Name: Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a isolar microvasos do sistema nervoso central em vertebrados lissencefálicos e girencefálicos sem ultracentrifugação. Este método rápido permite comparar a microvasculatura entre diferentes regiões do SNC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Cruz-Orengo foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Davis, Escola de Medicina Veterinária Start Up Funds.

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Califórnia (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O cuidado animal em UC Davis é regulado por diversos recursos independentes e foi acreditado inteiramente pela associação para a avaliação e o accreditation do animal do laboratório internacional (AAALAC) desde 1966. Tecidos sincie foram obtidos do Departamento de Ciências Animais da UCD, Laboratório de Ciências da Carne. Tecidos do SNC de macacos rhesus foram obtidos do Departamento Nacional de Patologia do Centro de Pesquisa de Primatas da Califórnia (NIH P51OD011107). Nenhuma anestesia, eutanásia ou necropsia foi realizada por funcionários de laboratório em porcos e macacos. Portanto, não existem recomendações particulares sobre essas questões.
NOTA: Este método foi validado para várias espécies, mas o protocolo fornecido corresponde mais diretamente aos tecidos de camundongos e suínos. Detalhes relativos ao lobo óptico não se aplicam ao usar espécimes de mamíferos. Todos os materiais bioperigosos devem ser tratados em uma instalação adequada de nível de biossegurança (BSL). Todos os materiais agudamente tóxicos devem ser manipulados debaixo de um capô de fumaça. Todos os resíduos médicos bioperigosos e resíduos agudamente tóxicos devem ser eliminados adequadamente.
1. Preparação
<ol><li>Prepare soluções(Tabela 1)pelo menos um dia antes. NOTA: É muito difícil dissolver 70 kDa peso molecular (MW) dextran. É mais eficiente deixar a solução agitar durante a noite coberta com filme de parafina ou folha. O protocolo requer o uso de duas soluções mv-2 diferentes, dependendo do espécime investigação. O dextran de 18% separa eficientemente a mielina da pelota do micronavio ao executar o protocolo em espécimes lissencephalic pequenos. No entanto, desenvolve uma mancha de mielina dentro da interface dos tecidos do SNC a partir de grandes espécimes girosféricos, bem como o hipotálamo e o pituitário de pequenos espécimes. Esta mancha é impedida usando 20% dextran.</li>
	<li>Prepare-os slides bem carregando 50 μL por poço de poli-D-lisina e deixe secar por 2 h à temperatura ambiente (RT), de preferência em um gabinete de segurança biológica classe 2 (BSC-2). Não se cansar. Lave duas vezes com soro soro para os soro vermelho-fosfato (PBS) e mantenha na geladeira até que esteja pronto para uso.</li>
</ol>2. Dissecção de tecido cns de pequeno espécime de vertebrados lissencefálicos
NOTA: O artigo demonstra a aplicação do protocolo em um C57BL6/J, 10 semanas de idade, ~ 25 g, rato macho.
<ol><li>Prepare dois tubos cônicos de 15 mL e um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com 5 mL e 1 mL, respectivamente, de solução MV-1 por espécime. Mantenha tubos no gelo.</li>
	<li>Anesthetization<ol>
<li>Camundongos anestesos por injeção intraperitoneal de um coquetel anestésico de cetamina, xilacina e acepromazine em 100/10/3 mg por kg de peso corporal e spray com 70% de etanol. Confirme a anestesia avaliando a ausência de reflexos palpebral e pedal tocando um olho e beliscando um pé, respectivamente.</li>
		<li>Pombos anestesia por inalação de 5% isoflurano usando uma caixa de anestesia de indução.</li>
		<li>Anestesie peixes e rãs em 1% tricaino em um peixe segurando tanque de água ou solução de anfíbio ringer(Mesa de Materiais), respectivamente.</li>
		<li>Anestesie lagartos refrigerando a 4 °C antes da eutanásia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Decapite o animal com tesoura cirúrgica, descasque a pele com fórceps para expor o crânio, e corte com tesourala lagrange através do foramen magnum (Figura 1A).</li>
	<li>Dissecar o cérebro com uma espátula e transferir para um tubo cônico de 15 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.</li>
	<li>Recuperar o pituitário da sella turcica do crânio com fórceps e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.</li>
	<li>Retire a pele e o músculo para expor a coluna vertebral. Cortar os membros, caixa torácica, e órgãos internos (Figura 1B).</li>
	<li>Dissecar a medula espinhal por um dos dois métodos descritos abaixo. Em seguida, transfira para um tubo cônico de 5 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.<ol>
<li>Realizar laminectomia cortando em uma direção rostral para caudal com tesoura LaGrange, começando através do foramen vertebralcervical , até chegar ao cordão lombar.</li>
		<li>Executar rubor em uma direção caudal para rostral em todo o foramen lombar vertebral com uma agulha de 18 G e seringa de 10 mL carregado com solução MV-1 (Figura 1C,D). NOTA: Este método só funciona com espécimes muito pequenos, principalmente roedores (<100 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando um escopo de dissecação, corte o saco dural da medula espinhal com tesoura de mola e retire as meninges restantes com uma escolha dupla(Figura 2).</li>
	<li>Transfira o cérebro para uma placa de Petri e, usando um escopo de dissecação, retire as meninges com uma escolha dupla(Figura 2A-C).</li>
	<li>Excise os bulbos e o tálamo olfativos com fórceps, tesouras da íris, e tesouras da mola. Usando a picareta dobro-facetada, remova o plexo choroid de todos os ventrículos do cérebro. Certifique-se de remover todo o plexo choroide. NOTA: O plexo choroid e as lâmpadas olfativas são uma fonte maciça de contaminação. Em contraste com o BBB, esses capilares são altamente fenestrated e os resultados dos experimentos subseqüentes serão comprometidos se eles não forem removidos.</li>
	<li>Usando fórceps, separe as regiões distintas do SNC: córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico (não em espécimes de mamíferos) e hipotálamo.</li>
</ol>3. Dissecção de tecido cns de um grande espécime de vertebrados gyrencefálicos
NOTA: Este protocolo utiliza tecidos snc sinéci obtidos a partir de um matadouro. Portanto, nenhuma anestesia, eutanásia ou necropsia é descrita ou mostrada aqui.
<ol><li>Transporte de tecidos sinitios CNS em um recipiente de histologia de 0,946 L (32 oz) carregado com solução MV-1 dentro de um baú de gelo / balde.</li>
	<li>Usando um escopo de dissecação, retire as meninges com uma picareta de duas pontas, fórceps, tesoura de íris e tesouras de mola de cada tecido do SNC. Certifique-se de remover todos os pedaços de plexo choroide do cérebro ventrículos.</li>
</ol>4. Homogeneização do tecido do SNC
NOTA: É mais eficiente quando dois investigadores se envolvem no processo de homogeneização: um dissecando as meninges o estereoscópio e o outro homogeneizando os tecidos picados. Desta forma, os tecidos são rapidamente devolvidos ao balde de gelo e mantidos frios.
<ol><li>Coloque cada região cns em uma placa de Petri com ~ 1 mL de solução MV-1. Usando uma lâmina de borda única, picar o tecido para obter 1-2 mm pedaços.<ol>
<li>Para um pequeno espécime de vertebrados, use uma placa de Petri de 100 mm x 20 mm.</li>
		<li>Para um grande espécime de vertebrados, use uma placa de Petri de 150 mm x 15 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogeneização de um pequeno espécime de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3)<ol>
<li>Transfira o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e medula espinhal para ~1 mL de solução MV-1 em um moedor de tecido de vidro individual de 10 mL Potter-Elvehjem com um pilão PTFE usando uma pipeta de transferência. Adicione 5 mL de solução MV-1 e homogeneize cada tecido (~10 cursos). Transfira para tubos cônicos individuais de 15 mL. Mantenha tubos no gelo. NOTA: Para um pequeno vertebrado, 5 ou 4, com ou sem lóbulo óptico, respectivamente, são necessários 10 moedores mL Potter-Elvehjem e 15 tubos cônicos mL.</li>
		<li>Transfira o hipotálamo e o pituitário com fórceps para ~100 μL da solução MV-1 em um tubo individual de 1,7 mL e homogeneize cuidadosamente com um micropestle de vidro. Lave cada micropestle com ~1 mL da solução MV-1. Mantenha tubo no gelo. NOTA: Para um pequeno vertebrado, são necessários 2 micropestles de vidro e tubos de 1,7 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogeneização de um grande espécime de vertebrado(Tabela 4 e Tabela 5)<ol>
<li>Usando uma pipeta de transferência, transfira o tecido picado para um moedor de tecido de vidro De 55 mL Potter-Elvehjem com um pilão PTFE e anexar ao agitador aéreo. Adicione metade do volume recomendado da solução MV-1, de acordo com a parcela específica do SNC sendo homogeneizada(Tabela 5).</li>
		<li>Ligue o agitador aéreo em velocidade muito baixa (~ 150 rpm) e mova cuidadosamente o tubo de vidro para cima e para baixo por cerca de 30 s.</li>
		<li>Desligue o agitador aéreo, adicione mais solução MV-1 e repita o passo 4.3.2 até obter uma pasta homogênea.</li>
		<li>Transfira para um tubo cônico de 50 mL. Mantenha tubo no gelo.</li>
		<li>Lave o moedor com água desionizada entre cada homogeneização do tecido do SNC. NOTA: Para um grande vertebrado 5 ou 4, com ou sem matéria branca, respectivamente, 50 tubos cônicos mL são necessários. Da mesma forma, dois (2) 15 mL tubos cônicos são necessários para o hipotálamo e pituitário.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Purificação de micronavios
<ol><li>Homogeneados de tecido de centrífuga resultantes do passo 4.2.1, 4.2.2, ou 4.3.4 a 2.000 x g para 10 min em 4 °C. Uma grande interface branca de mielina se formará na parte superior das pelotas dos micronavioes avermelhados. Descarte os supernatantes.<ol>
<li>Pequeno espécime de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3)<ol>
<li>Resuspenda o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pelotas da medula espinhal em 5 mL de solução MV-2 gelada com uma pipeta sorológica de 5 mL (~10 flushes). Adicione 5 mL de solução MV-2 gelada para cada suspensão e misture cuidadosamente lançando os tubos.</li>
			<li>Resuspenda as pelotas hipotálamas e pituitárias com 1 mL da solução MV-2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Grande espécime de vertebrado(Tabela 4 e Tabela 5)<ol>
<li>Adicione 20 mL de solução MV-2 gelada para o córtex, cerebelo, tronco cerebral e pelotas de microvaso da medula espinhal. Resuspenda as pelotas misturando em um revólver do tubo, agitando em 40 rpm para ~5 min. Balance os volumes dos tubos cónicos do córtex, do cerebelo, do tronco cerebral, e das suspensões da medula espinal adicionando mais solução MV-2.</li>
			<li>Resuspenda as pelotas de micronavio hipotálamo e pituitário em 5 mL da solução MV-2 com uma pipeta sorológica de 5 mL (~10 flushes). Adicione 5 mL de solução MV-2 gelada para as suspensões e misture cuidadosamente lançando o tubo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrífuga a 4.400 x g por 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Cuidadosamente destacar a camada de mielina espessa e densa na interface líquida das paredes de cada tubo, girando lentamente os tubos e permitindo que o supernatant passe ao longo das paredes.</li>
	<li>Descarte a interface de mielina e líquido e borre a parede interna de cada tubo com uma espátula embrulhada com uma limpeza de papel de fiapos baixo. Para pequenos espécimes de vertebrados, retire a camada de mielina de cada hipotálamo e tubo pituitário por sucção cuidadosamente com uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Limpe o excesso de líquido com uma limpeza de papel de fiapo rasteiro torcido. Resuspenda cada pelota com 1 mL da solução MV-3 usando pontas low-binding. Mantenha tubos no gelo.</li>
</ol>6. Elução e Filtração de Micronavios
<ol><li>Despeje a solução MV-3 gelada em taças individuais para cada região do SNC. Mantenha-se a 4 °C.<ol>
<li>Para pequenos espécimes de vertebrados, use 10 mL de solução MV-3 por copo de 50 mL. Um total de 6-7 taças é necessária dependendo se o lobo óptico está incluído ou não.</li>
		<li>Para grandes espécimes de vertebrados, use 30 mL de solução MV-3 por copo de 100 mL. Um total de 6-7 taças é necessária dependendo se a matéria branca está incluída ou não.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque um filtro de célula em cima de um tubo cônico de 50 mL. Use um por região do SNC. Use um filtro de 100 μm para o córtex, tronco cerebral, lobo óptico, medula espinhal e pituitário. Use um filtro de células de 70 μm para o cerebelo e hipotálamo.</li>
	<li>Molhe cada filtro com 1 mL de solução MV-3 gelada.</li>
	<li>Adicione mais solução MV-3 às suspensões preparadas na etapa 5.5 com uma pipeta serológica ao misturar para evitar agregados. Cuidadosamente carregar microvessels em cima do filtro. Enxágüe com a solução MV-3 gelada.<ol>
<li>Para pequenos espécimes de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3),adicione 10-15 mL da solução MV-3 com uma pipeta sorológica e lave com 5 mL de solução MV-3.</li>
		<li>Para grandes espécimes de vertebrados, adicione 20 mL de solução MV-3 com uma pipeta sorológica e lave com 10 mL de solução MV-3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte a unidade de filtragem colocando um filtro líquido de nylon de 20 μm em um suporte de filtro modificado (Figura 2D),um por região do SNC.<ol>
<li>Para pequenos espécimes de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3),use suportes de filtro modificados de 25 mm para o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e medula espinhal. Use suportes de filtro modificados de 13 mm para o hipotálamo e hipólitaria.</li>
		<li>Para grandes espécimes de vertebrados(Tabela 4 e Tabela 5),use suportes de filtro modificados de 47 mm para o córtex, cerebelo, tronco cerebral e medula espinhal. Use 25 mm para o hipotálamo e hipólitaria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o filtro em cima de um tubo cônico de 50 mL e filtro molhado com 5 mL de solução MV-3 gelada certificando-se de que o buffer desça o suporte do filtro para o tubo cônico.</li>
	<li>Transfira os micronavioes eluted (da etapa 6.4) sobre o filtro líquido de nylon de 20 μm e lave os microvessels com 5-10 mL da solução MV-3 ice-cold.</li>
	<li>Recupere o filtro usando fórceps limpos e mergulhe-o no copo contendo a solução MV-3 gelada preparada na etapa 6.1.</li>
	<li>Desaseasse os microvessels do filtro agitando o delicadamente por aproximadamente 30 s. Para pequenos espécimes de vertebrados, despeje o teor de copo em um tubo cônico de 15 mL. Para grandes espécimes de vertebrados, despeje o teor de taça em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Centrífuga a 2.000 x g por 5 minutos a 4 °C e resuspender a pelota em 1 mL de gelo-frio MV-3 solução usando uma ponta de pipeta de baixa ligação.<ol>
<li>Para pequenos espécimes de vertebrados, transfira a suspensão (do passo 6.10) para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL e centrífuga a 20.000 x g por 5 min a 4 °C. NOTA: Esta rotação é realizada em uma centrífuga bancada a uma velocidade máxima (~ 20.000 x g)para garantir um rendimento robusto.</li>
		<li>Para grandes espécimes de vertebrados, transfira a suspensão do passo 6.10 para um tubo de microcentrífuga de 5,0 mL, adicione 4 mL da solução MV-3 e centrífuga a 2.000 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Imunomanchas
NOTA: A coloração hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada em espécimes de répteis, anfíbios e peixes como prova de conceito da viabilidade do protocolo. Portanto, não há recomendação para imunorotulagem para esses espécimes.
<ol><li>Retire o supernatant dos tubos de microcentrífuga.</li>
	<li>Resuspenda a pelota em PBS 1x estéril usando uma ponta de pipeta de baixa ligação(Tabela de Materiais). Mantenha os microvessels de dar forma a agregados pipetting épocas múltiplas. Para pequenos espécimes de vertebrados (Tabela 3),use ~100 μL-2.000 μL de acordo com o tamanho da pelota. Para grandes espécimes de vertebrados (Tabela 5),use ~1.000 μL-4.000 μL de acordo com o tamanho da pelota.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta de baixa ligação, transfira os micronavioes para slides bem, tendo o cuidado de adicioná-los ao centro de cada poço, evitando as paredes laterais.</li>
	<li>Definir os slides bem, descoberto, dentro de um BSC-2, e deixe secar por 20 a 30 min em RT. NOTA: Um volume relativamente alto de 1x PBS é usado para evitar a formação agregada. Devido a isso, é necessário deixar os slides secar antes da fixação para se certificar de que os micronavioes estão sendo mantidos pelo revestimento de poli-D-lisina.</li>
	<li>Remover residual 1x PBS por pipetting para fora com uma pipeta de transferência, adicionar 200 μL de 4% paraformaldeído (PFA) e incubar por 30 min em RT.</li>
	<li>Pipette a solução fixa e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT. NOTA: A mancha de H&E em micronavios cns de peixes, anfíbios e répteis foi realizada neste momento.</li>
	<li>Adicione 200 μL de bloqueio tampão para o poço slide e incubar por 60 min em 37 °C.</li>
	<li>Retire o tampão de bloqueio com uma pipeta de transferência e adicione 200 μL do coquetel de anticorpos primários em diluente de anticorpos(Mesa de Materiais). Incubar a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Pipette fora o coquetel de anticorpos primários e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT.</li>
	<li>Carregue o coquetel de anticorpos secundários(Mesa de Materiais)diluído em 1x PBS e incubar por 2 h na RT, protegido da luz.</li>
	<li>Pipette fora do coquetel de anticorpos secundários e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT, protegido da luz. Após a última lavagem destacar quadro do bem slide e borrar-sede qualquer excesso de 1x PBS com uma limpeza de papel de fiapos baixo.</li>
	<li>Adicione um coverslip, líquido antifade mountant médio, e 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Deixe secar durante a noite em RT protegido da luz.</li>
	<li>Uma vez seco, mantenha-se protegido da luz em uma caixa de slides a 4 °C até que esteja pronto para microscopia confocal e aquisição de dados.</li>
</ol>

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).</li>
<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+Physiology+to+Disease+and+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li>
<li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).</li>
<li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+barriers%3A+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes & Development. 32, 466-478 (2018).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li>
<li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li>
<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O BBB inclui as propriedades únicas das células endotélias de microvasculatura cerebral juntamente com uma arquitetura sofisticada de junções apertadas, aderentes, "peg-soquete" e placas de adesão críticas para a homeostasedoSNC2,3,19. As propriedades das células endotélias são induzidas e mantidas pelos pericitos e pelos processos circundantes astroglia end-foot2,3,<sup...

Nosso cérebro é o órgão mais importante do nosso corpo. Por esta razão, manter a homeostase cerebral, apesar de fatores externos que podem desencadear um desvio da normalidade é uma prioridade. De acordo com alguns estudiosos, cerca de 400-500 milhões de anos atrás1, animais vertebrados desenvolveram o que hoje conhecemos como a barreira hemato-hematograse (BBB)2,3. Esta "cerca" protetora exerce a maior influência sobre a homeostase e as funções do sistema nervoso central (SNC), regulando firmemente o transporte de íons, moléculas e células entre sangue e snc. parenchyma. Quando o BBB é interrompido, o cérebro torna-se suscetível à exposição tóxica, infecção e inflamação. Portanto, a disfunção BBB está associada a muitos distúrbios neurológicos e neurodesenvolvimentais4,5,6.
A função sofisticada do BBB é atribuída à microvasculatura cns única conformada pela unidade neurovascular (NVU)2,3. Células endotélias altamente especializadas, pericitos e pés finais ascícticos são os componentes celulares do NVU2,3. A matriz extracelular gerada por essas células também é essencial para a fisiologia NVU e BBB2,3. Embora componentes celulares e moleculares essenciais do NVU sejam conservados entre vertebrados, a heterogeneidade é relatada entre ordens eespécies 7,8. No entanto, limitações técnicas impedem nossa capacidade de considerar plenamente essas diferenças em pesquisa sonoridade, biomédica ou translacional.
Devido a isso, expandimos um método de isolamento de micronavios específico da região do SNC para torná-lo aplicável a inúmeras espécies de todos os cinco grupos vertebrados: peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. O protocolo é descrito para uso em vertebrados pequenos lissencefálicos e de grande girofálico, incluindo espécies com relevância translacional9. Além disso, incluímos outras regiões do SNC não investigadas antes neste contexto, mas relevantes para a neurofisiologia e com tremendas implicações clínicas: hipotálamo, hipófise e matéria branca. Por fim, testamos a capacidade deste método de isolamento como uma ferramenta confiável paraidentificar mudanças na expressão de proteínas ao longo da NVU e/ou BBB9,10,11. Como prova de conceito, mostramos como determinar as mudanças na expressão VCAM-1 e JAM-B durante o EAE usando o método de isolamento seguido de imunofluorescência.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Usado para bloqueio e diluente de anticorpos.</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15713-S</td><td>Usado como fixador (4% PFA)</td></tr> <tr><td>70.000 MW Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>Usado para solução MV-2</td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>11006-12</td><td>Usado para remoção de músculo e pele</td></tr><tr><td>Adson Forceps, qualidade do aluno</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>Mesmo que acima, mas soro bovino mais barato</td></tr><tr><td> albumina (BSA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Usado para solução MV-3, bloqueio e diluente de anticorpos</td></tr><tr><td>Corning 100 &mu; m Filtro de células</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu; m Filtro de célula</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork pontas de baixa ligação</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>O mesmo que abaixo, mas mais barato.</td></tr><tr><td>Cultrex Poli-D-Lisina</td><td>R& D</td><td>3439-100-01</td><td>Usado para revestimento de slides</td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Picareta de tecido de duas pontas</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>Usado para remoção de meninges e plexo coróide</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #3c</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Usado para manuseio de tecidos do SNC mais delicados e/ou pequenos (como hipófise)</td></tr> <tr><td>Dumont #7 Fórceps</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Usado para dissecção e manuseio do SNC</td></tr><tr><td>Dumont #7, estudante</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>O mesmo que acima, mas mais barato</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Dicas</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>Melhor qualidade do que as dicas acima (mais caras).</td></tr><tr><td>Pinça Graefe Extra Fina, serrilhada</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Usada para remoção</td></tr><tr>óssea<td>Tesoura Fina, afiada</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Usada para remoção de saco dural de porco e macaco</td></tr><tr><td>Pilão de Vidro 1.5 mL Microcentrifuge Tubo Moedor de Tecidos Homogeneizador, Pacote de 10</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Usado para pequenos hipotátalos e hipófise vetebrados.</td></tr><tr><td>Cabra anti-CXCL12, biotinilada</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada: 1:20.</td></tr><tr><td>Cabra anti-JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>Usado como anticorpo primário para avaliar a neuroinflamação. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-PDGFR&beta;</td><td>R& D</td><td>AF1042</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Pinça Graefe, ponta curva, dentes 1X2</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>Uso para retenção e agitação da rede de filtro de nylon</td></tr><tr><td>HBSS, 1X tampão com cálcio e magnésio</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>Usado para solução MV-1</td></tr><tr><td>HEPES, 1M tampão líquido</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>Usado para solução MV-1</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4-Biotina-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Glicoproteína isolada da leguminosa Griffonia simplicifolia que se liga a resíduos de D-galactosil de glicocalysx de células endoteliais. Usado para microvasos do SNC aviários e suínos. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Tesoura LaGrange, serrilhada</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Usado para dissecção do crânio e laminectomia (exceto porco e macaco)</td></tr><tr><td>Millicell EZ slide Unidade de 8 poços</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todos os espécimes. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Camundongo anti-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Rato anti-humano CD31</td><td>R& D</td><td>BBA7</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de primatas. Concentração recomendada: 16,5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Camundongo anti-NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Camundongo anti-&alfa; SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Rede de filtro de nylon, rolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>Corte a laser em discos de rede de filtro de 13 mm de diâmetro. Usado para hipotátalo e hipófise vetebrados pequenos.</td></tr><tr><td>Redes de filtro de nylon, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.</td></tr><tr><td>Redes de filtro de nylon, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.</td></tr><tr><td>Reagente antidesbotamento ProLong Gold com DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>Usado para lâminas de lamínula.</td></tr><tr><td>Coelho anti-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Coelho anti-LSR</td><td>Millipore Sigma</td><td>SAB2107967</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Coelho anti-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Coelho anti-OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 1 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Coelho anti-VE-Caderina</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Coelho anti-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Rato anti-CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>Usado como anticorpo primário para microvasos murinos do SNC. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Rato anti-GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Rato anti-VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>Usado como anticorpo primário para avaliar a neuroinflamação. Concentração recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Solução estéril de Ringer, Frog</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>Usado para anestesia amfibiana</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>Usado como anticorpo secundário para marcar anticorpos primários biotinilados. Diluição recomendada de 1:500.</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>Usado como anticorpo secundário para marcar anticorpos primários biotinilados. Diluição recomendada de 1:500.</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica, afiada</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>Usada para remoção de músculo e pele</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica, afiada-romba</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Usada para decapitação (exceto porco e macaco)</td></tr> <tr><td>Suporte de filtro Swinnex, 13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>Modificado por corte a laser. Usado para hipotátalo e hipófise vetebrados pequenos.</td></tr><tr><td>Suporte de filtro Swinnex, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>Modificado por corte a laser. Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.</td></tr><tr><td>Suporte de filtro Swinnex, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>Modificado por corte a laser. Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>Usado para bloqueio e diluente de anticorpos.</td></tr><tr><td>Agitador Suspenso Wheaton 120 Vac</td><td>VWR (Fornecedor DWK Life Sciences)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos com triturador de tecidos de 55 mL, exceto hipotálamo e hipófise.</td></tr><tr><td>Moedor de tecidos Wheaton Potter-Elvehjem com pilão de PTFE, 10 mL</td><td>VWR (Fornecedor DWK Life Sciences)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.</td></tr><tr><td>Moedor de tecidos Wheaton Potter-Elvehjem com pilão de PTFE, 55 mL</td><td>VWR (Fornecedor DWK Life Sciences)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.</td></tr></tbody></table>

isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

O isolamento de microvasos do sistema nervoso central (SNC) é comumente realizado apartir da combinação de tecido cortical de múltiplos animais, na maioria das vezes roedores. Esta abordagem limita o interrogatório de propriedades de barreira sangue-cérebro (BBB) ao córtex e não permite a comparação individual. Este projeto se concentra no desenvolvimento de um método de isolamento que permite a comparação da unidade neurovascular (NVU) de várias regiões do SNC: córtex, cerebelo, lobo óptico, hipotálamo, pituitário, tronco cerebral e medula espinhal. Além disso, este protocolo, originalmente desenvolvido para amostras de urina, foi adaptado com sucesso para uso em tecidos do SNC de pequenas e grandes espécies de vertebrados das quais também somos capazes de isolar microvasos da matéria branca do hemisfério cerebral. Este método, quando emparelhado com imunorotulagem, permite a quantidade de expressão proteica e comparação estatística entre indivíduos, tipo de tecido ou tratamento. Provamos essa aplicabilidade avaliando mudanças na expressão de proteínas durante encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de urina de uma doença neuroinflamatória, esclerose múltipla. Além disso, micronavios isolados por este método poderiam ser usados para aplicações a jusante como qPCR, RNA-seq e mancha ocidental, entre outros. Mesmo que esta não seja a primeira tentativa de isolar micronavios do SNC sem o uso de ultracentrifugação ou dissociação enzimática, é único em sua adeptness para a comparação de indivíduos solteiros e múltiplas regiões do SNC. Portanto, permite a investigação de uma série de diferenças que, de outra forma, podem permanecer obscuras: porções do SNC (córtex, cerebelo, lobo óptico, tronco cerebral, hipotálamo, hipófise e medula espinhal), tipo de tecido cns (matéria cinzenta ou branca), indivíduos, grupos de tratamento experimental e espécies.

Microvasos isolados do CNS de urina mostraram todos os componentes celulares intrínsecos da unidade neurovascular2,3. Usando molécula de adesão de plaquetas endotelial-1 (PECAM, também conhecida como CD31) ou isolectinA IB4 (uma glicoproteína que liga o glycocalyx endotelilista) para células endotélias, plaquetas derivaram fator de crescimento-β (PDGFRβ) ou antígeno neuronal-glial 2 (NG2) para pericitos e aquaporina-4 (AQP4) para ...

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Este protocolo é significativo porque permite a comparação da microvasculatura entre diferentes regiões do sistema nervoso central, bem como entre diferentes indivíduos. Esta técnica de isolamento de microvessel pode ser completada dentro de um único dia, e elimina a necessidade de ultracentrifugação e dissociação enzimática. Remover as meninges e o plexo coroide pode ser difícil.Certifique-se de trabalhar devagar e com cuidado para garantir a remoção completa de cada tecido. Para dissecção tecidual CNS de uma pequena amostra de vertebrados lissencéceicos, coloque o cérebro colhido em um tubo cônico de 15 mililitros contendo solução MV-1 no gelo, e use fórceps para recuperar a hipófise da sella turcica do crânio. Coloque a pituitária em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro de solução MV-1 no gelo, e remova a pele e o músculo para expor a coluna vertebral.Depois de remover os membros, a caixa torácica e os órgãos internos, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 para lavar a coluna vertebral com uma solução MV-1 fresca, em uma direção caudal-rostral em todo o forame vertebral lombar. Em seguida, coloque a medula espinhal em um tubo de 5 mililitros contendo uma solução MV-1 fresca. Em seguida, coloque o cérebro em uma placa de Petri sob o microscópio dissecando, e remova os meninges com picada de ponta dupla.Certifique-se de verificar a medula espinhal para garantir que não restam pedaços de meninges. Use os fórceps para separar o hipotálamo, cerebelo, tronco cerebral e córtex. Quando necessário, use fórceps e íris e tesouras de mola para extirir as lâmpadas olfativas e o tálamo, e use o espinho de duas pontas para remover todo o plexo coroide de todos os ventrículos cerebrais.Para dissecção de tecido CNS de uma grande amostra de vertebrados gyrencecencerásicos, use um microscópio dissecando e um espinho de duas pontas, fórceps e íris e tesoura de mola para remover as meninges de cada tecido CNS, tomando o cuidado de remover quaisquer pedaços de plexo choroide dos ventrículos cerebrais. Para homogeneização dos tecidos CNS colhidos, pique cada região do CNS em pedaços de um a dois milímetros dentro de placas de Petri individuais. Para homogeneizar os tecidos CNS de pequenas amostras de vertebrados, use uma pipeta de transferência para adicionar um mililitro de solução MV-1 para suspender o tecido picado.Em seguida, use a mesma pipeta de transferência para distribuir o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pedaços de medula espinhal em moedores individuais de tecido de vidro de 10 mililitros, e use um pilão PTFE e cinco mililitros de solução MV-1 para moer cada conjunto de tecidos por cerca de 10 golpes. Transfira cada chorume de tecido para tubos cônicos individuais de 15 mililitros no gelo, e use fórceps para colocar o hipotálamo e a pituitária em 100 microliters de solução MV-1, em tubos individuais de 1,7 mililitros. Em seguida, homogeneize cuidadosamente cada tecido com uma micropéda de vidro.Para homogeneizar uma grande amostra de vertebrados, use uma pipeta de transferência de corte chanfrada para transferir o tecido picado para um moedor de tecido de vidro de 55 mililitros, e anexar o moedor a um agitador aéreo. Adicione metade do volume recomendado da solução MV-1 de acordo com a parte específica do CNS sendo homogeneizada conforme indicado na tabela, e ligue o agitador aéreo para aproximadamente 150 rotações por minuto. Mova cuidadosamente o tubo de vidro para cima e para baixo por cerca de 30 segundos antes de desligar o agitador aéreo para adicionar mais solução MV-1 para homogeneização adicional, até que um chorume homogêneo seja obtido.Em seguida, transfira o tecido homogeneizado para um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Para purificação de microvasos, a pelota do tecido CNS homogeneiza por centrifugação e descarta os sobrenantes. Para um pequeno espécime vertebrado isolamento de microvessel, pipeta o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pelotas de medula espinhal, em cinco mililitros de solução MV-2 fresca e gelada por amostra, cerca de 10 vezes, antes de adicionar mais cinco mililitros de solução MV-2 gelada a cada tubo.Vire cuidadosamente os tubos para misturar, e suspenda as pelotas hipotálamo e pituitária em um mililitro de solução MV-2. Para o isolamento de microvessel de amostras de vertebrados grandes, adicione 20 mililitros de solução MV-2 gelada ao córtex, cerebelo, tronco cerebral e pelotas de microvessel da medula espinhal, e suspenda as pelotas em um revólver de tubo a 40 rotações por minuto por cerca de 5 minutos. No final da re-suspensão, separe os tecidos CNS por centrifugação e gire lentamente cada tubo para permitir que o supernatante passe ao longo da parede para desprender cuidadosamente a espessa e densa camada de mielina na interface líquida das paredes do tubo.Descarte as interfaces mielina e líquida, e borre a parede interna de cada tubo com uma espátula enrolada com um lenço de papel de fiapo baixo. Em seguida, use uma limpeza de papel de fiapo de baixo fiapo torcido para absorver o excesso de líquido e use pontas de baixa ligação para suspender novamente cada pelota em um mililitro de solução MV-3. Para elução e filtragem de microvalhos, misture alguns mililitros de solução MV-3 fresca para cada pasta de microvessel de tecido CNS, e enquanto se mistura para evitar agregados, coe cada suspensão através de um coador Pruitt em tubos cônicos individuais de 50 mililitros.Coloque um filtro de rede de nylon de 20 micrômetros em um suporte de filtro modificado por região CNS. Transfira o suporte do filtro para um tubo cônico de 50 mililitros e molhe o filtro com cinco mililitros de solução MV-3 gelada, certificando-se de que o tampão despeje o suporte do filtro, no tubo cônico. Transfira os microvexes elucidos para cada filtro de rede de nylon de 20 micrômetros e enxágue os microvaxes com cinco a dez mililitros de solução MV-3 gelada.Use fórceps para transferir cada filtro para béquers individuais contendo a solução MV-3 gelada e agite suavemente cada filtro por cerca de 30 segundos para separar os microvexes. Depois de transferir para um tubo cônico de 15 mililitros, colete os microvessels por centrifugação e use uma pipeta de baixa ligação para suspender derreta cada pelota em um mililitro de solução MV-3 gelada. Em seguida, transfira as suspensões de microvaxis de pequenos espécimes vertebrados em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro para centrifugação por cinco minutos a 20.000 vezes G, em quatro graus celsius.Para grandes espécimes de vertebrados, transfira a suspensão para tubos individuais de centrífugas de cinco mililitros e adicione quatro mililitros de solução MV-3 para centrifugação por cinco minutos a 2.000 vezes G em quatro graus celsius. Os componentes intrínsecos da unidade neurovascular podem ser detectados dentro de microvexilhões, isolados como demonstrado, por imunolabeling para CD31, PDGFR-beta e aquaporina quatro, incluindo os microvessels cortical, cerebelar, pituitário, hipotálamo, tronco cerebral e microvessels espinhais. Da mesma forma, a expressão da proteína de junção de aderentes VE-cadherin, as proteínas de junção apertada CLDN5 e Zonula Occludens-1, a proteína de junção tricelular angulin-1, e as marcas basais chemokine ligand CXCL motivo 12, e gama-glutamyltransferase-1, podem ser visualizadas.Além disso, a maioria dos microvaxes são desprovidos da expressão de actina muscular suave alfa, indicando que este protocolo de isolamento tem como alvo seletivamente microvessels de pequeno calibre. Microvaxes obtidos de outros pequenos vertebrados lissencéceicos, como aves, mentirosos, sapos e peixes, compartilham algumas características morfológicas, sugerindo que este método é útil para uma caracterização adicional das diferenças nas unidades neurovasculares entre as espécies. A quantificação das mudanças na expressão proteica revela um aumento na molécula de adesão celular vascular um, e a molécula de adesão juncional B ao longo de microvexes da medula espinhal, durante o pico da encefalomielite autoimune experimental.No entanto, a molécula de adesão celular vascular um também é significativamente aumentado em microvessels pituitários, e diminuiu nos microvessels hipotálamo e tronco cerebral. Além disso, alterações são observadas na molécula de adesão celular vascular uma expressão durante encefalomielite autoimune experimental crônica em todos os tecidos CNS, e na expressão da molécula de adesão da junção B nos microvessels hipotálamo e pituitário. Análises quantitativas, como a mancha ocidental, a PCR e a imunohistoquímica, podem ser realizadas após este procedimento para revelar insights sobre padrões de expressão genética e proteica dentro da barreira hematoencefálica.Paraformaldeído é um reagente agudamente tóxico, e deve ser sempre manuseado sob o capô da fumaça enquanto usa EPI adequado.

reliable-isolation-central-nervous-system-microvessels-across-five

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o isolamento de vasos intactos do cérebro de um camundongo que constituem a barreira hematoencefálica (BBB) junto com neurônios e células gliais. Os vasos isolados podem ser usados como um modelo in vitro para estudar seu papel na manutenção da homeostase cerebral.

Isolando vasos cerebrais de camundongos: um protocolo para isolar vasos intactos de amostras de cérebro murino

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de microvasos cerebrais de ratos sacrificados. Inclui a dissecção do cérebro, limpeza do tecido e digestão mecânica, seguida de centrifugação repetida para isolar a fração pura dos microvasos.

Um método para o isolamento de unidades neurovasculares do cérebro de ratos

As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMEC) são interconectadas por proteínas juncionais específicas formando uma barreira altamente regulada que separa o sangue e o sistema nervoso central (SNC), a chamada barreira hematoencefálica (BBB). O isolamento de células endoteliais microvasculares cerebrais murinas primárias, conforme discutido neste protocolo, permite estudos in vitro detalhados da BHE.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Descrevemos um protocolo que permite a purificação do compartimento vascular do cérebro do camundongo. Os vasos cerebrais isolados incluem células endoteliais ligadas por junções apertadas e cercadas por uma lâmina basal contínua, pericitos, células musculares lisas vasculares, bem como membranas astrogliais perivasculares.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

Este manuscrito descreve um protocolo simples e reprodutível para isolamento de arteríolas intracerebrais (um grupo de vasos sanguíneos que engloba arteríolas parenquimatosas, arteríolas penetrantes e arteríolas pré-capilares) de camundongos, para ser usado em miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.

Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.

Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

Aprenda a isolar microvasos do sistema nervoso central em vertebrados lissencefálicos e girencefálicos sem ultracentrifugação. Este método rápido permite comparar a microvasculatura entre diferentes regiões do SNC.

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Explorar mais vídeos