossos que contém uma a duas pelotas fecais e tem um comprimento menor que o do. Coloque o tecido na fita, mantendo-o plano e sem girado. Sobreponha-o com a segunda almofada de espuma, feche o e coloque-o no methacarn.Para que cada seção do intestino delgado seja amostrada, extirve um segmento de um a dois centímetros que contenha algum material digestivo. Coloque o tecido no, sobreponha com a segunda almofada de espuma, feche o e coloque-o no metacardo. Ao extirpar o estômago, corte as conexões com o esôfago e os intestinos delgados.Coloque o tecido no e coloque o no metacardo. Deixe as fitas na solução de methacarn em temperatura ambiente por pelo menos três horas, mas menos de duas semanas. Após a fixação, remova as almofadas de espuma e devolva cada seção de tecido intacto em seu.Em seguida, lave os tecidos duas vezes por 35 minutos em 100% de metanol, duas por 25 minutos em 100% etanol, e duas vezes por 20 minutos em xileno. Bata as fitas secas em uma toalha de papel e coloque-as em uma cera de parafina pré-derretida por duas horas a 70 graus Celsius em um forno de hibridização. Em seguida, remova as fitas da cera, deixe o excesso de cera escorra e armazene-os à temperatura ambiente até que estejam embutidos em blocos de cera.Depilar as seções histológicas incorporadas pela parafina inserindo os slides em um frasco pré-aquecido cheio de xileno. Deixe o frasco a 60 graus Celsius por 10 minutos e descarte a lavagem de xileno. Despeje xileno de temperatura ambiente fresco no frasco e repita a incubação.Em seguida, encha o frasco com 100% de etanol e incuba-o em temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, remova os slides do frasco e o ar seque-os. Para manchar os c.albicans com uma sonda de peixe, comece desenhando um círculo ao redor da seção de tecido usando uma Caneta Pat.Pipeta 50 microliters de sonda contendo solução de hibridização sobre o tecido fixo e espalhá-lo suavemente com a ponta da pipeta. Sobreponha o líquido com uma tampa de hibridização certificando-se de evitar bolhas. Em seguida, sele os slides em uma câmara de hibridização apertada e incuba as seções por três horas a 50 graus Celsius em um forno de hibridização no escuro.Após a incubação, adicione a solução de lavagem a um frasco de Coplin. Remova cuidadosamente a mancha de cobertura do slide com fórceps e coloque o slide na solução de lavagem. Cubra o frasco com papel alumínio e incuba-o a 50 graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, lave os slides derramando a solução de lavagem e reabastecendo o frasco com PBS. Despeje imediatamente e refil com PBS fresco repetindo o processo para um total de duas lavagens. Afaste a PBS com uma delicada limpeza de tarefas e circule a seção de tecido intestinal com uma Caneta Pat.Coloque os slides em um recipiente de plástico opaco e adicione 50 microliters de solução de coloração de núcleos de mucina à seção tecidual. Cubra o recipiente com papel alumínio e incuba-o a quatro graus Celsius por 45 minutos. Após a incubação, coloque os slides em um frasco de Coplin e lave-os duas vezes com PBS.Bata o excesso de PBS em uma toalha de papel e, em seguida, afaste as gotas finais com um tecido. Coloque uma gota de meio de montagem em cada seção e sobreponha-a com uma mancha de vidro certificando-se de evitar bolhas. Deixe o meio de montagem se espalhar sob toda a mancha de cobertura.Ancore a mancha no lugar com esmalte nos cantos e imagem dos slides usando um microscópio fluorescente. Este protocolo pode ser usado para rotular fluorescentemente C.albicans in vitro e em tecidos hospedeiros. A higeia propagada in vitro, as células de levedura redonda, as células intestinais e as células opacas foram fixas, permeabilizadas e distinguidas com fluorescência e microscopia de contraste de fase.Leveduras redondas e hifas altamente alongadas foram imagens nos intestinos grandes do rato. Os tecidos hospedeiros foram manchados com a sonda específica de C.albicans ou a sonda panfúngica. Os c.albicans foram rotulados de vermelho, núcleos de células hospedeiras azuis, e a camada de muco verde.Os c.albicans foram detectados em diferentes segmentos do trato de MURINE GI, incluindo as regiões imediatamente adjacentes à mucosa hospedeira e regiões mais centrais do lúmen intestinal. Para cientistas que não realizaram anteriormente a técnica de gavage, é importante obter treinamento especializado antes de tentar esse método. Após a coloração dos peixes, técnicas imunofluorescentes podem ser usadas para manchar características adicionais da mucosa hospedeira.Isso pode permitir a caracterização de danos teciduais ou respostas imunes do hospedeiro. Essa técnica nos permitiu caracterizar a relação entre a morfologia celular fúngica dos mutantes candida albicanos e a sobrevivência dentro do hospedeiro promovendo nossa compreensão da biologia de candida albicans que pode ser aproveitada ao desenvolver terapias.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de...

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Fonte: Ng, K. M., Tropini, C. Visualização das Interações Microbiota-Hospedeiro Intestinal via Hibridização In Situ por Fluorescência, Coloração por Lectina e Imagem. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra o procedimento de hibridização fluorescente in situ (FISH) para colorir a microbiota intestinal dentro do tecido intestinal do camundongo, hibridizando sondas fluorescentes com rRNA bacteriano (ácido ribonucleico ribossomal) e contracolorindo as estruturas do hospedeiro para análise...

Hibridização in situ por fluorescência de bactérias intestinais em seções intestinais de camundongos

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo de camundongo in vivo para estudar a formação de biofilme de Candida albicans no tecido subcutâneo. O experimento envolve a implantação de dispositivos infectados com Candida na região posterior do animal para o desenvolvimento de biofilme.

Candida albicans Formação de biofilme em um modelo de camundongo in vivo

Apresentamos um procedimento experimental de desenvolvimento de biofilme de Candida albicans em um modelo subcutâneo de camundongo. Os biofilmes fúngicos foram quantificados pela determinação do número de unidades formadoras de colônias e por uma imagem de bioluminescência não invasiva, onde a quantidade de luz produzida corresponde ao número de células viáveis.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Aqui descrevemos uma técnica baseada em microscópio para visualizar e quantificar as primeiras cascatas de eventos durante a fagocitose de patógenos como os fungos Candida albicans e partículas maiores que 0,5 μm, incluindo zimosana e grânulos revestidos de IgG.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

Para visualizar e quantificar as características internas dos biofilmes candida albicans, preparamos amostras intactas fixas que são esclarecidas pela correspondência de índice simétrico. Em seguida, a microscopia de secção óptica pode ser usada para obter dados de imagem tridimensionais, embora a espessura total do biofilme.

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

O ensaio ex vivo descrito neste estudo utilizando extratos de homogeneização intestinal e coloração de imunofluorescência representa um novo método para examinar a morfogênese húfa de Candida albicans no trato GI. Este método pode ser utilizado para investigar os sinais ambientais que regulam a transição morfogenética no intestino.

Um ensaio ex vivo para estudar candida albicans Hórgênese Háfal no Trato Gastrointestinal

Este protocolo simplificado detalha um fluxo de trabalho para detectar e imaginar bactérias em amostras complexas de tecido, desde a fixação do tecido até micróbios de coloração com hibridização fluorescente in situ .

Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Micróbios intestinais, incluindo bactérias extracelulares e patógenos intracelulares como o vírus Orsay e microsporídios (fungos), são frequentemente associados a nematoides selvagens de Caenorhabditis . Este artigo apresenta um protocolo para detecção e quantificação de micróbios que colonizam e/ou infectam nematoides de C. elegans e para medir a carga de patógenos após infecções controladas em laboratório.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

Este manuscrito descreve um método para triagem de bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamanho moderado para fenótipos de morfogênese durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero usando microscopia confocal não invasiva.

Uso de imagens in vivo para rastrear fenótipos de morfogênese em cepas mutantes de Candida albicans durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero

Estabelecemos um modelo murino de infecção relacionada ao cateter (IRC) associada a C.albicans, no qual o biofilme se forma no cateter, e a interação entre C.albicans e hospedeiro correlaciona-se bem com a IRC clínica. Esse modelo ajuda a selecionar terapias para IRC associada ao biofilme de C.albicans , estabelecendo uma base para a transformação clínica.

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Aprenda a visualizar Candida albicans no trato gastrointestinal murino usando hibridização in situ fluorescente. Este método permite estudar a morfologia e localização do fungo em seu ambiente natural sem perturbar as interações tridimensionais.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

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