Name: Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a estabelecer modelos de infecção crônica, aguda e reativada por HIV em camundongos imunodeficientes humanizados. Este método utiliza células-tronco CD34+ e células mononucleares de sangue periférico para investigar a dinâmica viral em configurações pré-clínicas.

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Este trabalho foi apoiado por fundos internos da divisão clínica do IHV para a JCZ.

Neste trabalho, todos os cuidados e procedimentos para animais foram realizados de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland (números de protocolo 1018017, 1018018 e 0318009).
1. Enxertia humana de CD34+ HSC de camundongos recém-nascidos
<ol><li>Use sempre o equipamento de proteção pessoal descartável (PPE), incluindo esfrega estéreis, luvas, sapatas dedicadas, tampas de sapata, máscara, óculos de proteção, capota do cabelo/barba, e revestimentos de laboratório estéreis.</li>
	<li>Resuspenda 1 x 106 de CD34+ HSCs congelados (ver Tabela de Materiais)em 10 mL de mídia RPMI 1640 10% FBS um armário de biossegurança certificado e manter condições estéreis.</li>
	<li>Use 10 μL da suspensão para contar (para assegurar a presença do número esperado de células) e verifique a viabilidade celular por coloração de exclusão azul trypan em um hemocytometer.</li>
	<li>Centrífuga a 400 x g por 15 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatant e resuspenda no frio 1x PBS para a concentração necessária (1,4 x 105 de CD34+ HSCs em 50 μL). Mantenha as células no gelo até a injeção.</li>
	<li>Coloque os filhotes (NS γ-cadeianulo filhotes de ambos os sexos de 1-4 dias de idade) em um estéril 100 mm2 Placa de Petri, juntamente com uma pequena quantidade de material de cama da gaiola criador. Além disso, esfregue a cama limpa entre as mãos para mascarar ainda mais quaisquer odores estranhos sobre os filhotes receptores. NOTA: Isto minimiza os odores extrangeiros que estão sendo impregnados nos filhotes de cachorro, desse modo melhorando as possibilidades das mães que aceitam seus filhotes de cachorro de novo em gaiolas após o procedimento.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri em uma gaiola de transporte limpo e coloque a gaiola em uma gaiola microisolator de rato limpo para proteger os filhotes do meio ambiente. Cubra a gaiola de transporte com uma almofada de cobertura para evitar a exposição de animais à luz externa, enquanto em trânsito para a sala de irradiação.</li>
	<li>Irradiar filhotes com 100 cGy irradiação corporal inteira (WBI) pela exposição a uma fonte de 137 Cs. Limpe o interior do irradiador com solução desinfetante, coloque os ratos no radiador e ligue a plataforma giratória para que todos os filhotes sejam irradiados homogeneamente. Feche o radiador e pressione o interruptor de energia para iniciar o processo de irradiação. Espere até que o tempo de irradiação seja concluído e retire imediatamente os ratos. NOTA: Desde que a irradiação não gera o esforço nos ratos, a anestesia precedente não é exigida.</li>
	<li>2-4 h após o procedimento de irradiação, coloque os filhotes em um armário de biossegurança dentro de uma placa de Petri estéreis refrigerados coberto com gaze estéril no gelo, até anestesiar (~ 5-10 min). Anestesia suficiente é alcançada quando os movimentos brutos cessam.</li>
	<li>Carregue a seringa com uma agulha anexada (29 G, 0,5) com 50 μL da suspensão celular e 1,4 x 105 de CD34+ HSCs o armário certificado de biossegurança.</li>
	<li>Para o enxerto via injeção hepática, contenha os filhotes com o polegar e os dedos indicadores. Para minimizar a contenção do mouse (~ 30-45 s), deixe um investigador segurar o filhote e administrar a injeção, e ter o segundo investigador carregar a seringa com a suspensão HSC. Limpe o local da injeção com 70% de álcool e entregue 50 μL de células diretamente no fígado. Use um ângulo de agulha raso ao injetar para evitar perfurar completamente o fígado. Como controle, injete camundongos com 50 μL de 1x PBS no fígado.</li>
	<li>Coloque os filhotes em uma placa de Petri estéril pré-aquecida coberta com gaze estéril por 1-5 min para permitir a recuperação. Pré-aqueça o prato usando uma almofada de aquecimento infravermelho para roedores a 20 °C para garantir que os filhotes não serão mais aquecidos.</li>
	<li>Imediatamente antes de devolver os filhotes para seus pais, aplique uma pequena quantidade de pomada à base de mentol e eucalipto, usando o polegar e os dedos indicadores, ao cnout de ambos os pais para evitar canibalismo ou rejeição dos filhotes.</li>
	<li>Verifique as gaiolas todos os dias, procurando quaisquer sinais de doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) nos filhotes, como pele seca, sem alimentação, erupção cutânea e alopecia. Eutanásia os animais se algum desses sinais são observados.</li>
	<li>Ratos de wean em 3 semanas da idade, agrupando os pelo género. Não coloque mais de 5 animais por gaiola. Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria fluída aos 14 semanas de idade. NOTA: A taxa de sucesso do enxerto é entre 80%-100%.</li>
</ol>2. Enxerto de PBMC humano de camundongos juvenis
<ol><li>Para os modelos agudos e de reativação, injete camundongosnulos de 6-8 semanas de idade na cadeia de metodos nulos de NS intraperitoneally com PBMCs humanos derivados de um doador saudável ou paciente infectado pelo HIV que estava TAR, respectivamente. Em ambos os modelos, incluem camundongos injetados com PBMCs de um doador saudável sem infecção pelo HIV (farsa) como controles.</li>
	<li>Camada 15 mL de sangue inteiro em 5 mL de gradiente de densidade estéril médio em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Centrífuga a 400 x g por 30 min no RT, sem freios, para evitar que o casaco buffy se misturasse com o meio de gradiente de densidade.</li>
	<li>Coletar cuidadosamente a fração de células mononucleares (entre o gradiente de densidade médio e supernatant) e transferir o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de 1x PBS. Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT.</li>
	<li>Descarte o supernatant e remova os glóbulos vermelhos restantes lysing com 5 mL do amortecedor de ACK adicionado às pilhas pelleted. Incubar por 4 min em RT.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT. Descarte o supernatant e resuspenda em 10 mL de 1x PBS ou RPMI 1640 médio.</li>
	<li>Use 10 μL da suspensão celular para contar as células e verificar a viabilidade por coloração de exclusão azul trypan em um hemocytometer. Normalmente, 1-2 x 106 células são obtidas para cada 1 mL de sangue, com mais de 95% de viabilidade.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT. Descarte o supernatant e ajuste o número celular para a concentração necessária (neste caso, 3,5 x 106 células em 200 μL de 1x PBS).</li>
	<li>Carregue a seringa com uma agulha anexada (28 G, 0,5) com 3,5 x 106 de PBMCs em 200 μL de 1x PBS um armário certificado de biossegurança.</li>
	<li>Retire o mouse da gaiola e segure-o pela cauda para que ele possa segurar a malha, aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o indicador e os dedos do polegar sobre os ombros do animal, agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar as costas.</li>
	<li>Deslize a cabeça do rato para trás de modo que sua parte traseira esteja acima da cabeça. Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfuração dos órgãos internos durante a injeção.</li>
	<li>Limpe o local da injeção com 70% de álcool.</li>
	<li>Penetre a seringa usada na etapa 2.9 através da parede abdominal e aspira antes de injetar as pilhas, se algum material é aspirado, remova a seringa e rejeite-a. Caso contrário, injetar as células lentamente na cavidade intraperitoneal, remover a seringa e descartá-lo. Injetar 1x PBS para controlar ratos.</li>
	<li>Devolva o animal à sua gaiola.</li>
	<li>Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo em 3 semanas após a injeção.</li>
</ol>3. Cuidados pós-enxerto
<ol><li>Identifique ratos por marcação de ouvido.</li>
	<li>Observe os camundongos usados nesses experimentos de perto 2x por dia após cada procedimento para sinais clínicos de angústia.</li>
	<li>Após o transplante de células humanas, monitore camundongos para GVHD. Para monitorar os sintomas de GVHD em camundongos recém-nascidos, juvenis e adultos, avalie os animais para o aparecimento de doença sofra (ou seja, cor, secura, erupção cutânea, alopecia), além da medida de peso corporal. Avalie os animais que mostram estes sinais por um veterinário para considerar a eutanásia adiantada.</li>
</ol>4. Procedimento de infecção pelo HIV e procedimento de infecção simulada
NOTA: Para os modelos crônicos e agudos, os ratos são contaminados com a tensão da referência de HIV BaL na semana 14 e na semana 3 borne-engraftment, respectivamente. As injeções com HIV são administradas intraperitoneally nos quadrantes abdominais mais baixos.
<ol><li>Realize o processo de carregamento do vírus/PBS em seringas, usando uma agulha de 28 G 0.5", em armários BSL2 que seguem procedimentos ABSL2. A quantidade total de vírus injetado é 15.000 dose infecciosa mediana da cultura do tecido (TCID50)em 200 μL de RPMI estéril 1640.</li>
	<li>Retire o mouse da gaiola e segure-o por sua cauda para que ele possa segurar a malha, aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o dedo indicador e o polegar sobre os ombros do animal, agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar as costas.</li>
	<li>Deslize a cabeça do rato para trás de modo que sua parte traseira esteja acima de sua cabeça. Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfuração de órgãos internos durante a injeção.</li>
	<li>Limpe os ratos com uma almofada de álcool pré-wetted no quadrante esquerdo/direito mais baixo do abdômen. Injetar 15.000 TCID50 do vírus HIV BaL contido em 200 μL de RPMI estéril 1640.</li>
	<li>Após a injeção, devolva o rato à sua gaiola em casa.</li>
</ol>5. Coleta de sangue por punção retroorbital
NOTA: O sangramento retroorbital permite a coleta rápida de sangue, reduzindo assim o tempo de coleta geral e aumentando a estabilidade dos marcadores de linfócitos humanos. Use tubos EDTA para coletar sangue de camundongos.
<ol><li>No modelo crônico, às 14 semanas de injeção pós-HSC, recolher o sangue via veia retroorbital. Nos modelos agudos e de reativação, realize este procedimento a 3 semanas após a injeção de PBMC.</li>
	<li>Anestesie os animais usando 250 μL de inalação de isoflurano antes da coleta de sangue em uma classe B2 de capa de biossegurança que é canalizada externamente.</li>
	<li>Dispense o Isoflurane em almofadas de algodão uma malha de arame em um frasco 1 L claro em um armário de biossegurança ventilado fora do edifício. O uso da malha garante que os animais não entrem em contato com a almofada encharcado de isoflurano, o que pode causar irritação da pele e potencial overdose, uma vez que o isoflurano também é absorvido através da pele. Além disso, coloque uma toalha de papel macia entre a malha e o animal para evitar lesões nos membros.</li>
	<li>Uma vez que o frasco é saturado com isoflurane (aproximadamente 1 min depois de adicioná-lo), introduzir o animal e observar a taxa respiratória, que irá aumentar, em seguida, diminuir. Verifique se há indicação clínica de um plano profundo de anestesia, que inclui a falta de um reflexo de endireitamento (ao derrubar jar suavemente) e falta de movimentos grosseiros. Comece o procedimento de sangramento assim que o animal está completamente relaxado e sem o reflexo pitada do dedo do dedo do dedo do dodo. NOTA: Desde isoflurane evapora, dispensar mais drogas se não houver sinais de anestesia são observados.</li>
	<li>Para o sangramento retroorbital, pressione o mouse externo jugular veia caudal para a mandíbula com o polegar, e com a mesma mão, gentilmente elevar a pálpebra superior com o dedo indicador.</li>
	<li>Insira um tubo hematocrito no canthus medial do olho e direcione-o em uma direção ventrolateral até que o sangue comece a girar.</li>
	<li>Recolher pelo menos 100 μL de sangue. Uma vez que o volume desejado de sangue é obtido (um volume não mais do que o 1% do peso corporal do animal), interromper a pressão jugular externa e remover o tubo de hematócrito.</li>
	<li>Assegure que a hemostasis está completa aplicando a pressão direta no olho usando uma gaze estéril para um mínimo de 30 s.</li>
	<li>Aplique gotas de tetracaína no olho. Monitore o animal até que ele tenha recuperado completamente da anestesia e colocá-lo de volta na gaiola. NOTA: Os 100 μL de sangue coletado são utilizados para a avaliação do nível de enxerto de CD45 humano+ e outras populações de células sanguíneas, bem como para a avaliação da carga viral de plasma.</li>
</ol>6. Triagem do nível de enxerto e análise de citometria de fluxo
<ol><li>Siga um protocolo convencional de coloração de citometria de fluxo para sangue inteiro, que inclui a incubação de anticorpos anti-humanos com rótulofluorocromático (para painel de fluxo sugerido, ver Tabela de Materiais), seguido pela lisose dos glóbulos vermelhos e lavar os passos13,15. NOTA: Para a triagem do nível de enxerto, inclua um anticorpo CD45 anti-humano. Para a comparação, um anticorpo CD45 anti-mouse também pode ser usado. Inclua controles de compensação, bem como uma amostra de sangue humano manchada com a mesma mistura de anticorpos, amostras de camundongos e sangue humano não manchadas e controle não humanizado para testar a reatividade cruzada dos reagentes. Após a coloração, há sempre algum sinal de fundo; no entanto, todos os sinais positivos são claramente distinguidos de controles negativos e multi-reativos.</li>
	<li>Em um citometro de fluxo apropriado, adquirir pelo menos 10.000 eventos no portão linfócito (FSC-A vs SSC-A). Para análise de citometria de fluxo, após exclusão duplicada, determine a porcentagem de células CD45+ células humanas, bem como outras populações celulares de interesse.</li>
</ol>7. Avaliação da carga viral de plasma
<ol><li>Avalie a carga viral em animais infectados pelo HIV 1x por semana após a infecção.</li>
	<li>Após o sangramento retroorbital (aproximadamente 100 μL), obtenha plasma coletando o supernatant após centrífugação do sangue anticoagulado a 3.500 x g por 3 min em uma microcentrífuga. A pelota é usada para a infiltração das células sanguíneas.</li>
	<li>Use um kit de extração de RNA viral comercial (ver Tabela de Materiais)para obter RNA de 40 μL de plasma.</li>
	<li>Converta rna em cDNA usando a primeira mistura de síntese de cepa (ver Tabela de Materiais)e primer de mordaça do HIV SK431.</li>
	<li>Realize PCR quantitativo em tempo real usando primers HIV Gag SK38/SK39 e corantes verdes fluorescentes (por exemplo, verde SYBR) como descrito em estudos anteriores13,25.</li>
</ol>8. Administração de terapia antirretroviral
<ol><li>Administrar a TARA oral pelo menos 3 semanas após a infecção, quando a alta carga viral é observada, nos modelos crônicos, agudos e de reativação.</li>
	<li>Calcule as doses de tenofovir disoproxil fumarate (TDF), emtricitabina (FTC) e raltegravir (RAL), de acordo com valores km de 37 e 3 para humanos e camundongos, respectivamente26. Normalmente, as doses equivalentes a humanos de TDF, FTC e RAL são de 61,7 mg/kg/dia, 40,7 mg/kg/dia e 164 mg/kg/dia, respectivamente.</li>
	<li>Para a administração em água potável, esmagar comprimidos de drogas e adicionar a respectiva quantidade na garrafa de água, garantindo que cada rato na gaiola adquire sua dose diária. Uma vez que o pó de droga pode formar sedimentos na garrafa, periodicamente agitar a garrafa de água para conseguir suspensão homogênea.</li>
	<li>Mude a garrafa de água toda semana com drogas recém-dissolvidas.</li>
	<li>Coletar o sangue via veia retroorbital a cada semana ou a cada 2 semanas após a iniciação art para avaliar as mudanças na carga viral e cd4:cd8 relação.</li>
</ol>9. Eutanásia do rato, coleção de órgãos secundários do linfóide, e isolação de pilhas mononuclear
<ol><li>A eutanásia é realizada nos três modelos de camundongos humanizados, periodicamente ao longo do tempo de infecção, ou no final do experimento.</li>
	<li>Realize a eutanásia de camundongos adultos por asfixia de CO2, seguida pela luxação cervical. Para asfixia, use uma câmara não pré-carregada, dispense CO2 de um cilindro comercial com regulador de pressão fixa e restrição de linha controlando o fluxo de gás dentro de 20%-30% do volume/minuto da câmara para cumprir as diretrizes da AVMA de 2013.</li>
	<li>Mantenha o fluxo de CO2 para a parada respiratória de monitoramento de >60 (que pode levar até 5 min), seguido pela luxação cervical para garantir a eutanásia.</li>
	<li>Eutanásia neonatos <7 dias de idade por um método físico (ou seja, usando tesoura afiada).</li>
	<li>Visualize os gânglios linfáticos axillary, mediastinal e mesentéricos (que são tipicamente observados) e extrai-os com uma pinça e uma tesoura afiada. Também extraia o baço, localizado no lado superior esquerdo da cavidade peritoneal.</li>
	<li>Deposite os tecidos linfóides em tubos de centrífuga de 1,5 mL contendo rpmi estéril 1640 médio.</li>
	<li>Processe imediatamente os tecidos linfóides em um filtro de células de nylon do tamanho de um poros de 70 mm, coletando as células em um tubo de 50 mL. Não aspiratee os tecidos.</li>
	<li>Lave as células com 5 mL de RPMI 1640 médio complementado com 1% FBS para facilitar a filtragem de células.</li>
	<li>Após a desagregação do tecido, centrífuga as células de suspensão em 3.500 x g por 10 min em uma microcentrífuga.</li>
	<li>Descarte o supernatant e resuspenda as células com 500 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Transfira a suspensão das células para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de gradiente de densidade estéril.</li>
	<li>Centrífuga a 3.500 x g por 3 min em uma microcentrífuga, sem freio, para evitar que o casaco buffy se misturasse com o meio de gradiente de densidade</li>
	<li>Coletar cuidadosamente a fração de células mononucleares (entre o gradiente de densidade médio e supernatant) e transferir o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de 1x PBS. Centrífuga a 3.000 x g por 3 min.</li>
	<li>Retire os restantes glóbulos vermelhos, lysing com 500 μL de amortecimento ACK, incubando por 4 min em RT.</li>
	<li>Centrífuga a 3.000 x g por 3 min. Descarte o supernatant e resuspenda em 1 mL de 1x PBS ou médio.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Avanços importantes foram alcançados no desenvolvimento de cepas de camundongos imunodeficientes para a humanização, com uma série de opções diferentes que podem ser usadas de acordo com o interesse da pesquisa1. Desde que aqui é um protocolo geral para a humanização de ratosnulos da cadeia de metodos e cepas geneticamente semelhantes a serem empregadas em três modelos diferentes para estudar a infecção pelo HIV. Na primeira abordagem experimental, camundongos recém-nascidos irradiados ...

O modelo humanizado de camundongos nod/SCID/interleucina (IL)-2 receptor diminuidor (doravante referido como huNS γ-cadeianulo)modelo de camundongo tem sido amplamente utilizado para estudar a patogênese de infecções, autoimunidade e câncer, bem como para estudos pré-clínicos de drogas e terapias baseadas em células humanas1,2. Estes camundongos são baseados em um fundo diabético não obeso (NOD), com a mutação cidacada e mutação direcionada no locus il-2 receptor matador-cadeia (massa de turma comum de turma t-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que induzem um grave prejuízo no desenvolvimento de células t-, b-e-assassino natural (NK) do ratoT-,B-e natural (NK) . Assim, eles suportam o enxerto de tecido humano, CD34 humano+ células-tronco hematopoiéticas (HSCs), e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs)3,4,5. Além disso, a expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos, como fator de células-tronco (SCF), fator estimulante da colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e IL-3 promove o enxerto das populações mieloides humanas6,7,8.
Para estudos de HIV, vários modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS foram descritos, que diferem na cepa do camundongo, tipo de células humanas usadas, tipo de tecidos para o enxerto e origem das células (ou seja, saudável vs. Doador infectado pelo HIV)9,10. A cepa original, no entanto, é amplamente utilizada devido aos altos níveis de enxerto de células humanas e replicação viral após a infecção com uma referência da cepa HIV11,12,13. Cepas de camundongos imunodeficientes semelhantes com expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos (por exemplo, RATOS NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou com implantes de tecidos do fígado humano e do timo (camundongos de medula óssea-fígado-timo [BLT]) são úteis para avaliar o papel das populações mieloides na resposta imune anti-HIV, efeitos do HIV nesses tecidos e sua participação como reservatórios virais14,15. Além disso, algumas cepas com expressão transgênica de moléculas de antígeno leukócito humano (HLA), bem como camundongos BLT, podem ser usadas para estudar a resposta das células T à infecção pelo HIV16,17.
Em geral, nesses camundongos, a humanização depende da origem celular, da rota de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiac) e da idade do rato no momento do enxerto18,19,20. Em relação à origem celular, CD34+ HSC humano derivado de sangue do cordão umbilical, fígado fetal ou sangue periférico mobilizado pode ser injetado em camundongos recém-nascidos ou jovens3,21. Além disso, camundongosnulos adultos da cadeia de γ podem ser humanizados pela injeção de PBMC (aqui, referido como camundongosnulos da cadeia de metodolses de cadeia de metodolses hu-PBL-NS), permitindo a circulação temporal dessas células no sangue, órgãos linfoidos secundários e tecidos inflamados22,23,24.
Descrito aqui é um protocolo detalhado para o estabelecimento de modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS para o estudo da infecção pelo HIV. O primeiro é o modelo crônico, em que cd34 humanos+ HSCs derivados do sangue do cordão umbilical de um doador saudável são injetados em camundongos recém-nascidos, seguido de infecção com uma cepa de REFERÊNCIA HIV após 14 semanas de reconstituição do sistema imunológico humano. Este modelo permite a monitoração dos ratos por até ~36 semanas após a infecção. O segundo modelo é um modelo agudo, no qual pbmcs derivados de um doador saudável são injetados em adultos ns- cadeia de ratosnulos, seguido por infecção com uma referência da estirpe de HIV após 3 semanas de expansão de células T humanas no mouse. Finalmente, o terceiro modelo é o modelo de reativação, no qual os PBMCs derivados de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral supressiva (TARV) são injetados em camundongosnulos adultos da cadeia de metodols. Neste caso, um ambiente livre de drogas permite a reativação viral e aumento da carga viral. Os dois últimos modelos permitem o monitoramento por até ~9 semanas após o enxerto.
No geral, esses três modelos são úteis para estudos virológicos, estudos pré-clínicos de novos medicamentos e avaliação dos efeitos da infecção pelo HIV na resposta imune global. Também é importante considerar que o uso de camundongos humanizados infectados pelo HIV requer revisão e aprovação pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC), bem como pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) antes de qualquer experimento. Isso garante que o estudo siga todas as regulamentações institucionais internas e externas para o uso de material biológico perigoso e manuseio humano de animais experimentais.

<table><tbody><tr><td>0. Tubos de microcentrífuga de 5 ml</td><td>Neptune</td><td>3735.S.X</td><td></td></tr><tr><td>1. Tubos de microcentrífuga de 5 ml</td><td>Neptune</td><td>3745.S.X</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipetas</td><td>serológicas estelares</td><td>VL-4090-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>Stellar scientific</td><td>T15-600</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipetas serológicas</td><td>estelares sceintific</td><td>VL-4090-0025</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 5 ml</td><td>stellar sceintific</td><td>VL-4090-0005</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>Tampão</td> de lise Stellar scientific <td>T50-600</td><td></td></tr><tr><td>ACK</td><td>Qualidade biológica</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool</td><td>Fisher scientific</td><td>06-669-62</td><td>Clone estéril</td></tr><tr><td>anti-humano CD3 UCHT1</td><td>Biolegend</td><td>300439</td><td>APC clone</td></tr><tr><td>conjugado anti-humano CD4 OKT4</td><td>Biolegend</td><td>317420</td><td>AF488 clone conjugado</td></tr><tr><td>anti-humano CD45 2D1</td><td>Biolegend</td><td>368522</td><td>BV421 conjugado</td></tr><tr><td>clone anti-humano CD8 SK1</td><td>Biolegend</td><td>344710</td><td>PerCP-Cy5.5 conjugado</td></tr><tr><td>Biosafaty gabinete nível 2</td><td></td><td></td><td>Se possível conectado a um exauste chimeny ao manusear Isoflurano</td></tr><tr><td>Bonnet</td><td>Fisher scientific</td><td>17-100-900</td><td>Tampa de uso único para proteção básica</td></tr><tr><td>Cavicida</td><td>Metrex</td><td>13-1000</td><td>Desinfectante de superfície</td></tr><tr><td>Células CD34+</td><td>Lonza</td><td>2C-101</td><td>Como muitos frascos disponíveis de um único doador</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman</td><td>65-6KR</td><td></td></tr><tr><td>Frasco transparente</td><td>Amazon</td><td>77977</td><td></td></tr><tr><td>Almofada</td> <td>de gaze de algodãoFisher scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>Jalecos descartáveis estéreis</td><td>Microtubos Fisher scientific</td><td>19-472-422</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Máscara</td> facial <td>Greiner bio-one</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>scientific</td><td>17-100-897</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lise FACS</td><td>BD</td><td>340202</td><td></td></tr><tr><td>FBS premium HI</td><td>Atlanta biologics</td><td>S1115OH</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE health one</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro</td><td></td><td></td> de fluxo <td>Usamos tubos de citometria de fluxo FACS Aria II</td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td></td><td>352054 5 ml de poliestireno e fundo redondo</td></tr><tr><td>HIV BaL</td><td></td><td></td><td>Preparado em nossa instalação central uQUANT</td></tr><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td> humanos <td>Voluntários HIV positivos e negativos</td></tr><tr><td>Infravermelho almofada de aquecimento</td><td>Venet scientific</td><td>DCT-25</td><td>Almofada de aquecimento terapêutico temporária para pequenos animais</td></tr><tr><td>Isentress (Raltegravir)</td> <td>Merck</td><td>NSC 0006-0227061</td><td>Medicação antirretroviral para tratar o vírus da imunodeficiência humana (HIV) - inibidor da integrase</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Mark I irradiador</td><td></td><td></td><td>Equipamento pertencente à universidade de Pipetas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de micro de</td></tr> Maryland <tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse brincos</td><td>National Band & Tag company</td><td>1005-1L1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de coleta de sangue Natelson</td><td>Fisher scientific</td><td>02-668-10</td><td></td></tr><tr><td>NOG-EXL</td><td>Taconic</td><td>HSCFTL-13395-F</td><td></td></tr><tr><td>NSG camundongos</td><td>Jackson</td><td>5557</td><td>Tempo fêmeas grávidas para enxerto CD34 e Juvenis para enxerto PBMCs</td></tr><tr><td>NSG-SGM3</td><td>Jackson</td><td>13062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16%</td><td>Ciências de microscopia eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>100-10-023</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-28</td><td></td></tr><tr><td>Quantistudio qPCR máquina</td><td>Thermo</td><td>QS3</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes</td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>RPMI mídia 1640 1X</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sapato cobre</td><td>Fisher scientific</td><td>17-100-911</td><td></td></tr><tr><td>Luvas descartáveis estéreis</td><td>Microflex</td><td>SUF-524</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Síntese de primeira fita SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>10080-400</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de síntese de cDNA 28-G x 1/2</td><td>BD</td><td>329-461</td><td></td></tr><tr><td>Seringas 29-G x 1/2</td><td>BD</td><td>324-702</td><td></td></tr><tr><td>Truvada (Emtricitabina e Tenofovir</td><td>Gilead</td><td>NDC 61958-0701-1</td><td>Medicamento antirretroviral para tratar o vírus da imunodeficiência humana (HIV)-Nicleosídeo inibidor da transcriptase análoga</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Contagem de células e viabilidade</td></tr><tr><td>Vick Vaporub</td><td>Saúde escolar</td><td>43214</td><td>Pomada à base de mentol e eucalipto</td></tr><tr><td>Grau de biologia molecular da água</td><td>Qualidade biológica</td><td>351-029-131</td><td></td></tr></tbody></table>

infecção por hiv crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Camundongosanulosos humanizados no nod/scid/il-2 receptor nulos recapitulam algumas características da imunidade humana, que podem ser exploradas em pesquisas básicas e pré-clínicas sobre doenças infecciosas. Aqui estão três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV. O primeiro é baseado na injeção intrahepática de CD34+ células-tronco hematopoiéticas em camundongos recém-nascidos, o que permite a reconstituição de várias células confinadas no sangue e tecido linfóide, seguida de infecção por uma cepa de HIV de referência. Este modelo permite o monitoramento por até 36 semanas após a infecção e, portanto, é chamado de modelo crônico. O segundo e o terceiro modelos são referidos como os modelos agudos e de reativação, nos quais as células mononucleares periféricas do sangue são injetadas intraperitoneally em camundongos adultos. No modelo agudo, as células de um doador saudável são enxertadas através da rota intraperitoneal, seguidas de infecção por uma cepa de HIV de referência. Finalmente, no modelo de reativação, as células de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral são enxertadas através da rota intraperitoneal. Neste caso, um ambiente livre de drogas no mouse permite a reativação do vírus e um aumento na carga viral. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a abordagem experimental convencional para modelos de camundongos humanizados e imunodeficientes da infecção pelo HIV.

Conforme descrito acima, em 14 semanas de injeção pós-HSC (modelo crônico) ou em 3 semanas de injeção pós-PBMC (modelos agudos e de reativação), os ratos são sangrados para a triagem do nível de enxerto de células humanas por citometria de fluxo. Uma estratégia representativa de gating para a avaliação de 1) CD45 humano+ células reconstituição e 2) porcentagem de CD4+ e CD8+ Células T é mostrado na Figura 1A. Normalmente, o nível de enxerto (...

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...

Este procedimento descreve três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para o estudo da dinâmica da infecção pelo HIV. Ratos humanizados NSG recapitulam características de imunidade humana. Neste caso, permitindo o estudo da infecção crônica, aguda e reativada do HIV em ambientes pré-clínicos.Demonstrando o procedimento de preparação celular estará Sandra Medina-Moreno, supervisora de pesquisa laboratorial do nosso grupo. Ao realizar este procedimento, use sempre equipamentos de proteção pessoal descartáveis, incluindo esfoliantes estéreis, luvas, sapatos dedicados, capas de sapato, máscara, óculos, capô de cabelo e barba, e um jaleco estéril. Para o modelo crônico, resuspenque um milhão de células-tronco CD34+humanas congeladas em 10 mililitros de mídia RPMI 1640 com 10% de FBS sob um armário de biossegurança certificado e mantenha condições estéreis.Use 10 microliters da suspensão para contar e verificar a viabilidade celular pela mancha de exclusão trypan blue em um hemócito. Em seguida, centrifufique a suspensão da célula a 400 vezes g por 15 minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernasciente e resuspenque as células no frio 1X PBS na concentração necessária.Mantenha as células no gelo até a injeção. Esfregue a roupa de cama limpa entre as mãos para mascarar quaisquer outros odores estranhos nos filhotes receptores. Em seguida, coloque os filhotes em uma placa de Petri de 100 milímetros quadrados estéril, juntamente com uma pequena quantidade de material de cama da gaiola do criador.Coloque a placa de Petri em uma gaiola de transporte limpo e, em seguida, coloque a gaiola em uma gaiola de transporte Carboy para proteger os filhotes da luz direta e do ruído. Cubra a gaiola de transporte com uma almofada de cobertura para evitar a exposição dos animais ao ambiente enquanto estiver em trânsito para a sala de irradiação. Após a anestesia, conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para o enxerto por injeção hepática.Para minimizar o tempo de contenção do rato, deixe um investigador carregar a seringa com a suspensão das células-tronco e fazer com que o segundo investigador segure o filhote e administre a injeção. Carregue 50 microliters da suspensão de células-tronco CD34+humanas na seringa com uma agulha anexada sob o armário de biossegurança certificado. Contenha os filhotes com polegar e dedos indicadores e limpe o local da injeção com 70% de álcool.Use um ângulo de agulha raso para entregar 50 microliters de células diretamente no fígado para não perfurar completamente o fígado. Pré-aqueça o prato usando uma almofada de aquecimento infravermelho para roedores a 20 graus Celsius para garantir que os filhotes não serão mais aquecidos. Coloque os filhotes na placa de Petri coberta com gaze estéril por um a cinco minutos para permitir a recuperação.Imediatamente antes de devolver os filhotes aos seus pais, aplique uma pequena quantidade de pomada à base de mentol e eucalipto usando o polegar e os dedos indicadores no focinho de ambos os pais para evitar o canibalismo ou a rejeição dos filhotes. Verifique as gaiolas todos os dias, procurando qualquer sinal de enxerto versus doença hospedeira nos filhotes, como pele seca, sem alimentação, erupção cutânea ou alopecia. Desmamar os filhotes com três semanas de idade e casá-los em gaiolas diferentes.Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo aos 14 semanas de idade. Uma estratégia representativa de gating para a avaliação da reconstrução celular CD45+e percentual de células CD4+e CD8+T é mostrada. A taxa de sucesso do enxerto é entre 80% a 100% Uso de células mononucleares de sangue periféricos humanos derivadas de um doador saudável para o modelo agudo ou de um paciente infectado pelo HIV que estava sob terapia antirretroviral para o modelo de reativação.Camada 15 mililitros de sangue inteiro em cinco mililitros de gradiente de densidade estéril em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 400 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente sem pausas para evitar que o casaco buffy fique misturado com o meio gradiente de densidade. Colete cuidadosamente a fração de células mononucleares entre o gradiente de densidade médio e o sobrenante.Transfira o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 1X PBS. Centrifugar a 300 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernascimento e remova os glóbulos vermelhos restantes, lise com cinco mililitros de tampão de lise ACK adicionados às células pelladas.Incubar por quatro minutos em temperatura ambiente. Depois de centrifuging novamente como antes, descarte o supernaspe e resuspend em 10 mililitros de 1X PBS ou RPMI 1640 médio. Use 10 microliters da suspensão celular para contar as células e verificar a viabilidade pela mancha de exclusão trypan blue em um hemótmetro.Normalmente, de um a dois milhões de células são obtidas para cada um mililitro de sangue com mais de 95% de viabilidade. Após a centrifugação como antes, descarte o sobrenante e ajuste o número da célula à concentração necessária. Carregue 3,5 milhões de células mononucleares de sangue periféricos em 200 microliters de 1X PBS em uma seringa com uma agulha presa sob um armário de biossegurança certificado.Retire o mouse da gaiola e segure-o pela cauda para que ele possa segurar a malha aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o dedo indicador e o polegar sobre os ombros do animal agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar suas costas. Deslize a cabeça do mouse para trás para que suas costas estão acima de sua cabeça.Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfurar órgãos internos durante a injeção. Limpe o local da injeção com 70% de álcool. Penetre a seringa preparada através da parede abdominal e aspire antes de injetar as células.Se algum material estiver aspirado, remova a seringa e descarte-a. Caso contrário, injete as células lentamente na cavidade intraperitoneal antes de remover a seringa e descartá-la. Devolva o animal à sua gaiola e verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo em três semanas após a injeção.Identifique ratos por marcação de ouvido. Observe os camundongos utilizados nesses experimentos de perto, duas vezes por dia após cada procedimento para sinais clínicos de angústia. Em seguida, proceda à injeção de HIV, conforme descrito no protocolo de texto.Após a injeção do HIV, há um rápido aumento da carga viral plasmática geralmente sendo detectável após duas a três semanas após a infecção em ambos os modelos crônicos e agudos com cinética semelhante no modelo de reativação. O aumento da carga viral coincide com uma diminuição na proporção CD4:CD8. Essas alterações não são observadas em camundongos de controle.Note-se que, no modelo humanizado de mouse adulto PBMC NSG, observa-se uma inversão inicial da razão CD4:CD8 e reconstituída ao longo do tempo de monitoramento. Quando a terapia antirretroviral é administrada em camundongos infectados pelo HIV, a supressão da carga viral, bem como a recuperação na razão CD4:CD8 ocorreram como esperado atingindo níveis semelhantes aos dos que não foram infectados. Normalmente, após duas a três semanas de tratamento, observa-se uma diminuição da carga viral e aumento da razão CD4:CD8 nos modelos crônicos, agudos e de reativação.Use a dose de irradiação recomendada para evitar overdose letal ou rejeição de células transplantadas. Não fure completamente o fígado durante a injeção e use roupa de cama para mascarar odores que a barragem vai perceber como estranho. Esses três modelos permitem o teste de compostos antivirais, anticorpos anti-HIV ou outras substâncias biológicas que afetam a replicação viral.Além disso, permitem experimentos de transferência adaptativa para a imunoterapia do HIV. Camundongos humanizados NSG podem ser reconstituídos parcial ou integralmente com células humanas para responder a patógenos ou drogas, imitando a complexidade do sistema imunológico humano. Todas as medidas biológicas básicas precisam ser rigorosamente seguidas, uma vez que os camundongos humanizados do NSG podem ser infectados com patógenos murinos e humanos, particularmente neste caso que usa manipulação do vírus HIV.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar a eficácia da terapia antirretroviral oral combinada (cART oral) em um modelo de camundongo humanizado infectado pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1). Uma combinação de medicamentos direcionados ao HIV-1, incluindo inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeos e inibidores de transferência de fita integrase, é administrada junto com um suplemento nutricional e antibióticos. Após o consumo dessa mistura pelos camundongos humanizados...

Terapia Antirretroviral Combinada Oral para Tratar a Infecção pelo HIV-1 em Modelo de Camundongo Humanizado

O vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada baseada em células-tronco contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O tecido do timo fetal humano e as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) projetadas são implantados na cápsula renal de um camundongo gravemente imunocomprometido. As HSCs, que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) contra o HIV, são misturadas em uma mistura de proteínas gelatinosas que promove sua...

Construindo um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada contra o HIV

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.

Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano

Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.

Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais combinacionais orais que suprimem com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados.

Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1

Este protocolo descreve como a combinação da infecção por EcoHIV com camundongos Tmem119-EGFP oferece um sistema biológico valioso para investigar alterações microgliais e reservatórios virais em modelos de roedores de distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.

Identificação de células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos manipulados por microglia

Aprenda a estabelecer modelos de infecção crônica, aguda e reativada por HIV em camundongos imunodeficientes humanizados. Este método utiliza células-tronco CD34+ e células mononucleares de sangue periférico para investigar a dinâmica viral em configurações pré-clínicas.

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

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