Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Este protocolo deu algumas das melhores informações que temos até agora sobre como os albicanos candida habitam o trato gastrointestinal dos mamíferos. Por exemplo, até recentemente, não sabíamos realmente onde Candida está localizada dentro do intestino ou qual de suas muitas formas morfológicas ela assume dentro desse nicho. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite visualizar a Candida dentro de seu ambiente natural sem interromper as interações tridimensionais que o fungo tem com estruturas hospedeiras ou com bactérias na microbiota.

Como o intestino é um ambiente complexo, é muito difícil modelar em laboratório e, portanto, tem sido muito gratificante encontrar uma maneira de sondar a biologia candida diretamente em um modelo hospedeiro. Alguns componentes da microbiota intestinal, incluindo candida albicans são suspeitos de desempenhar papéis em doenças como doenças inflamatórias intestinais. Essa técnica pode potencialmente ser usada para diagnosticar a presença de microrganismos específicos em amostras de biópsia obtidas de pacientes.

O domínio da técnica de gavage e a capacidade de dissecar segmentos gastrointestinais sem rasgar os órgãos é importante para obter resultados ideais. Para começar, gavage cada animal com o volume calculado de um determinado inóculo. Conecte uma agulha de alimentação animal autoclaved a uma seringa de um mililitro e encha a seringa com um volume de gavage certificando-se de remover todas as bolhas.

Coloque a seringa em uma superfície estéril. Para fixar o animal, segure-o na base da cauda com a mão dominante e deslize a mão nondominante até as costas do animal até a pele solta logo atrás das orelhas. Reúna o scruff com o polegar e o dedo indicador.

Pegue o animal pelo escroto, vire-o e dê a volta no dedo pequeno da mesma mão ao redor da cauda para imobilizar o animal contra a palma da mão. Estique suavemente a cabeça do animal para que ele fique em linha reta com o corpo. Em seguida, pegue a seringa com a mão dominante e segure-a perpendicular ao animal com a agulha curva apontando para baixo.

Use a bola da agulha para enganchar suavemente um canto interno da boca e avançar a agulha ao longo da lateral da boca para a parte de trás da garganta, em seguida, mova a agulha para o centro. Uma vez que a bola da agulha esteja na parte de trás da garganta do animal, incline a agulha para cima para que ela esteja paralela à linha corporal do animal e deixe-a deslizar suavemente pela garganta. Se a agulha não deslizar suavemente pela garganta, a agulha pode não estar devidamente posicionada e deve ser retirada para reposicionar e tentar novamente.

Avance suavemente a agulha permitindo que o animal engula a agulha até que apenas alguns milímetros permaneçam visíveis. Teste que a bola da agulha está no estômago avançando suavemente o êmbolo e se não houver resistência, continue entregando o inóculo. Retire lentamente a agulha uma vez que o inóculo tenha sido administrado e coloque o animal em sua gaiola.

Continue monitorando o animal por cinco a 10 minutos para sinais de respiração ou angústia e verifique se ele retoma a atividade normal logo após o gavage. Se o mesmo inóculo for usado para o próximo animal, limpe a agulha com um lenço de álcool. Se for usado um inóculo diferente, substitua a agulha.

Use fórceps sem corte para beliscar uma seção da pele abdominal e incisar a pele e a fáscia subjacente perto da base da pelve usando uma tesoura. Estique a incisão em forma de U ao longo de cada lado da cavidade peritoneal e até a caixa torácica, em seguida, levante a pele para fora do caminho. Use fórceps sem corte para extrair suavemente o ceco da cavidade peritoneal usando uma tesoura para cortar as conexões entre o ceco e os intestinos pequeno e grande.

Coloque todo o ceco em uma fita de histologia para que ela não seja girada e fique plana. Coloque a segunda almofada de espuma por cima e feche o. Em seguida, coloque o em um frasco de tampa de parafuso contendo methacarn.

Extireta a seção dos intestinos grossos que contém uma a duas pelotas fecais e tem um comprimento menor que o do. Coloque o tecido na fita, mantendo-o plano e sem girado. Sobreponha-o com a segunda almofada de espuma, feche o e coloque-o no methacarn.

Para que cada seção do intestino delgado seja amostrada, extirve um segmento de um a dois centímetros que contenha algum material digestivo. Coloque o tecido no, sobreponha com a segunda almofada de espuma, feche o e coloque-o no metacardo. Ao extirpar o estômago, corte as conexões com o esôfago e os intestinos delgados.

Coloque o tecido no e coloque o no metacardo. Deixe as fitas na solução de methacarn em temperatura ambiente por pelo menos três horas, mas menos de duas semanas. Após a fixação, remova as almofadas de espuma e devolva cada seção de tecido intacto em seu.

Em seguida, lave os tecidos duas vezes por 35 minutos em 100% de metanol, duas por 25 minutos em 100% etanol, e duas vezes por 20 minutos em xileno. Bata as fitas secas em uma toalha de papel e coloque-as em uma cera de parafina pré-derretida por duas horas a 70 graus Celsius em um forno de hibridização. Em seguida, remova as fitas da cera, deixe o excesso de cera escorra e armazene-os à temperatura ambiente até que estejam embutidos em blocos de cera.

Depilar as seções histológicas incorporadas pela parafina inserindo os slides em um frasco pré-aquecido cheio de xileno. Deixe o frasco a 60 graus Celsius por 10 minutos e descarte a lavagem de xileno. Despeje xileno de temperatura ambiente fresco no frasco e repita a incubação.

Em seguida, encha o frasco com 100% de etanol e incuba-o em temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, remova os slides do frasco e o ar seque-os. Para manchar os c.albicans com uma sonda de peixe, comece desenhando um círculo ao redor da seção de tecido usando uma Caneta Pat.

Pipeta 50 microliters de sonda contendo solução de hibridização sobre o tecido fixo e espalhá-lo suavemente com a ponta da pipeta. Sobreponha o líquido com uma tampa de hibridização certificando-se de evitar bolhas. Em seguida, sele os slides em uma câmara de hibridização apertada e incuba as seções por três horas a 50 graus Celsius em um forno de hibridização no escuro.

Após a incubação, adicione a solução de lavagem a um frasco de Coplin. Remova cuidadosamente a mancha de cobertura do slide com fórceps e coloque o slide na solução de lavagem. Cubra o frasco com papel alumínio e incuba-o a 50 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, lave os slides derramando a solução de lavagem e reabastecendo o frasco com PBS. Despeje imediatamente e refil com PBS fresco repetindo o processo para um total de duas lavagens. Afaste a PBS com uma delicada limpeza de tarefas e circule a seção de tecido intestinal com uma Caneta Pat.

Coloque os slides em um recipiente de plástico opaco e adicione 50 microliters de solução de coloração de núcleos de mucina à seção tecidual. Cubra o recipiente com papel alumínio e incuba-o a quatro graus Celsius por 45 minutos. Após a incubação, coloque os slides em um frasco de Coplin e lave-os duas vezes com PBS.

Bata o excesso de PBS em uma toalha de papel e, em seguida, afaste as gotas finais com um tecido. Coloque uma gota de meio de montagem em cada seção e sobreponha-a com uma mancha de vidro certificando-se de evitar bolhas. Deixe o meio de montagem se espalhar sob toda a mancha de cobertura.

Ancore a mancha no lugar com esmalte nos cantos e imagem dos slides usando um microscópio fluorescente. Este protocolo pode ser usado para rotular fluorescentemente C.albicans in vitro e em tecidos hospedeiros. A higeia propagada in vitro, as células de levedura redonda, as células intestinais e as células opacas foram fixas, permeabilizadas e distinguidas com fluorescência e microscopia de contraste de fase.

Leveduras redondas e hifas altamente alongadas foram imagens nos intestinos grandes do rato. Os tecidos hospedeiros foram manchados com a sonda específica de C.albicans ou a sonda panfúngica. Os c.albicans foram rotulados de vermelho, núcleos de células hospedeiras azuis, e a camada de muco verde.

Os c.albicans foram detectados em diferentes segmentos do trato de MURINE GI, incluindo as regiões imediatamente adjacentes à mucosa hospedeira e regiões mais centrais do lúmen intestinal. Para cientistas que não realizaram anteriormente a técnica de gavage, é importante obter treinamento especializado antes de tentar esse método. Após a coloração dos peixes, técnicas imunofluorescentes podem ser usadas para manchar características adicionais da mucosa hospedeira.

Isso pode permitir a caracterização de danos teciduais ou respostas imunes do hospedeiro. Essa técnica nos permitiu caracterizar a relação entre a morfologia celular fúngica dos mutantes candida albicanos e a sobrevivência dentro do hospedeiro promovendo nossa compreensão da biologia de candida albicans que pode ser aproveitada ao desenvolver terapias.