Protocolo do Banco Cerebral Abbiategrasso para coleta, processamento e caracterização de cérebros envelhecidos

Como a prevalência de transtorno neurocognitivo está aumentando continuamente, nosso objetivo é obter, caracterizar e armazenar amostras de tecido cerebral de qualidade para alcançar um diagnóstico preciso e lançar luz sobre os mecanismos neurodegenerativos. Considerando a assimetria cerebral, nossa metodologia amostral permite que todos os meta estudos sejam realizados em tecidos histologicamente bem definidos de ambos os hemisférios e os muitos dados podem ser coletados e correlacionados através do aprendizado profundo. Efeitos aditivos sobre danos cerebrais por múltiplas patologias são frequentemente observados.

O diagnóstico definitivo requer a combinação da síndrome clínica com os achados neuropatológicos para descobrir a patogênese da doença e possíveis terapias. Novos procedimentos de corte, bem como o gerenciamento de seções de macro são complicados, mas também são essenciais para alcançar bons resultados. Uma equipe treinada e unida é crucial para superar essas dificuldades.

Nosso protocolo inclui uma série de etapas que são necessárias para a destreza dos mamíferos, portanto, a demonstração visual pode ser mais útil do que textos descritivos para pesquisadores que desejam dominar essas técnicas. Após confirmar a doatografia, use um bisturi afiado para fazer uma incisão do couro cabeludo através da pele do cabelo e tecido subcutâneo na placa coronal da ponta do processo mastoide de um lado para o outro, passando sobre o vértice. Separe as duas dobras do couro cabeludo cuidadosamente do crânio e continue a incisão até que a gordura super orbital amarela se torne visível.

Reflita o couro cabeludo anteriormente e puxe a outra seção do tecido posteriormente. Usando um bisturi e fórceps, colher uma pequena amostra do músculo temporal em cada lado do crânio, colocando um espécime em 4% de formaldeído e a outra amostra a quatro graus Celsius. Usando uma serra elétrica corte o crânio em um corte V no lado frontal e remova a tampa do crânio.

Depois de cortar as meninges, colher um pedaço de dura para fixação e outro para congelar. Insira uma agulha de 3,5 polegadas de calibre 20 presa a uma seringa de 10 mililitros através do caloso corpus para chegar ao terceiro ventrículo e retrair o êmbolo para obter cerca de 10 mililitros de fluido espinhal cerebral. Avalie a cor da aparência e a turbidez do fluido e meça o pH.

Puxe suavemente os dois lobos frontais para levantar o cérebro e corte os nervos ópticos infundibulum, as artérias carótidas internas e o terceiro, quarto, quinto e sexto nervos cranianos. Corte o tentorium para alcançar a fossa posterior e corte as artérias vertebrais e os nervos cranianos inferiores. Em seguida, insira o bisturi o mais profundo possível através do foien magnum para cortar a porção mais caudal da medula e remover cuidadosamente todo o cérebro.

Use o bisturi para aparecer até o osso sobre a caverna de Meckel e coletar o gânglio gasseriano de cada lado para fixação e congelamento. Use um martelo cirúrgico e um cinzel para fraturar a sella turcica óssea e remover a glândula pituitária para fixação em 4% de formaldeído. Inspecione o crânio e todo o cérebro a partir de alterações macroscópicas e alterações vasculares.

Use uma fita de medição para medir os diâmetros de postura transversais e anteriores do cérebro e pesar o cérebro em uma escala. Recupere cuidadosamente o círculo de Willis para avaliação macroscópica para a presença de variantes anatômicas, lesões ou estenose do vaso. Separe e inspecione o cerebrum, cerebelo e tronco cerebral antes de pesar os tecidos individualmente.

Remova de um a dois, dois a quatro centímetros quadrados de leptomeninges da convexidade e preserve as amostras em meio completo de cultura DMEM de alta glicose a quatro graus Celsius. Colher a glândula pineal para fixação em 4% de formaldeído e remover as lâmpadas olfativas e nervos ópticos para a fixação e congelamento de um de cada par. Coloque o cerebrum, o cerebelo e o tronco cerebral no gelo a quatro graus Celsius.

Quando todos os tecidos de interesse forem colhidos, use uma cola super adesiva para recolocar o osso e usar uma agulha cirúrgica, e suturas não absorvíveis para costurar o couro cabeludo. Para dissecção do banco cerebral use uma faca dissecando para cortar o tronco cerebral axially e fazer o primeiro corte ao nível do cérebro médio rostral através do collículo superior para obter duas fatias para expor a substantia nigra. Corte o tronco cerebral em 10, oito milímetros de fatias tomando o cuidado de incluir cortes que passam pelos pons rostral perto das margens superiores do quarto ventrículo para observar o lócus caeruleus e através da medula oblongata inferior à estria acústica, logo acima do ápice inferior do quarto ventrículo para obter fatias incluindo o núcleo motor dorsal do vagus.

Rotule todas as fatias de forma caudal rostral como BS para tronco cerebral seguido por numerais árabes. Após a última seção brainstem, use a designação SC para medula espinhal seguida por numerais árabes. Corte o cerebelo no plano sagital para separar os dois hemisférios cerebelares ao nível dos vermímis e realize a secção sagital para obter cinco fatias de cada hemisfério.

Nomeie todas as fatias dos vermísis como CBR ou CBL para o cerebelo direito e esquerdo, respectivamente, e use numerais árabes para identificar cada seção. Em seguida, separe os dois hemisférios do cerebrum através do caloso corpus no plano sagital antes de cortar o hemisfério tão singularmente ao longo do plano coronal passando entre o quiasma óptico e os corpos mammillary através do polo temporal do lobo frontal, cingulado anterior, comissure anterior, núcleo de gânglios menores e basais. Faça um segundo corte de cerca de um centímetro posteriormente passando pelos corpos mammillary e expondo os gânglios basais, tálamo anterior sub tálamo e amígdala.

Continue cortando para dissecar as regiões anterior e posterior até que fatias de 15 a 21 centímetros tenham sido obtidas para cada hemisfério. A parte em que a fatia está sobre uma superfície plana à medida que são atingidas seguindo sua posição original na direção posterior anterior da parte frontal ao polo occipital, com a porção contínua com os slides anteriores voltados para cima. Quando todas as fatias tiverem sido colocadas selecione as principais seções a serem fixadas para histopatologia, incluindo as seções adquiridas anteriormente e as seções hipocampal, parietal e occipital, e rotule as fatias como L ou R seguidas por numerais árabes, incluindo um rótulo indicando se a fatia deve ser fixada ou congelada.

Quando todos os tecidos tiverem sido seccionados e rotulados, obtenha uma imagem para cada série de seções antes de sua fixação ou congelamento. Para congelar as amostras coloque as seções de tecido alternativo reservadas em uma bandeja de alumínio pré-congelada e cubra as seções com uma placa de alumínio entrelaçada para mantê-las planas. Em seguida, congele as fatias em nitrogênio líquido por três minutos antes de colocar as amostras congeladas dentro de um saco plástico rotulado com seus códigos de identificação correspondentes e números de fatias para um armazenamento na caixa criogênica apropriada a 80 graus Celsius.

Para corrigir as amostras coloque as seções de tecido alternativo reservadas em pedaços individuais de gaze e coloque as fatias em solução de formalina tamponada de fosfato de 10% por cinco dias em uma sala fria de quatro graus Celsius. 24 dos 27 cérebros colhidos receberam a caracterização neuropatológica completa com um diagnóstico patológico clínico definitivo. A análise preliminar de eletroencefalograma quantitativo de uma série de 36 doadores cerebrais indica que a porcentagem principal do ritmo alfa é significativamente menor em grandes distúrbios neurocognitivos do que em uma doença neurocognitiva leve de idosos normais.

Aqui um exemplo de patologia assimétrica é mostrado com uma atrofia do lado direito evidente macroscopicamente com as severas dilatações ventriculares observadas na seção coronal direita em comparação com a esquerda. Outro caso apresenta um infarto do hemisfério direito, enquanto outro espécime mostra uma atrofia clara do corpo mamário direito. As seções macro podem ser manchadas para identificar a perda de mielina ou a distribuição da imunoreatividade dentro dos hemisférios.

Estas amostras são de gêmeos que tiveram um início clínico da doença de Alzheimer em diferentes períodos devido a fatores epigenéticos e ambientais. No entanto, a análise microscópica revelou um quadro neuropatológico muito semelhante indicando uma alta patologia da doença de Alzheimer e angiopatia amiloide. Nesses dois pacientes, porém, o mesmo diagnóstico clínico da doença de Alzheimer não correspondia exatamente às características neuropatológicas, que revelaram uma dupla de demência em múltiplas etiologias.

De fato, o primeiro caso apresentou corpos de Lewy na mentira única do giro e na substantia nigra. E o segundo caso mostrou corpos de Lewy associados com neurites lewy na amígdala e no núcleo de menores. A fotografia das fatias é cuidadosamente para uma identificação precisa das áreas anatômicas durante a análise microscópica.

A fixação e o congelamento de fatias de solteiros também são importantes para preservar a microestrutura tecidual Omics a topografia da ativação genética e distribuição de proteínas e correlacionar esses dados com a histopatologia. Culturas celulares de tecidos bem caracterizados, também uma investigação sobre a patogênese da doença. Use sempre equipamentos de proteção individual adequados como tecido cerebral investido é considerado potencialmente infeccioso e porque o uso de ferramentas perigosas como instrumentos afiados e nitrogênio líquido é necessário.