Name: Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda ensaios de migração e quimio-atração para células endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios GABAérgicos. Este método permite estudar interações celulares em distâncias de centímetros.

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Este trabalho contou com o apoio de premiações do Instituto Nacional de Saúde Mental (R01MH1110438) e do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (R01NS100808) à AV.

1. Cultura e Armazenamento de Células Endoteliais Periventriculares Humanas
<ol><li>Mantenha células endoteliais periventriculares humanas na membrana do porão revestida saciada (ver Tabela de Materiais) placas de 6 poços em meio de células endoteliais periventriculares (médio E6 contendo 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 μM GABA) a 37 °C e 5% CO2. Mude o meio todos os dias alternativos.</li>
	<li>Descongele a matriz de membrana do porão em 4 °C, e faça uma solução de 1:100 diluindo-a em meio DMEM/F12 frio. Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução matricial. Incubar placas a 37 °C por pelo menos 1h antes do uso.</li>
	<li>Permitir que células endoteliais periventriculares humanas atinjam uma confluência de 80%-90%. Meio aspirado do poço. Lave os poços uma vez com 1 mL de PBS 1x estéreis por poço.</li>
	<li>Desagregando células adicionando 1 mL de solução de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) por poço. Incubar a 37 °C por 5 min. Depois de 5 min, adicione 1 mL de meio celular endotelicular periventricular. Transfira a solução da célula para um tubo cônico de 15 mL. NOTA: Usamos Accutase para dissociação celular aqui, ao contrário do TrypLE nas seções 3 e 4.</li>
	<li>Células centrífugas a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente, aspiram o supernatante e resuspendem a pelota celular em 1 mL de meio celular endotelial periventricular.</li>
	<li>Conte células vivas usando o método de exclusão azul trypan. Células de sementes em placas frescas revestidas de matriz a uma densidade de 1,2 x 105 células/cm2. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Armazenar células endoteliais periventriculares humanas por criopreservação em meio de congelamento (90% de média de células endoteliais periventriculares e 10% DMSO).<ol>
<li>Dissociar e coletar células seguindo as etapas 1.3 e 1,4 acima. Conte células na solução pelo método de exclusão azul trypan.</li>
		<li>Células centrífugas a 500 x g por 5 min em temperatura ambiente. Aspirar o supernatante e resuspender a pelota celular a 5 x 106 células/ mL de meio congelante.</li>
		<li>Dispense 1 mL de células médias congelantes mais por criovial. Coloque os frascos na câmara cheia de isopropanol e esfrie durante a noite em -80 °C a 1 °C/min. Transfira frascos para um tanque de nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de Células Endoteliais Periventriculares Humanas para Ensaio
<ol><li>Permitir que as células endoteliais periventriculares humanas atinjam 70%-80% de confluência.</li>
	<li>Células dissociadas seguindo passos de 1,3 a 1,5 como descrito acima. Conte células usando o método de exclusão azul trypan.</li>
</ol>3. Preparação de Interneurônios Gabaergicos Humanos para Ensaio
NOTA: Célula-tronco pluripotente induzida pelo homem (iPSC) neurônios gabaergicos derivados e o meio neuronal foram comprados comercialmente (ver Tabela de Materiais). Os neurônios são gerados diferenciando uma linha de iPSC derivada de fibroblasto humano seguindo um protocolo desenvolvido pelo fabricante. As células foram descongelados e cultivados de acordo com o protocolo do fabricante.
<ol><li>Descongele interneurônios gabaergicos humanos e cultifique-os em placa de 12 poços por duas semanas para uma confluência de 70%-80%.</li>
	<li>No dia do ensaio, a solução de dissociação celular quente (ver Tabela de Materiais) e uma alíquota do meio neuronal a 37 °C por 10 min antes do uso.</li>
	<li>Aspirar o meio de cada poço que contém as células. Lave células com 1 mL de PBS estéreis 1x por poço.</li>
	<li>Desapego células adicionando 0,5 mL de solução de dissociação pré-aquecida por poço e incubam a 37 °C por 5 min. Adicione 1 mL de meio neuronal por poço. Transferir a solução celular para um tubo cônico de 15 mL. Triturar suavemente para dissociar aglomerados de células.</li>
	<li>Células centrífugas a 380 x g por 5 min à temperatura ambiente, aspiram o supernatante e resuspendem a pelota celular em 1 mL de meio neuronal. Conte células vivas usando o método de exclusão azul trypan.</li>
</ol>4. Preparação do controle de células endoteliais humanas para ensaio
NOTA: Controle células endoteliais derivadas do IPSC e o meio celular endotelial foram comprados comercialmente (Tabela de Materiais). Essas células endoteliais são geradas por diferenciar uma linha de iPSC derivada de fibroblasto humano para destino endotelial seguindo um protocolo desenvolvido pelo fabricante. As células foram descongelados e cultivados no substrato fibronectina de acordo com o protocolo do fabricante. Placas revestidas de fibronectina foram preparadas seguindo o protocolo do fabricante.
<ol><li>Descongelar controle células endoteliais humanas e as cultura em placa de 6 poços a uma confluência de 80%-90%.</li>
	<li>No dia do ensaio, a solução de dissociação celular quente (ver Tabela de Materiais) e uma alíquota do meio endotelial a 37 °C por 10 min antes do uso.</li>
	<li>Aspirar o meio de cada poço contendo as células. Lave células com 1 mL de PBS estéreis 1x por poço.</li>
	<li>Desagregando células adicionando 0,5 mL de solução de dissociação pré-aquecida por poço. Incubar à temperatura ambiente por 5 min. Adicione 1 mL de células endoteliais média por poço para neutralizar a solução de dissociação. Transferir a solução celular para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Células centrífugas a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente. Aspirante e resuspender a pelota celular em 1 mL de meio celular endotelial. Conte células vivas usando o método de exclusão azul trypan.</li>
</ol>5. Preparação de inserções culturais de um poço
<ol><li>Descongele 1 mg/mL solução de laminin a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Cubra um número apropriado de pratos de 35 mm com 0,01% de solução poli-l-ornithine (1 mL por prato). Incubar os pratos em temperatura ambiente por pelo menos 1h.</li>
	<li>Diluir 1 mg/mL solução de laminin a 1:300 em água estéril para uma concentração final de 3,3 μg/mL imediatamente antes do uso.</li>
	<li>Poli-L-ornithine completamente aspirada de cada prato. Enxágüe cada prato completamente 3x com água estéril e aspira completamente para evitar toxicidade celular induzida por poli-L-ornithine.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 3,3 μg/mL solução laminada a cada prato e incuba a 37 °C durante a noite ou pelo menos 1 h. Remova a solução laminada do prato imediatamente antes do uso. NOTA: Alternativamente, guarde os pratos contendo lamina em 4 °C. Equilibre os pratos em uma incubadora de cultura celular de 37 °C antes do uso.</li>
	<li>Corte três lados de um poço de uma inserção de cultura de silicone de dois poços (Figura 1A) usando uma lâmina estéril para gerar uma inserção de um poço(Figura 1B). NOTA: Mantenha a inserção de dois poços firmemente ligada à superfície da embalagem original enquanto corta para garantir um corte suave e proteger a adesão da inserção.</li>
	<li>Solução laminada aspirada dos pratos. NOTA: Não lave os pratos com PBS estéreis ou água após incubação de laminin. Superfícies úmidas evitarão aadesão apertada da inserção da cultura.</li>
	<li>Remova uma inserção de um poço com pinças estéreis e coloque-a no centro do prato revestido poli-L-ornithine/laminin. Pressione ao longo das bordas da inserção para corrigi-lo na superfície do prato.</li>
	<li>Gire cuidadosamente o prato de cabeça para baixo para verificar se a inserção é firmemente aderida.</li>
	<li>Mantenha o prato de cabeça para baixo e marque o limite do compartimento de inserção usando um marcador preto permanente com uma ponta ultra-fina (Figura 1C).</li>
</ol>6. Ensaio migratório de longa distância
<ol><li>Suspenda os interneurônios gabaergicos humanos a uma concentração de 3 x 104 células/70 μL de meio neuronal. Sementes 70 μL de solução celular dentro de cada inserção de cultura de um poço. NOTA: A densidade de semeade dos interneurônios é conforme recomendação do fabricante.</li>
	<li>Suspender células endoteliais periventriculares humanas a uma concentração de 3 x 104 células/70 μL de meio celular endotelial periventricular. Sementes 70 μL de solução celular dentro de cada inserção de cultura de um poço. NOTA: O número de células endoteliais periventriculares humanas semeadas a uma proporção de 1:1 com o número de neurônios semeados.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio neuronal na antena do neurônio para preencher a área ao redor da inserção e evitar que o revestimento seque. Da mesma forma, adicione 1 mL de célula endotelicular periventricular em prato de célula endotelial periventricular. NOTA: Adicione o meio lentamente ao longo da borda do prato para que a inserção não seja perturbada.</li>
	<li>Verifique um microscópio para verificar se as células não estão vazando do compartimento de inserção.</li>
	<li>Incubam células por 24 h a 37 °C e 5% CO2. Após 24 h de incubação, verifique microscópio para verificar se as células se conectaram corretamente e não há vazamento noturno.</li>
	<li>Após 48 h de semeade, remova delicadamente a inserção usando uma pinça estéril. Verifique o microscópio para verificar se a camada celular permanece intacta (dia 0).</li>
	<li>Remova o meio da antena do neurônio e adicione 1 mL de meio neuronal fresco. Da mesma forma, remova o meio da antena celular endotelicular periventricular e adicione 1 mL de meio celular endotelial periventricular fresco. NOTA: Reserve um número necessário de pratos e fixe com 4% de PFA para imagens do dia 0.</li>
	<li>Incubam células por 5 dias a 37 °C e 5% de CO2. Após 5 dias, remova as células médias, fixe células com 4% de PFA por 10 min, e lave 3x com 1x PBS.</li>
	<li>Mancham neurônios com β-tubulina anti-humana ou anticorpo MAP2 anti-humano, e células endoteliais com anticorpo CD31 anti-humano. No final da imunocoloração, adicione 1 mL de montagem antifumada média a cada prato.</li>
</ol>7. Ensaio de Migração cocultura
<ol><li>Co-suspender 3 x 104 interneurônios GABAergic e 3 x 104 células endoteliais periventriculares humanas em 70 μL de meio de cocultura (50% de manutenção periventricular sem GABA e 50% de meio neuronal). Semente esta solução celular dentro do compartimento de inserção de um poço. Prepare um número apropriado de pratos de ensaio. NOTA: O GABA não foi adicionado no meio da cocultura para excluir o efeito do EXógeno GABA na migração.</li>
	<li>Verifique um microscópio para verificar se as células não estão vazando do compartimento de inserção.</li>
	<li>Adicione lentamente 1 mL de meio de cocultura ao longo do lado do prato para evitar que o revestimento seque. NOTA: Adicione o meio lentamente ao longo da borda do prato para que a inserção não seja perturbada.</li>
	<li>Como primeiro controle, sementes 3 x 104 interneurônios gabaergicos humanos apenas em 70 μL de meio de cocultura por inserção de um poço. Prepare um número apropriado desses pratos.</li>
	<li>Como segundo controle, co-sementes 3 x 104 neurônios humanos GABAergic com 3 x 104 controlam células endoteliais humanas em 70 μL de meio de cocultura por inserção de um poço. Prepare um número apropriado de pratos.</li>
	<li>Incubar os pratos por 24 h a 37 °C e 5% DE CO2. Após 24 h de incubação, verifique um microscópio para verificar se as células se conectaram corretamente e não há vazamento.</li>
	<li>Após 48 h de semeade, remova delicadamente a inserção usando uma pinça estéril. Verifique o microscópio para verificar se a camada celular não está perturbada (dia 0).</li>
	<li>Remova o meio e adicione 1 mL de meio de cocultura fresco. NOTA: Reserve um número apropriado de pratos para aquisição de imagens do dia 0.</li>
	<li>Incubam células por 5 dias a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Após 5 dias, remova as células médias, fixe células com 4% de PFA por 10 min, e lave 3x com 1x PBS.</li>
	<li>Mancha com β-tubulina anti-humana ou anticorpo MAP2 anti-humano para rotular os neurônios. No final da imunocoloração, adicione 1 mL de montagem antifumada média a cada prato.</li>
</ol>8. Ensaio de atração de quimioterapia
<ol><li>Coloque uma inserção de cultura de três poços no centro de um prato poli-l-ornithine/laminin revestido de 35 mm usando pinças estéreis.</li>
	<li>Vire o prato de cabeça para baixo. Marque o limite ao redor do compartimento médio da inserção usando um marcador preto permanente com ponta ultra-fina.</li>
	<li>Sementes 3 x 104 interneurônios gabaergicos humanos no compartimento médio em 70 μL de meio neuronal (Figura 3A).</li>
	<li>Sementes 104 células endoteliais periventriculares humanas em 70 μL de média de células endoteliais periventriculares e 104 células endoteliais de controle em 70 μL de meio de célulaendotelal de controle nos dois compartimentos externos respectivamente(Figura 3A).</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio de cocultura (50% de manutenção periventricular média sem GABA e 50% de meio neuronal) ao longo da lateral do prato para evitar que o revestimento no prato seque.</li>
	<li>Verifique o microscópio para verificar se as células não estão vazando do compartimento de inserção.</li>
	<li>Incubam células por 24 h a 37 °C e 5% CO2. Após 24 h de incubação, verifique um microscópio para verificar se as células se conectaram corretamente e não há vazamento.</li>
	<li>Após 48 h de semeade, remova delicadamente a inserção usando uma pinça estéril. Verifique o microscópio para verificar se a camada celular não está perturbada (dia 0).</li>
	<li>Remova o meio e adicione 1 mL de meio de cocultura fresco. NOTA: Reserve o número necessário de pratos para imagens do dia 0.</li>
	<li>Incubam células por 36 h a 37 °C e 5% CO2. Após 36 h, meio aspirado, fixe células com 4% de PFA por 10 min, e lave 3x com 1x PBS.</li>
	<li>Mancha os interneurônios gabaergicos humanos com β-tubulina anti-humana ou anticorpo MAP2 anti-humano. No final do procedimento de coloração, adicione 1 mL de montagem de antifídeo em cada prato.</li>
</ol>9. Análise de Imagem e Dados
<ol><li>Coloque o prato de ensaio imunomanchado um microscópio na ampliação 4X.</li>
	<li>Mantenha uma borda longa do limite retangular (feito na etapa 5.10 acima) no campo de visão. Tire imagens de células no espaço livre de células adjacente a esse limite. Adquirir imagens ao longo da borda longa direita e da borda esquerda do limite retangular(Figura 2B). NOTA: As células posicionadas na diagonal em relação ao retângulo não são consideradas devido à ambiguidade na seleção da ponta curta ou longa como marca de partida. Além disso, o número de células migrando através da borda curta são muitas vezes significativamente menores (possivelmente devido ao menor número de células iniciais ao longo da borda curta) e não são considerados.</li>
	<li>Abra as imagens no ImageJ. Calcule a distância entre cada célula e a marca de limite(Figura 2D) usando ImageJ.</li>
	<li>Para avaliar a migração em termos de número de células, estabeleça uma distância específica do limite na imagem adquirida no ImageJ. Conte o número de células que estão presentes a essa distância. Calcular número médio, desvio padrão e significância estatística usando software apropriado.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

Aqui, descrevemos três ensaios in vitro que, juntos, fornecem avaliação quantitativa de propriedades específicas de células endoteliculares periventriculares humanas. Esses ensaios serão valiosos para obter insights mecanicistas sobre a interação de células endoteliais periventriculares humanas com interneurônios humanos. Experimentos usando ligands, inibidores ou células com knockdown ou superexpressão específicas de genes identificarão ou validarão jogadores moleculares que mediam a migração interneurônio guiada por cé...

As células endoteliais formam o revestimento dos vasos sanguíneos e mediam funções importantes que incluem manutenção da permeabilidade da parede do vaso, regulação do fluxo sanguíneo, agregação de plaquetas e formação de novos vasos sanguíneos. No cérebro, as células endoteliais fazem parte de uma barreira cerebral-cérebro crítica que controla firmemente a troca de materiais entre o cérebro e a corrente sanguínea1. Nossos estudos na última década identificaram novos papéis neurogênicos de células endoteliais cerebrais que têm implicações significativas para o desenvolvimento e comportamento cerebral2,3,4,5. Mostramos que o cérebro embrionário do camundongo é vascularizado por dois subtipos distintos de vasos, os vasos pial e os vasos periventriculares, que diferem em anatomia, origem e perfil de desenvolvimento2. Células endoteliais que revestem esses dois subtipos de vasos mostram diferenças distintas em seus perfis de expressão genética. Enquanto as células endoteliais pial expressam principalmente genes relacionados à inflamação e à resposta imune, as células endoteliais periventriculares são enriquecidas exclusivamente na expressão de genes comumente associados à neurogênese, migração neuronal, quimiotaxe e orientação de axôon3. Células endoteliais periventriculares também abrigam um novo caminho de sinalização GABA que é distinto do tradicional caminho de sinalização neuronal GABA5. Concomitante com sua expressão genética, células endoteliais periventriculares foram encontradas para regular a migração e distribuição de interneurônios gabaergicos no neocórtex em desenvolvimento. Durante o desenvolvimento embrionário, as células endoteliais periventriculares sofrem migração de longa distância ao longo de um gradiente ventral-dorsal para estabelecer a rede vascular periventricular2,3. Esta rota migratória é espelhada um dia depois por interneurônios. Os interneurônios migratórios interagem fisicamente com a rede vascular periventricular pré-formada e a usam como um guia para chegar ao seu destino final no neocórtex. Além de atuarem como substrato físico, as células endoteliais periventriculares servem como fonte de sinais de navegação para neurônios migratórios. Gaba endotelicular endotelial de células periventriculares guia a migração interneurônios e regula seus padrões finais de distribuição4. Defeitos na migração e distribuição interneurônios estão associados a transtornos neuropsiquiátricos como autismo, epilepsia, esquizofrenia e depressão6,7,8,9,10. Portanto, o estudo das funções endoteliais endoteliais periventriculares e sua influência na migração interneurônio no contexto humano torna-se fundamental para abordar a patogênese desses transtornos.
Geramos células endoteliais periventriculares humanas a partir de células-tronco embrionárias humanas em nosso laboratório11, usando tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)12,13. Para validar se as células endoteliais periventriculares humanas imitam fielmente células endoteliais periventriculares do camundongo e para avaliar quantitativamente sua influência na migração interneurônios, desenvolvemos três ensaios in vitro: um ensaio migratório de longa distância, um ensaio migratório de cocultura e um ensaio de atração de quimioterapia. Aqui descrevemos protocolos para esses ensaios em detalhes. Todos os três ensaios são baseados no uso de pastilhas de cultura de silicone para criar um pequeno retangular de células (de dimensões fixas) cercadas por espaço livre de células. A distância migratória é avaliada medindo a distância entre as posições finais das células da fronteira do patch retangular que foi delineado no dia 0. No ensaio de migração de longa distância, as células endoteliais periventriculares humanas são semeadas como um remendo no centro de uma antena de 35 mm, e as distâncias percorridas pelas células ao longo de um longo período de tempo são calculadas. No ensaio de migração da cocultura, as células endoteliais periventriculares humanas são co-semeadas com interneurônios humanos como um remendo em um prato de 35 mm. Esta configuração permite examinar o efeito das interações físicas diretas desses dois tipos de células na taxa de migração de interneurônios. O ensaio quimio-atração mede a migração de interneurônios em resposta a pistas quimio-atraentes secretadas por células endoteliais periventriculares humanas. Os interneurônios são semeados como um remendo retangular, com células endoteliais periventriculares humanas e controlam células endoteliais não periventriculares semeadas como remendos de tamanho semelhante em ambos os lados. Cada uma das manchas de células são separadas por uma lacuna livre de células de 500 μm. A resposta dos interneurônios é avaliada por quantificar o número de células que migraram para células endoteliais periventriculares em comparação com o controle de células endoteliais não periventriculares.
Esses ensaios fornecem uma avaliação robusta das funções endoteliais eendteliculares humanas e sua influência na migração interneurônios. A nova configuração de ensaio saque de longa distância e ensaio de migração de co-cultura fornece espaço livre de células na faixa de centímetros (~1-1,5 cm) para permitir a detecção da migração de longa distância. Um resumo das características de nossos ensaios em comparação com outros ensaios populares é apresentado na Tabela 1. Coletivamente, os ensaios descritos aqui servirão como uma plataforma para avaliar células endoteliais endoteliais eendrâneos periventriculares "doentes" e interneurônios gerados a partir de iPSCs de distúrbios cerebrais como esquizofrenia, autismo ou epilepsia. Esses ensaios também podem ser usados para determinar como diferentes condições (por exemplo, inibidores, ligands, RNAi) afetam a migração celular. Finalmente, esses ensaios podem ser otimizados para outros tipos de células para medir a migração de longa distância, a atração de quimioterapia ou a migração mediada por células.

<table><tbody><tr><td>Solução de dissociação Accutase</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR005</td><td>Solução de dissociação celular (para células endoteliais periventriculares, etapa 1.4)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-beta;-tubulina humana</td><td>Biolegend</td><td>802001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD31 humano Anticorpo</td><td>Millipore Sigma</td><td>CBL468</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Neurômica</td><td>CH22103</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ativo Caspase 3</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB3623</td><td></td></tr><tr><td>Controle de células endoteliais humanas</td><td>Dinâmica Celular</td><td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>Controle de células endoteliais Suplemento Médio</td><td>Dinâmica Celular</td><td>M1019</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEMF / 12 médio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>E6 médio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Neurônios GABAérgicos Humanos</td><td>Dinâmica Celular</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>Neurônios GABAérgicos Humanos meio de base</td><td>Dinâmica Celular</td><td>M1010</td><td></td></tr><tr><td>Neurônio GABAérgico Humano Suplemento neural</td><td>Dinâmica Celular</td><td>M1032</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr>Matriz de <td>membrana de porão</td> <td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td></tr><tr><td>Montagem Medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-ornitina</td><td>Sigma</td><td>p4957</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermofisher Solução de</td><td></td><td>dissociação celular 12563011 científica (para interneurônios GABAérgicos e células endoteliais, seções 3 e 4)</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>Lifeline Cell Technologies</td><td>LL-0003</td><td>Componente do meio de células endoteliais humanas de controle Cultura de</td></tr><tr><td>silicone de 2 poços - Inserção</td><td>de silicone ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr> de <tr><td>3 poços inserto de cultura</td><td>ibidi</td><td>80369</td><td></td></tr><tr><td>prato de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Solução de PFA a 4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase invertida</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>FSX-100</td><td></td></tr></tbody></table>

migração, quimio-atração e ensaios de cocultura para células endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

O papel da vasculatura cerebral no desenvolvimento do sistema nervoso e na etiquetação de distúrbios cerebrais está ganhando cada vez mais atenção. Nossos estudos recentes identificaram uma população especial de células vasculares, as células endoteliais periventriculares, que desempenham um papel crítico na migração e distribuição de interneurônios gabaergicos do cérebro anterior durante o desenvolvimento embrionário. Isso, juntamente com suas funções autônomas de células, alude a novos papéis de células endoteliais periventriculares na patologia de doenças neuropsiquiátricas como esquizofrenia, epilepsia e autismo. Aqui, descrevemos três ensaios in vitro diferentes que avaliam coletivamente as funções das células endoteliais periventriculares e sua interação com interneurônios gabaergicos. O uso desses ensaios, particularmente em um contexto humano, nos permitirá identificar a ligação entre células endoteliais periventriculares e distúrbios cerebrais. Esses ensaios são simples, de baixo custo e reprodutíveis, e podem ser facilmente adaptados a qualquer tipo de célula aderente.

Os passos para configurar uma inserção de cultura de um poço dentro de um prato de 35 mm são mostrados na Figura 1. Ensaio seleção de migração de longa distância e ensaio de migração de co-cultura usaram uma inserção de um poço para semear o número desejado de células no centro de uma antena poli-L-ornithine/laminin revestida de 35 mm. No dia 0, as células estavam presentes como um remendo retangular (Figura 2A,C...

Apresentamos três simples ensaios in vitro - o ensaio migratório de longa distância, o ensaio de migração de cocultura, e o ensaio de atração de quimioterapia - que avaliam coletivamente as funções das células-tronco humanas derivadas células endoteliais periventriculares e suas interação com interneurônios GABAergic.

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Este protocolo descreve três ensaios in vitro que avaliam coletivamente as funções das células endoteliais periventriculares humanas e sua interação com interneurônios gabaérgicos humanos. Os resultados desses ensaios fornecerão uma visão crítica sobre a ligação entre células endoteliais periventriculares e distúrbios cerebrais. Estes ensaios são simples, de baixo custo e permitem a medição da migração celular na faixa de centímetros, o que não é alcançado por outros ensaios existentes.Defeitos na migração e distribuição de interneurônios GABAérgicos estão associados a transtornos psiquiátricos, como autismo, epilepsia, esquizofrenia e depressão. Por isso, é fundamental estudar a interação das células endoteliais periventriculares com interneurônios GABAérgicos no contexto humano para enfrentar a patogênese desses transtornos. Comece preparando células humanas para o ensaio.Permitir que as células endoteliais periventriculares humanas atinjam 70 a 80% de confluência e dissociá-las de acordo com as instruções do manuscrito e contá-las usando o método de exclusão azul trypan. Para preparar interneurônios gabaérgicos humanos, solução de dissociação celular quente e uma alíquota de meio neuronal a 37 graus celsius por 10 minutos. Em seguida, aspire o meio de cada poço contendo células e lave-as com um milímetro de PBS por poço.Retire as células adicionando 0,5 mililitros de solução de dissociação pré-armada por poço e incubando-as a 37 graus celsius por cinco minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de meio neuronal por poço e transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mililitros, triturando suavemente para dissociar aglomerados celulares. Centrifugar as células a 380 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente, aspirar o supernasal e resuspensar a pelota celular em um mililitro de meio neuronal.Em seguida, conte as células vivas usando a exclusão azul trypan. Prepare o controle das células endoteliais humanas aquecendo a solução de dissociação celular e uma alíquota de meio endotelial a 37 graus celsius, 10 minutos antes do uso. Aspirar o meio de cada poço e lavá-los com um mililitro de PBS por poço.Retire as células adicionando 0,5 mililitros da solução de dissociação pré-armada a cada poço e incubando a placa em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio celular endotelial por poço para neutralizar a solução de dissociação, e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar as células a 200 vezes G por cinco minutos, aspirar o supernasciente e resuspensar as células em um mililitro de meio celular endotelial.Em seguida, use o método de exclusão do tripano para contar as células. Prepare uma inserção de cultura bem,cortando três lados de um poço de uma inserção de cultura de silicone de dois poços com uma lâmina estéril. Remova a pastilha com pinças estéreis e coloque-a no centro de um prato poli-L-ornithine e laminin revestido, em seguida, pressione ao longo da borda da inserção para fixá-lo à superfície.Vire cuidadosamente o prato de cabeça para baixo para verificar se a inserção está firmemente aderida, e marque o limite do compartimento de inserção usando um mercado negro permanente com uma ponta ultra fina. Suspender interneurônios gabaérgicos humanos em células endoteliais periventriculares periventriculares periventriculares e humanas e meio de células endoteliais a uma concentração de 30.000 por 70 microlitadores, em seguida, sementes 70 microliters da solução celular dentro de cada inserção de cultura bem. Adicione um mililitro de meio neuronal ao prato do neurônio para preencher a área ao redor da pastilha e evitar que o revestimento seque.Da mesma forma, adicione um mililitro de meio celular endotelial ao prato de célula endotelial periventricular. Verifique as células sob um microscópio para verificar se elas não estão vazando do compartimento de inserção e, em seguida, incuba-as a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a incubação, verifique novamente as células sob o microscópio para verificar se elas foram devidamente anexadas.48 horas após a semeadura, remova suavemente a inserção com pinças estéreis e verifique as células sob o microscópio para verificar se a camada celular permanece intacta. Remova o meio tanto do neurônio quanto dos pratos celulares endoteliais periventriculares, e adicione um mililitro de meio fresco a cada prato. Incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias.Em seguida, remova o meio, fixe as células com 4%PFA por 10 minutos e lave-as três vezes com PBS. Para realizar o ensaio de cocultura, suspenda 30.000 interneurônios GABAérgicos e 30.000 células endoteliais periventriculares humanas em 70 microlitrais de meio de co-cultura, em seguida, semeou esta solução celular dentro de um compartimento de inserção de um poço. Após 48 horas, remova a inserção.Incubar a cocultura a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Após a incubação, remova o meio, fixe as células com 4%PFA e lave-as três vezes com PBS. Para realizar o ensaio de quimio-atração, coloque uma inserção de três poços de cultura no centro de um prato de 35 milímetros revestido de poli-L e laminina, vire o prato de cabeça para baixo e marque o limite ao redor do compartimento médio da inserção usando um marcador permanente com uma ponta ultra fina.Sementes 30.000 interneurônios GABAérgicos em 70 microliters de meio neuronal no compartimento médio, depois sementes 10.000 células endoteliais periventriculares e 10.000 células endoteliais de controle e 70 microliters de seu respectivo meio nos dois compartimentos externos. Adicione um mililitro de meio de co-cultura ao longo do lado do prato para evitar que o revestimento no prato seque. Após 48 horas, remova a inserção e incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 36 horas.Após a incubação, remova o meio, fixe as células e lave-as três vezes com PBS. Ensaios migratórios de longa distância e cocultura foram utilizados para investigar as interações entre células endoteliais periventriculares e neurônios GABAérgicos. No ensaio de migração de longa distância, as células começaram como um patch retangular no dia zero, mas por 48 horas, elas migraram para o espaço livre de células.A coloração imunocitoquímica com anticorpo Caspase-3 anti-ativo, um marcador de apoptose, não mostrou sinal apoptótico nos neurônios semeados. No ensaio de migração da cocultura, quando os interneurônios foram co-semeados com células endoteliais periventriculares humanas, os neurônios percorreram distâncias mais distantes em comparação com quando os interneurônios eram semeados sozinhos ou quando co-semeados com células endoteliais de controle. No ensaio de quimio-atração, um número significativamente maior de interneurônios migraram para células endoteliais periventriculares em comparação com células endoteliais de controle, confirmando que os interneurônios GABAérgicos respondem seletivamente a pistas quimio-atraentes secretadas por células endoteliais periventriculares.Esses ensaios podem ser modificados usando ligantes, inibidores ou arenes de ensaio para obter insights mecanicistas sobre interações de células endoteliais periventriculares humanas com interneurônios humanos. Eles também podem ser usados para estudar a interação das células endoteliais periventriculares humanas com outras células neurais, como relatado pelo nosso grupo e outros. Ao tentar este procedimento, é importante fixar a inserção firmemente no prato e mantê-lo intacto durante todo o ensaio, caso contrário, pode levar a vazamento celular, descolamento celular ou desalinhamento da inserção com o limite desenhado.Nosso trabalho indicou papel autônomo celular das células endoteliais periventriculares humanas em patogênese de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, epilepsia e autismo. Esses ensaios permitirão, portanto, a avaliação de células endoteliais periventriculares doentes derivadas de pacientes com esses transtornos usando a tecnologia IPSC.

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JoVE Journal

Neuroscience

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Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos (Vídeo) | JoVE Journal

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