Sistema de matriz 3D derivado do fibroblasto aplicável ao ensaio de formação do tubo endotelial
26 de dezembro de 2019
O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).
Este protocolo permite ver diferentes tipos de culturas e observar suas interações com matriz extracelular. A principal vantagem deste método é que a matriz que você obtém é regenerada pelo fibroblasto e será bastante semelhante às geradas in vivo. Acreditamos que essa doença é irrelevante ao usar fibroblasto de pratos de cozimento.
Estabelecer uma matriz a partir dessas células poderia nos esclarecer como ela pode afetar, por exemplo, a situação persistente. Esses métodos também podem ser aplicados, por exemplo, a estudos físicos a sobreviventes de matrizes. Visualização deste protocolo é importante observar uma técnica de pipetação dos passos que você tem que regente.
Ao experimentar esses métodos pela primeira vez, provavelmente levará mais tempo do que o esperado. Nosso conselho é preparar o máximo que puder com antecedência e usando períodos de duração para se preparar para os próximos passos. Comece preparando 0,2% de gelatina, 1%glutaraldeído e uma solução de etanolamina molar de acordo com as instruções do manuscrito.
Certifique-se de executar cada solução através de um filtro de 0,22 micrômetro antes de ser usado. Em seguida, prepare o ácido ascórbico e o tampão de lise. Diluir a caneta-estreptococos pbs como descrito no manuscrito e preparar OMEM com 10%FBS.
Prepare o calor desnaturado 2%BSA adicionando 2 gramas de BSA a 100 mililitros de água estéril e aquecendo-a em um banho de água fervente por sete minutos. Em seguida, suplementar FBS com penicilina, estreptomicina, gentamicina e anfotericina B.Telômeros recombinantes transfectaram fibroblastos humanos de prepúcios imortais e DMEM com 10% de FBS e os mantiveram a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para estabelecer a cultura do fibroblasto primário, corte as amostras de tecido em pequenos pedaços de aproximadamente dois a três mililitros cubos e semeados em FPS com uma alta concentração de antibióticos.
Quando os primeiros fibroblastos aparecerem, substitua o meio por meio FBM para manutenção celular. Adicione dois mililitros de solução de gelatina de 0,2% a cada poço de uma placa de seis poços e incuba-o por uma hora para 37 graus Celsius ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, aspire a gelatina e lave cada poço com dois mililitros de PBS.
Adicione dois mililitros de 1% de glutaraldeído a cada poço e incubar a placa em temperatura ambiente por trinta minutos que cruzará a gelatina. Aspire o glutaraldeído e lave os poços em dois mililitros de PBS por cinco minutos. Para bloquear o glutaraldeído restante, adicione dois mililitros de uma etanolamina molar e incubar a placa em temperatura ambiente por trinta minutos.
Aspire a etanolamina e repita as lavagens com PBS. Adicione um mililitro de DMEM com 10%FPS. Se o meio ficar rosa imediatamente, remova-o, lave os poços uma vez com dois mililitros de PBS e adicione outro mililitro de DMEM.
Semente um mililitro de suspensão do fibroblasto com 5 x 10 para as quintas células em cada poço e cultura as células até 100% de confluência é alcançada. Em seguida, remova o meio e substitua-o por DMEM por 10% FBS e 50 microgramas por ácido ascórbico mililitro. Substitua o meio a cada dois dias por seis dias.
Dois dias após o último tratamento com ácido ascórbico, remova o meio e lave os poços com dois mililitros de PBS. Após as lavagens, adicione lentamente um mililitro de tampão de lise pré-aquecido e incubar a placa em temperatura ambiente por cinco a dez minutos até que os fibroblastos sejam liseados. Sem remover o tampão de lise, adicione cuidadosamente dois mililitros de PBS a cada poço e, em seguida, aspire aproximadamente 2,5 mililitros.
Repita este processo duas vezes para um total de três lavagens. Após a lavagem final, adicione dois mililitros de PBS com pen-estreptococos. Sele a placa com filme e mantenha-a a quatro graus Celsius por até três meses.
Cultivar células HUVEC e EMB-2 com 2% de FBS até a confluência máxima. Em seguida, substitua o meio por EBM-2 sem FBS por oito horas. Para preparar as matrizes para semeadura celular, remova-as da geladeira e deixe-as em temperatura ambiente por uma hora.
Bloqueie as matrizes adicionando dois mililitros de 2%BSA desnaturados de calor e incuba-as a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, aspire o BSA e lave-os com dois mililitros de PBS. Semente 2 x 10 para o quinto huvec células para cada poço da placa revestida com matrizes derivadas de fibroblasto.
Incubar as células a 37 graus Celsius por 16 horas e examinar as estruturas semelhantes ao tubo sob um microscópio de campo brilhante padrão a 20-40x de ampliação. Este protocolo foi utilizado para examinar os efeitos do tratamento PDGF na formação de matriz derivada do fibroblasto. Os terceiros fibroblastos bgh incubados com PDGF mostraram uma distribuição celular mais alinhada em matrizes do que aqueles incubados sem PDGF.
A expressão da proteína de colágeno 1 e fibronectina foi aumentada em matrizes derivadas de fibroblastos estimulados pelo PDGF e, consequentemente, a espessura da matriz foi aumentada. Além disso, os histogramas direcionais demonstram que o colágeno 1 e a fibronectina apresentam padrões paralelos. Quando as células HUVEC foram semeadas em matrizes descelularizadas derivadas de fibroblastos estimulados pelo PDGF, elas desenvolveram estruturas mais capilares do que sob nenhuma condição estimulada.
Confirmando que matrizes derivadas de fibroblastos estimulados PDGF-BB promovem a ativação das células endoteliais. Ao realizar este procedimento, é importante preparar as soluções com antecedência e certificar-se de que as células estão prontas antes de iniciar. Além das células endoteliais, os estudos matrices também podem ser semeados com células epiteliais e a reação a fatores externos como condição na mídia ou drogas citotóxicas pode ser observada.
A geração de matriz extracelular é crucial no projeto de experimentos de macroambiente tumoral.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo permite a observação de diversos cultivos celulares e suas interações com matrizes extracelulares. As matrizes derivadas de fibroblastos se assemelham às encontradas in vivo, fornecendo um suporte relevante para ensaios celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Cultura celular
- Pesquisa sobre matriz extracelular
- Biologia de fibroblastos
Antecedentes
- Os fibroblastos são células fundamentais na geração de matrizes extracelulares.
- O entendimento das interações entre células e matriz é essencial para diversos estudos biológicos.
- As matrizes regeneradas podem fornecer informações sobre condições fisiológicas e patológicas.
- Este método permite a visualização das técnicas de pipetagem essenciais para o protocolo.
Objetivo do Estudo
- Criar um suporte natural para ensaios celulares utilizando matrizes derivadas de fibroblastos.
- Investigar os efeitos dessas matrizes sobre diferentes tipos celulares.
- Aprimorar o entendimento de condições persistentes por meio de estudos de matriz.
Métodos Utilizados
- Fibroblastos são semeados em placas de cultura pré-tratadas.
- Ácido ascórbico é usado para estimular a geração da matriz.
- A descelularização das matrizes é realizada para preparar o cultivo celular.
- Células relevantes, como células endoteliais, são cultivadas sobre as matrizes.
Resultados Principais
- As matrizes geradas são semelhantes às encontradas in vivo.
- As interações celulares com as matrizes podem ser efetivamente observadas.
- O método fornece uma abordagem confiável para estudar o comportamento celular em um ambiente relevante.
- Técnicas de visualização aprimoram a compreensão da execução do protocolo.
Conclusões
- As matrizes derivadas de fibroblastos atuam como esqueletos eficazes para ensaios celulares.
- Este método pode ser aplicado a diversos estudos biológicos, incluindo estudos físicos das propriedades da matriz.
- Compreender as interações entre células e a matriz extracelular é essencial para o avanço da pesquisa em biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método fornece um modelo fisiologicamente relevante de matriz extracelular tridimensional derivado de fibroblastos, permitindo uma avaliação mais preditiva de fenótipos angiogênicos e tumorigênicos em pesquisas de descoberta. Ao imitar a composição e estrutura da matriz in vivo, ele apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de desenvolvimento de fármacos voltados para oncologia e angiogênese. O sistema aumenta a continuidade translacional ao permitir o estudo de comportamentos celulares mediados pela matriz em condições controladas e reproduzíveis.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os efeitos do remodelamento da matriz mediado por fibroblastos na formação de tubos endoteliais como leitura funcional do potencial angiogênico.
- Valor Operacional: Apoia a verificação de hipóteses sobre fatores pró-angiogênicos, como PDGF-BB, na composição da matriz e nas respostas endoteliais subsequentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera matrizes desscelularizadas padronizadas com deposição quantificável de colágeno e fibronectina para semeadura consistente de células endoteliais.
- Valor Operacional: Permite a preparação reprodutível de scaffolds bioativos para imageamento de alto conteúdo de estruturas semelhantes a tubos por microscopia de campo claro.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela alterações no matriz extracelular induzidas por fibroblastos associados ao câncer (CAF) que promovem a angiogênese associada ao tumor.
- Valor Operacional: Permite a avaliação de efeitos de fármacos dependentes da matriz na morfogênese de células endoteliais em um sistema relevante para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de matriz derivada de fibroblastos insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a triagem fenotípica, proporcionando uma ponte entre acertos moleculares e a saída funcional angiogênica antes do compromisso pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Testa como os estados de ativação dos fibroblastos modulam a arquitetura da matriz para influenciar o comportamento das células endoteliais.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas baseadas em imagens da formação de tubos para comparar condições de matriz entre grupos experimentais.
- Análises: Permite a análise de histograma de direcionalidade do alinhamento de colágeno e fibronectina para avaliar fenótipos de remodelação da matriz.
- Pesquisa Translacional: Conecta propriedades da matriz derivadas de fibroblastos a vias de sinalização angiogênica relevantes para a modelagem do microambiente tumoral.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar compostos pró- ou anti-angiogênicos em um ensaio contextualizado fisiologicamente.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos angiogênicos ao utilizar uma matriz que se assemelha estreitamente à composição e estrutura da MEC in vivo.
- Valor Operacional: Oferece um método padronizado e escalonável para gerar matrizes tridimensionais bioativas, aplicável a diversos tipos celulares e condições experimentais.
- Valor Estratégico: Reduz falsos positivos biológicos em triagens de angiogênese ao incorporar, no início da cascata de descoberta, os efeitos da matriz mediados pelo estroma.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de moduladores angiogênicos com base em seus efeitos sobre matrizes remodeladas por fibroblastos e nas respostas endoteliais subsequentes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de fibroblastos primários, bioquímica da matriz extracelular e técnicas de descelularização.
- Depende da estimulação controlada com ácido ascórbico, reticulação com glutaraldeído e bloqueio com etanolamina para estabilização da matriz.
- Necessita bloqueio padronizado com BSA desnaturada pelo calor e protocolos consistentes de semeadura celular para ensaios reprodutíveis de formação de tubos endoteliais.
- Envolve a otimização da densidade celular e dos tempos de incubação para HUVEC ou outros tipos de células endoteliais, a fim de obter fenótipos angiogênicos quantificáveis.
- É limitado pelo processo demorado de geração da matriz (tratamento com ácido ascórbico por 6 ou mais dias) e pela necessidade de reagentes estéreis e filtrados para prevenir contaminação.
