Name: Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a transformar raízes de tomate e inocular com Ralstonia solanacearum para análise genética da murcha bacteriana. Este método versátil permite estudos rápidos de patologia vegetal com equipamento mínimo.

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Agradecemos a todos os membros do laboratório macho por discussões úteis, Alvaro López-García por aconselhamento estatístico, e Xinyu Jian por assistência técnica e administrativa durante este trabalho. Agradecemos ao núcleo de Biologia Celular do PSC pela assistência com imagens de fluorescência Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (bolsa XDB27040204), o Centro de Biologia do Estresse Vegetal de Xangai (chinês Academia de Ciências) e o programa chinês 1000 Talentos.

NOTA: Partes importantes deste método envolvem o manuseio de materiais vegetais in vitro e, portanto, é importante manter condições estéreis durante todos esses procedimentos, incluindo a visualização da fluorescência DsRed. Durante todo o processo de transformação, as mudas de tomate crescem a 25-28 °C e 16 h/8 h claro/escuro (130 μmol fótons m-2s-1 luz). As placas são seladas com fita microporos a fim de facilitar a troca e transpiração gasosa.
1. Preparação de plantas de tomate e rizógenes agrobacteriogenes
<ol><li>Esterilizar sementes de tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) com 5% (v/v) hipoclorito de sódio por 5 min. Lave 4-5 vezes com água estéril destilada e mantenha as sementes tremendo lentamente em água estéril durante a noite para facilitar a germinação.</li>
	<li>Transfira as sementes de tomate para o meio murashige e skoog de meia-força (1/2 MS) sem sacarose (2,21 g/L MS, 8% c/v ágar). Mantenha as sementes no escuro a 25-28 °C por três dias(Figura 1A). NOTA: Cerca de 40 sementes são geralmente necessárias para cada construção.</li>
	<li>Autoclave 8,5 cm2 papéis de filtro quadrado. Coloque os papéis do filtro quadrado dentro de 9 cm2 placas de petri quadradas contendo 1/2 ms médio (coloque o papel em cima do ágar) e coloque seis sementes de tomate germinadas em cada prato(Figura 1B). Sele a placa com fita microporos a fita e incubar as sementes germinadas a 25-28 °C por 3-4 dias.</li>
	<li>Cultivar Agrobacterium rhizogenes MSU440 em meio LB sólido (com antibióticos apropriados) a 28 °C dois dias antes da transformação da planta. NOTA: A. rhizogenes é fornecido pelo Dr. Juan Antonio López Ráez, EEZ-CSIC, Granada, Espanha. No experimento descrito neste artigo, a A. rizógenes contendo pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 ou um vetor vazio, como controle, foram usados. pK7GWIWG2_II-RedRoot contém um gene de repórter, DsRed, impulsionado pelo promotor arabidopsis thaliana ubiquitin(pAtUBQ10),e confere resistência à espectinomicina (50 μg/mL). É possível utilizar outros vetores para superexpressão genética, conforme relatado antesde 5. Neste trabalho, a amplificação do fragmento específico para silenciamento SlCESA6 foi obtida por transcrição reversa (RT) PCR utilizando RNA isolado do tomate (S. lycopersicum cv. Moneymaker) e ligado ao vetor p-ENTR/D-TOPO(Tabela 1). Posteriormente, o fragmento SlCESA6-RNAi foi clonado no vetor binário pK7GWIWG2_II-RedRoot.</li>
</ol>2. Transformação e seleção de plantas
<ol><li>Usando um bisturi estéril, corte o radicículo e o fundo do hipocotilo das mudas de tomate (Figura 1C,D).</li>
	<li>Colheita A. rizógenes biomassa da superfície do meio LB usando pontas plásticas ou uma lâmina de bisturi e mergulhe cuidadosamente as mudas de tomate cortadas na biomassa bacteriana(Figura 1E).</li>
	<li>Após a inoculação com A. rizogenes,cubra as mudas de tomate com um papel filtro semi-circular de 2 cm x 4 cm(Figura 1F),a fim de manter uma alta umidade e facilitar a sobrevivência e o desenvolvimento de novas raízes.</li>
	<li>Guarde as mudas de tomate transformadas por 6-7 dias. Em seguida, use um bisturi estéril para cortar as novas raízes peludas emergentes (Figura 1G,H; nesta etapa, as raízes ainda não são transformadas) e permitir que as mudas produzam novas raízes peludas.</li>
	<li>Uma vez que a segunda geração de novas raízes peludas apareçam (Figura 1I),remova o papel do filtro em cima das mudas e sele a placa com fita microporosa novamente. NOTA: Neste ponto, a presença do marcador fluorescente DsRed no vetor de transformação permite visualizar a eficiência de transformação nas novas raízes.</li>
	<li>Para visualizar a fluorescência DsRed, use um microscópio estereomicroscópio ou qualquer outro equipamento para imagem in vivo da planta (Figura 1J). Marque as raízes transformadas positivas (fluorescência vermelha) e remova as raízes negativas não transformadas (sem fluorescência vermelha) usando um bisturi estéril.</li>
	<li>Transfira as mudas que compareçam fluorescência vermelha para uma nova placa contendo 1/2 ms médio, a fim de facilitar o desenvolvimento da raiz transformada como a raiz principal (Figura 1K). Mantenha as mudas que não apresentam fluorescência vermelha na mesma placa para verificar o surgimento de raízes fluorescentes (Figura 1L) em pontos de tempo posteriores.</li>
	<li>Método alternativo baseado na seleção de antibióticos<ol>
<li>Alternativa ao passo 2.5, prepare placas quadradas de 9 cme 2 cm contendo 1/2 ms médio com o antibiótico apropriado. Incline as placas aproximadamente 5° durante o processo de preparação para gerar um espaço vazio sem meio(Figura 2A),permitindo que os brotos cresçam evitando o contato com o antibiótico.</li>
		<li>Alternativa ao passo 2.6, após cortar as primeiras raízes peludas não transformadas emergiu (etapa 2.4), transferir as mudas sem raízes para as placas semi-preenchidas utilizando papéis de filtro com o tamanho adequado(Figura 2B). NOTA: Como controle positivo, recomenda-se transformar várias mudas com um plasmídeo contendo a mesma resistência a antibióticos e um gene de repórter (neste protocolo, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamycin 50 μg/mL).</li>
		<li>Alternativa ao passo 2.7, deixe que as mudas desenvolvam novas raízes peludas e corte aquelas raízes que não estão em contato direto com a superfície dos papéis do sanduíche do filtro, uma vez que essas raízes podem evitar a seleção de antibióticos. NOTA: Devido ao efeito antibiótico, o desenvolvimento da raiz pode ser mais lento do que em placas sem antibióticos. Novas raízes peludas transformadas aparecem dentro de 14-18 dias após a transferência das mudas sem raízes para as placas semi-preenchidas (etapa 2.8.2) (Figura 2C-E).</li>
	</ol></li>
	<li>Cubra as mudas com um papel filtro semicírculo de 2 cm x 4 cm, sele a placa e incuba as mudas para que elas desenvolvam novas raízes peludas. NOTA: Não é necessário eliminar os A. rizogenes usando antibióticos. O papel filtro em cima do meio de MS e a falta de sacarose inibem a propagação dos A. rizógenes na placa5.</li>
	<li>Cinco a sete dias após a primeira seleção de raízes, repita o processo de seleção para selecionar novas raízes transformadas e remover raízes não transformadas. Transfira as mudas contendo raízes transformadas para uma nova placa contendo 1/2 ms médio.</li>
</ol>3. Transferência para potes de inoculação
<ol><li>Prepare potes de inoculação onde a superfície das raízes será exposta ao inóculo bacteriano: mergulhe os potes de inoculação com água, despeje qualquer excesso de água e coloque-os em uma bandeja de plantio de plástico. Transfira as mudas selecionadas com raízes transformadas para vasos de inoculação utilizando pinças(Figura 3A).</li>
	<li>Cubra a bandeja com plástico ou uma tampa transparente e mantenha-as a 25-28 °C e 65% de umidade (16 h/8 h claro/escuro; 130 μmol fótons m-2s-1 luz), para manter um alto nível de umidade Figura 3B). Remova a tampa depois de cinco ou seis dias. NOTA: As plantas de tomate transformadas estão prontas para a inoculação de duas a três semanas após transferi-las para o solo(Figura 3C). Durante o crescimento no solo, as plantas de tomate podem produzir novas raízes que não são transformadas. Para determinar a extensão desse fenômeno, a fluorescência vermelha foi visualizada em raízes de plantas de tomate transformadas de 3 semanas. A maioria das raízes (80%-100%) apresentaram fluorescência vermelha, indicando que estão de fato transformados (Figura 3D,E).</li>
</ol>4. Inoculação encharcada de solo
<ol><li>Cultivar R. solancearum (cepa GMI1000 neste protocolo) em meio líquido phi(Tabela 211)em um agitador orbital (200 rpm) a 28 °C até a fase estacionária.</li>
	<li>Determinar números bacterianos medindo a densidade óptica da cultura bacteriana em 600 nm (OD600). Diluir a cultura bacteriana com água para um OD600 de 0,1 (em condições aqui utilizadas, isso corresponde a aproximadamente 108 unidades formadoras de colônias [UFC]/mL).</li>
	<li>Coloque 16-20 potes de inoculação contendo plantas de tomate transformadas em uma bandeja de inoculação (29 cm x 20 cm; Figura 4A).</li>
	<li>Despeje 300 mL (~15 mL por planta) de inóculo bacteriano (OD600 de 0,1) na bandeja contendo os potes de inoculação. Deixe-os de molho no inóculo por 20 min(Figura 4B).</li>
	<li>Prepare uma nova bandeja com uma camada de solo de vasos. Mova os potes inoculados para a nova bandeja(Figura 4C)e coloque as bandejas em uma câmara de crescimento com 75% de umidade, 26-28 °C e um período fotoperíodo de 12 h de luz e escuridão de 12 h (fótons de 130 μmol m-2s-1 luz).</li>
</ol>5. Determinação de parâmetros de infecção e análise estatística
<ol><li>Os sintomas da doença de pontuação como descrito anteriormente12,13, utilizando uma escala que varia de 0 (sem sintomas) a 4 (murcha completa) (Figura 4D-H), todos os dias após a inoculação de Ralstonia por duas semanas. NOTA: Os dados do índice da doença são coletados da mesma unidade experimental (cada planta) ao longo do tempo.</li>
</ol>6. Análise de expressão gênica
NOTA: A expressão do transgene ou o silenciamento do gene alvo pode ser determinada por RT-PCR ou por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR).
<ol><li>Coletar amostras e extrair RNA de uma parte representativa do sistema radicular transformado (para avaliar o efeito sobre o gene alvo) e folhas (como controle interno).</li>
	<li>Sintetisque o CDNA usando 1 μg de RNA total tratado com DNase.</li>
	<li>Analisar a expressão genética dos genes-alvo por qRT-PCR. Calcular os níveis de transcrição relativos usando o método 2-ΔΔCT 14, usando SlEFα-1 como gene de limpeza15. NOTA: As seqüências do primer estão listadas na Tabela 1.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Elphinstone, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElphinstone%2C+JG+%22The+current+bacterial+wilt+situation%3A+a+global+overview.+In%3A+Bacterial+Wilt+Disease+and+the+Ralstonia+solanacearum+Species+Complex%22">The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex</a>. Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. , American Phytopathological Society Press. St Paul, MN. 9-28 (2005).</li>
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<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+of+homogalacturonan%2C+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li>
<li>Hernández-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li>
<li>Denancé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+wat1+%28walls+are+thin1%29-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen%2C+Ralstonia+solanacearum%2C+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction%3A+focus+at+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li>
<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Ralstonia solanacearum representa uma ameaça importante para a agricultura; no entanto, sua interação com hospedeiros naturais de importância agrícola ainda é pouco compreendida em comparação com outros patógenos bacterianos, especialmente em espécies de plantas agrícolas. Na maioria dos casos, a análise genética é dificultada pelo tempo e gastos necessários para modificar geneticamente plantas hospedeiras. Para enfrentar esse problema e facilitar a análise genética da infecção por R. solanacearum no to...

Ralstonia solanacearum, o agente causal da doença da murcha bacteriana, é um patógeno vascular devastador do solo com uma distribuição mundial que pode infectar uma grande variedade de espécies vegetais, incluindo batata, tomate, tabaco, banana, pimenta e berinjela, entre outras1,2. As perdas de rendimento causadas pela Ralstonia podem chegar a 80-90% da produção em tomate, batata ou banana, dependendo da cultivar, clima, solo e outros fatores3. No entanto, o modelo de Ralstonia é consideravelmente pouco explorado em comparação com outros modelos envolvendo patógenos de plantas bacterianas, tais como Pseudomonas singae ou Xanthomonas spp. Além disso, a maioria dos estudos em interações entre plantas e micróbios está focada na planta modelo Arabidopsis thaliana. Embora a pesquisa que utiliza esses modelos tenha contribuído em grande parte para a nossa compreensão das interações entre plantas e bactérias, elas não abordam a necessidade atual de entender essas interações nas plantas agrícolas. Pesquisas voltadas para a compreensão da interação entre ralstonia e plantas agrícolas são essenciais para desenvolver soluções sustentáveis para combater a doença bacteriana, mas atualmente é dificultada pela falta de ensaios experimentais simples para caracterizar os diferentes componentes da interação. Particularmente, o tomate, um hospedeiro natural da Ralstonia,é a segunda cultura vegetal mais importante do mundo e é afetado por uma infinidade de doenças4, incluindo a doença de murcha bacteriana. Neste trabalho, desenvolvemos um método fácil para realizar análisegenética da infecção por Ralstonia do tomate. Este método baseia-se na transformação mediada de raízes de tomate da Agrobacterium,utilizando fluorescência DsRed como marcador de seleção5,seguida pela inoculação de drenagem do solo de Ralstonia das plantas resultantes, contendo raízes transformadas expressando a construção de interesse. A versatilidade do ensaio de transformação raiz permite realizar a superexpressão genética ou o silenciamento genético mediado pela RNAi.
Uma limitação potencial deste método consiste no crescimento residual de raízes não transformadas. Isso é particularmente importante nos casos em que o plasmídeo utilizado carece de um gene de repórter que permita a seleção de raízes transformadas. Para resolver esse problema, desenvolvemos um método alternativo baseado na seleção de antibióticos, que inibe o crescimento de raízes não transformadas, permitindo ao mesmo tempo o crescimento de raízes transformadas saudáveis resistentes a antibióticos. Uma vez que A. rizógenes não induz a transformação de brotos, eles são suscetíveis ao antibiótico e, portanto, devem ser mantidos separados do meio contendo antibióticos.
Embora a resistência vegetal contra a Ralstonia não seja bem compreendida, vários relatos associaram alterações na parede celular ao aumento da resistência à murcha bacteriana6,,7,,8,9. Sugere-se que essas alterações na parede celular afetem o desenvolvimento vascular, aspecto essencial para o estilo de vida da Ralstonia dentro da planta10. Mutações nos genes que codificam os sintetizadores de celulose CESA4, CESA7 e CESA8 em Arabidopsis thaliana têm sido demonstradas para prejudicar a integridade da parede celular secundária, causando maior resistência à Ralstonia,que parece estar ligada à sinalização ABA8. Portanto, como prova de conceito para o nosso método, realizamos o silenciamento genético mediado pela RNAi de SlCESA6 (Solyc02g072240), um sintetizador secundário de celulose de parede celular, e ortolog de AtCESA8 (At4g18780). A inoculação subseqüente de drenagem do solo com ralstonia mostrou que silenciar SlCESA6 aumentou a resistência aos sintomas de murcha bacteriana, sugerindo que a resistência mediada pela parede celular à Ralstonia é provavelmente conservada no tomate, e validando nosso método para realizar análise genética da resistência bacteriana murcha nas raízes do tomate. Aqui, descrevemos este método em detalhes, permitindo abordagens genéticas para entender a doença de murcha bacteriana em um tempo relativamente curto e com pequenas exigências de equipamentos e espaço de crescimento vegetal.

<table><tbody><tr><td>90 mm quadrados de placas</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>Petri Ágar pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD (Becton e Dickinson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casamino ácidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jiffy</td><td>potes Jiffy Products International A.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fita micropore</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige e meio Skoog (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pindstrup substrato</td><td>Pindstrup Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi e lâmina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bancada</td><td></td><td></td><td></td> limpa estéril</tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel Wahtman</td><td>International Ltd. Extrato de levedura de maldstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transformação da raiz do tomate seguida de inoculação com ralstonia solanacearum para análise genética direta da doença de wilt bacteriano

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum é um patógeno vascular devastador que pode infectar uma grande variedade de espécies vegetais, causando uma importante ameaça à agricultura. No entanto, o modelo de Ralstonia é consideravelmente pouco explorado em comparação com outros modelos envolvendo patógenos bacterianos vegetais, como pseudomonas singae em Arabidopsis. Pesquisas voltadas para a compreensão da interação entre ralstonia e plantas agrícolas são essenciais para desenvolver soluções sustentáveis para combater a doença bacteriana, mas atualmente é dificultada pela falta de ensaios experimentais simples para caracterizar os diferentes componentes da interação em plantas hospedeiras nativas. Nesse cenário, desenvolvemos um método para realizar a análise genética da infecção por Ralstonia do tomate, um hospedeiro natural da Ralstonia. Este método baseia-se na transformação mediada do Agrobacterium rhizogenesdas raízes do tomate, seguida pela inoculação de ralstonia encharcada de solo das plantas resultantes, contendo raízes transformadas expressando a construção de interesse. A versatilidade do ensaio de transformação raiz permite realizar a superexpressão genética ou o silenciamento genético mediado pela RNAi. Como prova de conceito, utilizou-se este método para mostrar que o silenciamento mediado pela RNAI de Sisa6 nas raízes do tomate conferiu resistência à Ralstonia. Aqui, descrevemos este método em detalhes, permitindo abordagens genéticas para entender a doença de murcha bacteriana em um tempo relativamente curto e com pequenas exigências de equipamentos e espaço de crescimento vegetal.

A Figura 5 mostra o desenvolvimento de sintomas da doença de plantas de tomate com raízes transformadas com um vetor vazio (EV), e plantas com raízes transformadas com um construto RNAi direcionado aoSolyc02g072240). SlCESA6 Os dados do índice da doença (Figura 5A) são coletados da mesma unidade experimental (cada planta) ao longo do tempo de acordo com uma escala arbitrária de 0 a 4, e não segu...

Aqui, apresentamos um método versátil para transformação da raiz do tomate seguido de inoculação com Ralstonia solanacearum para realizar análise genética simples para o estudo da doença de murcha bacteriana.

Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Este protocolo é significativo porque permite que os cientistas realizem uma análise genética simples da doença bacteriana do murcho no tomate. A principal vantagem dessa técnica é que a manipulação da expressão genética e dos ensaios subsequentes pode ser realizada em pouco tempo e com os pequenos requisitos de equipamentos e espaço de crescimento da planta. Este método é muito versátil, e pode ser aplicado a outras plantas agrícolas para realizar tanto a inoculação de patógenos quanto outros ensaios fisiológicos.Para manter a esterilidade durante a manipulação das mudas in vitro, é importante manter as placas fechadas quando estiverem fora do capô de fluxo. Esta é uma técnica fácil, mas requer vários passos para manipulação. A visualização deste método ajudará a ver pequenos truques difíceis de explicar no manuscrito, ajudando outros pesquisadores a implementar o método em seus laboratórios.Ajudando a demonstrar este procedimento será Achen Zhao, um estudante de pós-graduação. Depois de esterilizar e lavar as sementes de tomate, transfira-as para o meio Murashige e Skoog sem sacarose. Mantenha as sementes no escuro a uma temperatura entre 25 e 28 graus Celsius por três dias.Coloque filtros de 8,5 centímetros quadrados dentro de placas de Petri de nove centímetros quadrados contendo meio-forte Murashige e Skoog médio, e coloque seis sementes de tomate germinadas em cada prato. Sele a placa com fita micropora, e incuba as sementes germinadas a 25 a 28 graus Celsius por três a quatro dias. Cultivar o Agrobacterium rizogenes MSU440 em meio LB sólido com antibióticos apropriados por dois dias a 28 graus Celsius antes da transformação da planta.Usando um bisturi estéril, corte o radículo e o fundo do hipocótel das mudas de tomate. Use pontas plásticas ou uma lâmina de bisturi para colher biomassa A.rizogenes da superfície do meio LB, e mergulhe cuidadosamente as mudas de tomate cortadas na biomassa bacteriana. Depois disso, cubra as mudas de tomate com um papel filtro semicircular de dois centímetros por quatro centímetros, a fim de manter uma alta umidade e facilitar a sobrevivência e o desenvolvimento de novas raízes.É importante manter as mudas em alta umidade em um ambiente que permita a transpiração. Para isso, cubra as mudas com papel filtro e feche a placa com fita micropore. Armazene as mudas de tomate transformadas por seis a sete dias em uma câmara de crescimento a uma temperatura entre 25 e 28 graus Celsius.Em seguida, use um bisturi estéril para cortar as novas raízes peludas emergentes, e permitir que as mudas produzam novas raízes peludas. Uma vez que a segunda geração de novas raízes peludas apareça, remova o papel filtro em cima das mudas e sele novamente a placa com fita micropore. Para visualizar a fluorescência DsRed ou qualquer outro equipamento para imagem in vivo da planta, marque as raízes positivas transformadas, que podem ser identificadas pela fluorescência vermelha.Use um bisturi para remover as raízes negativas não transformadas, que podem ser identificadas pela falta de fluorescência vermelha. Transfira as mudas que mostram fluorescência vermelha para uma nova placa contendo meio-forte Murashige e Skoog médio, a fim de facilitar o desenvolvimento da raiz transformada como a raiz principal. Mantenha as mudas que não apresentam fluorescência vermelha na mesma placa para verificar o surgimento de raízes fluorescentes em pontos de tempo posteriores.Cubra as mudas com um papel filtro de semicirculação de dois centímetros por quatro centímetros, sele a placa e incuba as mudas para que elas desenvolvam novas raízes peludas. Prepare os potes de inoculação onde a superfície das raízes será exposta ao inóculo bacteriano, primeiro absorvendo os potes de inoculação com água, derramando qualquer excesso de água e, em seguida, colocando-os em uma bandeja de plantio de plástico. Utilizando pinças, transfira as mudas selecionadas com raízes transformadas para os potes de inoculação.Cubra a bandeja com plástico ou uma tampa transparente, e mantenha-as a 25 a 28 graus Celsius com 65% de umidade. Remova a tampa após cinco ou seis dias. Cresça Ralstonia em cinco LB médio líquido em um agitador orbital a 28 graus Celsius, com agitação a 200 rpm, até a fase estacionária.Meça a densidade óptica em 600 nanômetros para determinar os números bacterianos. Diluir a cultura bacteriana com água para um OD600 de 1. Coloque de 16 a 20 potes de inoculação que contenham plantas de tomate transformadas em uma bandeja de inoculação.Em seguida, despeje 300 mililitros de inóculo bacteriano diluído na bandeja, e deixe as plantas de molho no inóculo por 20 minutos. Depois disso, prepare uma nova bandeja com uma camada de solo de vaso. Mova os potes inoculados para a nova bandeja, e coloque as bandejas em uma câmara de crescimento com 75% de umidade, uma temperatura entre 26 e 28 graus Celsius, e um fotoperóudo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.Aqui, as raízes do tomate são transformadas e inoculadas com a Ralstonia para realizar análisegens simples para o estudo da doença bacteriana murcha. O desenvolvimento dos sintomas da doença é acompanhado em plantas de tomate com raízes transformadas com um vetor vazio e aquelas transformadas com uma construção RAI voltada para o tomate CESA6. Os dados do índice da doença são coletados da mesma unidade experimental ao longo do tempo de acordo com uma escala arbitrária de zero a quatro e não seguem uma distribuição gaussiana, excluindo o uso de testes padrão para dados paramétricos.Como abordagem padrão, um teste U Mann-Whitney, de duas caudas, não paramétrico, para comparar as curvas de controle e infecção é usado. De acordo com esta análise, a diferença entre as medianas de ambas as curvas parece não ser significativa. Também é possível quantificar a área sob a curva de progresso da doença, o que permite combinar múltiplas observações do progresso da doença em um único valor.A área sob a curva de progresso da doença mostra maior valor para as plantas de controle em comparação com as plantas de tomate CESA6 RNAi no final do processo de infecção, indicando que as plantas silenciadas pelo tomate CESA6 são mais resistentes à infecção por Ralstonia do que as plantas de controle. Os intervalos de confiança oferecem uma forma de estimar, com alta probabilidade, uma gama de valores em que o valor populacional de uma determinada variável é encontrado. Como visto aqui, a área do intervalo de confiança de 95% para as curvas de controle e infecção estima uma maior chance de resistência quando o CESA6 é silenciado.Os valores do índice da doença podem ser transformados em dados binários, considerando um índice de doença inferior a dois correspondentes a zero e um índice de doença igual ou superior a dois correspondentes a um. Isso permite a representação de uma curva de sobrevivência após a inoculação de Ralstonia. As diferenças na taxa de sobrevivência entre o controle e as plantas infectadas não são estatisticamente significativas de acordo com o teste estatístico Gehan-Breslow-Wilcoxon.A expressão do CESA6 é então analisada em duas raízes transformadas selecionadas aleatoriamente antes da etapa de inoculação, mostrando que a resistência aumentada à Ralstonia se correlaciona com a expressão reduzida do CESA6. Após duas rodadas de seleção, uma taxa de transformação de 35 a 40% pode ser obtida, e esse valor pode ser aumentado realizando rodadas de seleção adicionais. Durante a realização deste procedimento, é importante manter as mudas cobertas com um pedaço de papel filtro para manter a alta umidade e selar as placas com Micropore para garantir a troca de gás.Após a transformação da raiz, muitos dos tratamentos podem ser aplicados para estudar a resposta vegetal por observação da fisiologia radicular ou usando biologia molecular, biologia celular ou bioquímica. Principalmente, essa técnica permitirá que pesquisadores com recursos limitados realizem análisegens genéticas de infecção bacteriana em raízes de tomate.

tomato-root-transformation-followed-inoculation-with-ralstonia

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Fonte: Hassan, J. A., et al. Identificação de alto rendimento de resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate em tomate usando ensaio de inundação de mudas. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra um método para rastrear a resistência bacteriana em diferentes cepas de tomate usando mudas de dez dias inoculadas com uma suspensão bacteriana. Ele explica como as bactérias invadem os estômatos, fornecem proteínas efetoras para suprimir a imunidade das plantas e como as respostas das plantas...

Ensaio de inundação de mudas para triagem de resistência bacteriana em tomates

Fonte: Matthysse, A. G. Adesão de bactérias às superfícies das plantas medida em laboratório. J. Vis. Exp., (2018)Este vídeo demonstra um protocolo para medir a colonização radicular de mudas de tomate por bactérias patogênicas selvagens e deficientes em celulose. Contagens viáveis de bactérias aderentes firmes apresentam maior adesão e formação de microcolônias pela cepa selvagem, destacando o papel da celulose na colonização radicular estável.

Avaliação da colonização radicular de mudas de tomate por uma bactéria patogênica usando contagens celulares viáveis

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

O objetivo do protocolo aqui apresentado é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado de Bacillus mycoides exsudados de raiz de batata. Este método facilita a identificação de genes de bactérias importantes envolvidos em interações planta-micróbio e em princípio aplicável a outros fungos endofíticos e plantas, com pequenos ajustes.

Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

O ensaio de inundação de mudas facilita a rápida triagem das adesões de tomate selvagem para a resistência à bactéria Pseudomonas seringae. Este ensaio, usado em conjunto com o ensaio de crescimento bacteriano de mudas, pode auxiliar na caracterização da resistência subjacente à bactéria, e pode ser usado para mapear populações para determinar a base genética da resistência.

Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas

Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

O protocolo descreve a infecção de raízes de Solanum tuberosum com nematóides parasitas de plantas em condições de casa de vegetação in vivo e raízes transgênicas in vitro de batata para análise histoquímica da estrutura radicular por meio de microscopia óptica.

Infecção in vivo e in vitro de raízes de batata com nematóides parasitas de plantas para avaliação de alterações estruturais induzidas

A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Aprenda a transformar raízes de tomate e inocular com Ralstonia solanacearum para análise genética da murcha bacteriana. Este método versátil permite estudos rápidos de patologia vegetal com equipamento mínimo.

Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano (Vídeo) | JoVE Journal

Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano

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