Name: Ferimento da medula espinal da contusão através de um Laminectomy Microsurgical no Axolotl regenerative (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a realizar lesão por contusão na medula espinal de axolotes Ambystoma mexicanum através de laminectomia microcirúrgica. Este protocolo padronizado simula trauma clínico para estudos de regeneração neural.

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Michael Pedersen, Universidade de Aarhus por sua experiência e tempo no desenvolvimento de protocolos de RM e criação de todo o projeto. Peter Agger, Universidade de Aarhus para sua perícia e tempo em desenvolver os protocolos de MRI. Steffen Ringgard, Universidade de Aarhus por sua perícia e tempo em desenvolver os protocolos de MRI. O desenvolvimento do modelo SCI no Axolotl foi gentilmente apoiado pela A.P. Møller Maersk Fundação, a Fundação Riisfort, a Fundação LinEx, ea Fundação ELRO.

Todos os regulamentos institucionais e governamentais aplicáveis ao uso ético dos animais foram seguidos durante este estudo. O estudo foi conduzido o ID de aprovação: 2015-15-0201-0061 pela Inspetoria da experimentação animal dinamarquesa. Os animais foram axolotls mexicanos (Ambystoma mexicanum, massa corporal média ± dst: 12,12 g ± 1,25 g).
1. preparação
<ol><li>
Prepare o Axolotl para a anestesia.
	<ol>
<li>Use água de torneira não-quimicamente tratada de alta qualidade. Se não estiver disponível, use 40% da solução de Holtfreter.</li>
		<li>Dissolver 200 mg de etil 4-aminobenzoato (Benzocaína) em 3 mL de acetona. Dissolva esta solução em 1 L de água da torneira ou 40% de solução de Holtfreter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um prato de Petri padrão (100 milímetros no diâmetro) coloc um microscópio estereofónico como uma tabela cirúrgica. Coloc um pano de matéria têxtil cirúrgico no prato de Petri. Nota: Usar uma placa de Petri como uma área cirúrgica permite o movimento e a rotação do animal sem tocá-la, assegurando a estabilidade espinal durante a cirurgia.</li>
	<li>Prepare todos os instrumentos microcirúrgicos estéreis (isto é, tesouras e fórceps anatômicos).</li>
</ol>2. anestesia
<ol><li>Coloc o Axolotl em um recipiente com solução do benzocaína por aproximadamente 45 minutos para assegurar a anestesia profunda e estável. Nota: A concentração dada de benzocaína causará anestesia em todos os tamanhos de axolotls.</li>
	<li>Verifique se há sinais de anestesia geral dentro de 30-45 min. Estes incluem uma completa falta de movimentos branquiais, reflexo de endireitando, ou resposta a estímulos táteis ou dolorosos (beliscar suave da teia do dedo do pé).</li>
	<li>Para manter a anestesia, envolva os animais em papel toalha umedtado na solução anestésica. Molhe estes regularmente com esta solução durante o procedimento cirúrgico para assegurar-se de que a pele e as brânquias sejam mantidas húmidas.</li>
	<li>Recupere o animal após a cirurgia, colocando-o em um recipiente contendo água da torneira fresca. Observe os sinais de recuperação, como o movimento das guelras e o reflexo de endireitando, dentro de 1 h16.</li>
</ol>3. laminectomia microcirúrgica
Nota: O laminectomy é executado um stereomicroscope.
<ol><li>Coloque o animal na posição prona na placa de Petri. Enrole-o em toalhas de papel de modo que a cauda é exposta. Nota: As toalhas de papel são excelentes para assegurar a estabilidade durante todo o procedimento.</li>
	<li>
Identifique os membros posteriores. Faça a primeira incisão apenas caudal para eles.
	<ol>
<li>Com um par de Microtesoura, realize uma incisão vertical da quilha até que a proeminência óssea dos processos espessas sejam sentidos. Nota: Tenha muito cuidado ao agarrar a quilha e pele com fórceps, porque estes facilmente infligir danos à pele delicada.</li>
		<li>Estender o corte lateralmente, de modo que a incisão atravessa toda a largura da cauda.</li>
		<li>Agarre o processo espinhoso com fórceps para assegurar a profundidade direita.</li>
		<li>Estenda as incisões verticais 1 mm abaixo do processo espícuo em ambos os lados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloc o animal em um lado para executar incisões ventral e horizontais como indicado abaixo.
	<ol>
<li>Com um par de Microtesoura, a partir do ponto ventral da incisão vertical, fazer uma incisão horizontal de aproximadamente 15 mm para os animais 10-20 g em peso. Faça a incisão mais longa para animais maiores, e menor para animais menores.</li>
		<li>Usando a tesoura, dissecar medialmente através da incisão horizontal até que a coluna vertebral é sentida na linha média.</li>
		<li>Repita os passos 3,3, 3.3.1 e 3.3.2 do outro lado do animal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tendo dissecado no plano medial profundo de ambos os lados, dissecar através da linha média, conectando assim as duas incisões horizontais.
	<ol>
<li>Mova o pedaço de cauda e a quilha livres para um lado, expondo os processos espívoros (Figura 1).</li>
		<li>Fixate a parte da cauda usando toalhas de papel molhadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloque o animal na posição propensa novamente com a cabeça virada para o lado não dominante do cirurgião.
	<ol>
<li>Com um par de fórceps, segure os processos espinhoso apenas caudal aos membros traseiros. Aplique um elevador suave tanto para cima como para a cabeça do animal.</li>
		<li>Coloque as lâminas de um par de Microtesoura horizontal ao redor do processo e gentilmente cortá-la. O elevador no processo assegura-se de que esteja removido agora, expondo a medula espinal.</li>
		<li>Agarre o processo espinhoso apenas caudal a esse que foi removido apenas e repita etapas 3.5.1 e 3.5.2. Nota: Isso deve deixar uma medula espinhal exposta correspondente a dois níveis vertebrais. Ao executar o laminectomy, uma secreção espumosa branca aparece frequentemente. A medula espinhal é facilmente identificada pelo seu brilho distintivo, juntamente com uma embarcação que corre ao longo da linha média.</li>
		<li>Dependendo do tamanho do animal, a área exposta pode não ser suficientemente larga. Usando dois pares de fórceps, segure as lâminas em ambos os lados da medula espinal e torça estes lateralmente com um movimento delicado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. introdução de um ferimento tipo contusão (Figura 2)
<ol><li>Mantenha o animal na posição prona.</li>
	<li>Use o prato de Petri para transferir o animal para a unidade de trauma.</li>
	<li>Ter um assistente brilhar uma lanterna na medula espinhal.</li>
	<li>Coloc o cilindro da unidade do traumatismo da contusão acima da medula espinal expor usando os microajustadores na unidade. Mire no cilindro.</li>
	<li>Abaixe o cilindro até que esteja nivelado com os laminae.</li>
	<li>Prenda a haste de queda ao electroímã. Coloque o cilindro de ajuste de altura de queda desejado na unidade de trauma.</li>
	<li>Coloque a haste de queda no cilindro. Nota: Para um estudo cego, o cirurgião deve agora sair da sala sem saber se o animal será atribuído a uma lesão ou um grupo de cirurgia Sham.</li>
	<li>Desligue o eletroímã. A vara cai para a medula espinhal exposta.</li>
	<li>Use o parafuso de ajuste de altura para levantar a haste da medula espinhal.</li>
	<li>Confirme a lesão observando a medula espinhal através do microscópio. O local ferido aparecerá mais escuro, e o sangramento da embarcação da linha média será aparente.</li>
</ol>5. apresentando um ferimento afiado
Nota: Execute estas etapas após 3.5.4.
<ol><li>Com um par de Microtesoura cortar a medula espinhal em um corte vertical perfeito.</li>
	<li>Repita o corte 2 mm para o lado caudal do corpo. Nota: O comprimento da parte removida da medula espinal pode ser ajustado como por a exigência do estudo. No entanto, um corte de 2 mm será regenerável10.</li>
	<li>Assegure-se de que os cortes estejam completos. Após a conclusão, sentir as lâminas da tesoura raspando ao longo da parte ventral do canal espinhal.</li>
	<li>Levante o pedaço de medula espinhal de 2 mm do canal espinhal.</li>
</ol>6. fechando a ferida cirúrgica
<ol><li>Devolva o animal para a mesa cirúrgica. Em um estudo cego, reposicione a quilha para que a medula espinhal não seja visível para o cirurgião.</li>
	<li>
Mantenha o animal na posição prona.
	<ol>
<li>Começar a colocar 10,0 suturas de náilon da parte mais caudal da incisão horizontal. Feche as feridas em uma camada. Nota: Não segure a pele muito apertado, porque ele vai infligir necrose.</li>
		<li>Trabalhe para a parte vertical da incisão.</li>
		<li>Ao atingir o ângulo, gire a placa de Petri e sutura a outra incisão horizontal.</li>
		<li>Definir suturas nas incisões verticais.</li>
		<li>Não coloque suturas na parte superior da quilha, porque a pele aqui não será capaz de segurar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. devolver o animal à solução livre de anestésico
<ol><li>Levante o prato de Petri com o animal e mergulhe muito suavemente em água fresca apenas 5 cm de profundidade e deixe o animal deslizar. Nota: A profundidade da água rasa assegura-se de que o animal não tentará nadar à superfície para respirar.</li>
	<li>Não mude a água durante a primeira semana.</li>
	<li>Ao alimentar os animais, certifique-se de que o alimento é colocado perto da cabeça do animal. Nota: O objetivo destas medidas é evitar o máximo de movimento possível durante a primeira semana.</li>
</ol>8. ultrassonografia pós-operatória
<ol><li>Antes da terminação da anestesia, use um sistema de ultra-som de alta freqüência para adquirir imagens da lesão que pode ser usado para a construção de imagens tridimensionais do site SCI.</li>
	<li>Fixe o transdutor a um micromanipulador, de preferência regido por um joystick remoto.</li>
	<li>Submergir o animal anestesiado na posição prona em um pequeno recipiente preenchido com solução anestésica. Nota: Fixe o animal com sacos de areia em miniatura ou outro equipamento para evitar movimentos durante a sequência de digitalização.</li>
	<li>Alinhe a ponta do transdutor com o eixo de comprimento do animal e mergulhe-o na solução de benzocaína até que seja apenas alguns milímetros acima da quilha atrás dos membros posteriores do animal.</li>
	<li>Identifique o site SCI. Nota: O local do ferimento é facilmente reconhecível devido aos processos espinhoso faltantes diretamente acima do Sci.</li>
	<li>Otimize a imagem ajustando as configurações de ultrassom. Assegure-se de que o site SCI esteja no centro da imagem. Ajuste o campo de visão (ou seja, a profundidade da imagem, o deslocamento de profundidade e a largura da imagem) para cobrir o local de SCI e o tecido saudável adjacente. Ajuste o ganho bidimensional para otimizar o contraste da imagem.</li>
	<li>Varrendo o transdutor do ultra-som através do local do Sci com um micromanipulador eletronicamente operado, adquira imagens do B-modo que cobrem o local do Sci em posições transversais sagital múltiplas da fatia, com fatias consecutivas com um intervalo do a de 50 μm. adquira Cine-imagens contendo 500 frames com uma taxa de quadros de ~ 50 frames/s e uma freqüência do transdutor de 40 megahertz. Nota: Esta configuração requer um micromanipulador eletrônico regido por um joystick remoto (etapa 8,2).</li>
	<li>Depois de terminar a sequência de digitalização, retorne para a etapa 7.</li>
</ol>

<ol><li>Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Long-Term+Survival+After+Spinal+Cord+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).</li>
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<li>Butler, E. G., Ward, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+spinal+cord+following+ablation+in+urodele+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).</li>
<li>Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+miR-125b+levels+is+required+to+create+a+regeneration-permissive+environment+after+spinal+cord+injury%3A+a+cross-species+comparison+between+salamander+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat.</a> Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).</li>
<li>Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+descending+axons+in+the+spinal+cord+of+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl.</a> Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).</li>
<li>McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+central+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration+from+the+implanted+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres.</a> Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).</li>
<li>Thygesen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+blunt+spinal+cord+injury+model+in+the+regeneration+competent+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail.</a> Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).</li>
<li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoss%2C+RJ+%22Principles+of+Regeneration%22">Principles of Regeneration</a>. , Academic Press. New York. (1969).</li>
<li>Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+limb%3A+a+model+for+bone+development%2C+regeneration+and+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing.</a> Bone. 40 (1), 45-56 (2007).</li>
<li>Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+%282%2C6-diisopropylphenol%29+is+an+applicable+immersion+anesthetic+in+the+axolotl+with+potential+uses+in+hemodynamic+and+neurophysiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments.</a> Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Porque o risco de ferimento à medula espinal é significativo, as etapas críticas do protocolo estão removendo os processos espinhoso e o alargamento do acesso ósseo ao canal espinal se necessário. Como mencionado no protocolo, a remoção do processo mais craniano primeiro é altamente recomendável. Isto significará que os processos mais caudais protegem a medula espinal de ser batido pela tesoura. Recomenda-se assegurar o suficiente acesso cirúrgico, significando não fazer demasiado pequeno uma incisão preliminar. Além dis...

O objetivo geral deste estudo foi estabelecer um método microcirúrgico controlado e reprodutível para infestar o Sci Blunt e afiado ao Axolotl (mexicanum de Ambystoma), produzindo um modelo regenerativa da lesão da medula espinal.
A LM é uma condição grave que, dependendo do nível e da extensão, inflige incapacidade neurológica às extremidades, juntamente com comprometimento da bexiga e do controle intestinal1,2,3. A maioria de Sci são o resultado do traumatismo sem corte da alta energia tal como acidentes de tráfego e quedas4,5. Os ferimentos afiados são muito raros. Portanto, o tipo de lesão macroscópica mais comum é contusões.
O sistema nervoso central de mamíferos (SNC) é um tecido não regenerativo,portanto, nãoé observada restauração do tecido neurológico após a LM6,7,8. Por outro lado, alguns animais têm uma capacidade intrigante de regenerar os tecidos, incluindo o tecido do SNC. Um desses animais é o Axolotl. É amplamente utilizado em estudos de biologia regenerativa e é de interesse na regeneração da medulaespinhal, poisé um vertebrado9,10,11,12.
A maioria dos estudos de Sci no Axolotl são realizadas como amputação de toda a cauda ou ablação de uma parte maior da medula espinhal9,10,11,12. Recentemente, um novo estudo foi publicado em lesões contundentes13 que imita situações clínicas melhor. Considerando que a amputação completa do apêndice no Axolotl resulta em regeneração total, alguns fenômenos regenerativos não baseados na amputação dependem do defeitocrítico de tamanho(CSD)14,15. Isto significa que as lesões que excedem um limiar crítico não são regeneradas. Para desenvolver um modelo regenerativo com maior valor translacional clínico, este estudo investigou se um trauma contundente de 2 mm excederia o limite da CSD.
Este método é relevante para pesquisadores que trabalham na regeneração da medula espinhal em pequenos modelos animais, especialmente no Axolotl. Além disso, pode ser de interesse mais geral, porque apresenta uma maneira de usar o equipamento de laboratório padrão para desenvolver um mecanismo sem corte do traumatismo que seja apropriado para o uso em animais pequenos geralmente.

<table><tbody><tr><td>25 g de haste de queda personalizada</td><td>feita</td><td></td><td></td>em casa</tr><tr><td>30 mm tubo de PVC</td><td>feito sob medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-64-1</td><td>Propanone</td></tr><tr><td>Axolotl (Ambystoma mexicanum)</td><td>Exoterra GmbH</td><td>N/A</td><td>12-22 cm e 10 g - 80 g, Todas as cepas (tipo selvagem, melanóide, branco, albino, branco transgênico com GFP)</td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94-09-7</td><td>etil 4-aminobenzoato</td></tr><tr><td>Electromaget</td><td>personalizado caseiro Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2010</td><td>Microsoft</td><td>N / A</td><td>Excel 2010 ou mais recente</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>ImageJ 1.5e ou mais recente. Rasband, W.S., ImageJ, Institutos Nacionais de Saúde dos EUA, Bethesda, Maryland, EUA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos microcirúrgicos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fórceps e tesouras</td></tr><tr><td>MS550s</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>MS550s</td><td>40 MHz frequência central, transdutor</td></tr><tr><td>MS700</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>MS700</td><td>50 MHz frequência central, transdutor</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>qualquer fabricante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pano</td> <td>macioN/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer pedaço de pano macio medindo aproximadamente 70 x 55 cm2 por exemplo, um pano de prato</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>estéreo</tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>Vevo 2100</td><td>Sistema de ultrassom de alta frequência</td></tr></tbody></table>

ferimento da medula espinal da contusão através de um laminectomy microsurgical no axolotl regenerative

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

O objetivo deste estudo é estabelecer um modelo de lesão medular sem corte regenerativa padronizada e reprodutível no Axolotl (Ambystoma mexicanum). A maioria das lesões clínicas da medula espinhal ocorrem como traumas contundentes de alta energia, induzindo lesões de contusão. Entretanto, a maioria de estudos na medula espinal do Axolotl foram conduzidos com traumas afiados. Assim, este estudo tem como objetivo produzir um modelo regenerativo mais clinicamente relevante. Devido à sua impressionante capacidade de regenerar quase todos os tecidos, axolotls são amplamente utilizados como modelos em estudos regenerativos e têm sido amplamente utilizados em estudos de lesão medular (SCI). Neste protocolo, os axolotls são anestesiados por submersão em solução de benzocaína. o microscópio, uma incisão angular é feita bilateralmente em um nível apenas caudal para os membros posteriores. A partir desta incisão, é possível dissecar e expor os processos espinhoso. Usando fórceps e tesouras, um laminectomy de dois níveis é executado, expondo a medula espinal. Um dispositivo feito encomenda do traumatismo que consiste em uma haste de queda em um cilindro é construído, e este dispositivo é usado para induzir um ferimento da contusão à medula espinal. As incisões são então suturadas, e o animal se recupera da anestesia. A aproximação cirúrgica é bem sucedida em expor a medula espinal. O mecanismo do traumatismo pode produzir os ferimentos da contusão à medula espinal, como confirmado pela histologia, pelo MRI, e pelo exame neurológico. Finalmente, a medula espinhal se regenera da lesão. A etapa crítica do protocolo é remover os processos espinhoso sem causar dano à medula espinal. Esta etapa requer treinamento para garantir um procedimento seguro. Além disso, o fechamento da ferida é altamente dependente de não infestar danos desnecessários à pele durante a incisão. O protocolo foi realizado em estudo randomizado de 12 animais.

O objetivo do protocolo é produzir uma SCI que irá paralisar as funções motoras e sensoriais caudais à lesão. Porque o Axolotl é regeneração-competente restaura a função dentro das semanas, permitindo que os investigadores estudem a regeneração do CNS durante um intervalo de tempo curto.
A anestesia foi fornecida para 45 min a todos os animais, e nenhum episódio de recuperação pré-termo foi experimentado. Todos os animais recuperados dentro de uma hora e não mostraram sinais de dano da anestes...

Este manuscrito apresenta protocolos para infestar cirùrgica ferimentos de medula espinal controlados e afiados a um Axolotl regenerativo (mexicanum de Ambystoma).

Ferimento da medula espinal da contusão através de um Laminectomy Microsurgical no Axolotl regenerative

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

Este protocolo é o primeiro a introduzir uma lesão padronizada do tipo contusão na pesquisa de regeneração da medula espinhal axolotl. A principal vantagem dessa técnica é que ela imita o trauma visto na clínica cotidiana, aumentando a probabilidade de que um achado futuro seja capaz de ser traduzido. O dispositivo de lesão por contusão pode ser utilizado em qualquer outro pequeno modelo animal de lesão medular.A técnica cirúrgica é difícil, especialmente a laminectomia. Portanto, é aconselhável treinar o procedimento em um grande número de animais ex vivo antes de progredir para a cirurgia in vivo. Para começar, configure uma mesa cirúrgica colocando uma placa de Petri padrão sob um microscópio estéreo, em cima de um pano têxtil cirúrgico.Coloque o axlotl anestesiado na posição propensa na placa de Petri, e enrole-o em toalhas de papel para que a cauda seja exposta. Identifique os membros traseiros e use um par de micro tesouras para fazer a primeira incisão apenas caudal para eles. Faça a incisão vertical da quilha até que a proeminência óssea dos processos espinhosos seja sentida.Estenda o corte lateralmente, de modo que a incisão atravessa toda a largura da cauda, e agarra os processos espinhosos com fórceps para garantir a profundidade adequada. Em seguida, estenda a incisão vertical um milímetro abaixo do processo espinhoso em ambos os lados. Coloque o animal de um lado, e partindo do ponto ventral da incisão vertical, faça uma incisão horizontal de aproximadamente 15 milímetros para animais com 10 a 20 gramas de peso.Use a tesoura para dissecar imediatamente através da incisão horizontal até que a coluna vertebral seja sentida na linha média. Em seguida, vire o animal para o outro lado e repita o processo. Depois de dissecar no plano medial profundo de ambos os lados, disseco através da linha média para conectar as duas incisões horizontais.Em seguida, mova o pedaço livre de cauda e quilha para um lado para expor os processos espinhosos. Coloque o animal na posição propensa com a cabeça voltada para o lado nondominante do cirurgião, e use um par de fórceps para agarrar os processos espinhosos, apenas caudal para os membros traseiros. Aplique um elevador suave para cima e em direção à cabeça do animal.Coloque as lâminas de um par de micro tesouras horizontais ao redor do processo e corte-a suavemente, expondo a medula espinhal. Segure o processo giranso caudal ao que acabou de ser removido, e repita o processo. É imperativo que você mantenha um elevador constante no processo espinhoso para garantir que ele não inflija danos à medula espinhal quando removido.Se a área exposta não for larga o suficiente, use dois pares de fórceps para agarrar o laminado em ambos os lados da medula espinhal e torcê-los lateralmente com um movimento suave. Ao remover o processo spinous, pode ser necessário fazer isso em várias etapas. Portanto, expor a medula espinhal pode levar vários minutos.Para introduzir uma lesão tipo contusão, use uma placa de Petri para transferir o animal para a unidade de trauma e brilhar uma lanterna na medula espinhal. Em seguida, coloque o cilindro da unidade de trauma de contusão acima da medula espinhal exposta usando os micro ajustadores, e baixe o cilindro até que esteja nivelado com o laminado. Coloque a haste caindo no ímã eletro e coloque o cilindro de ajuste de altura de queda desejado na unidade de trauma.Em seguida, coloque a haste caindo no cilindro, desligue o eletroímã para soltar a haste na medula espinhal exposta e use o parafuso de ajuste de altura para levantar a haste de volta. Se introduzir uma lesão aguda, corte a medula espinhal em um corte vertical perfeito, em seguida, repita os cortes de dois milímetros para o lado caudal do corpo. Sinta as lâminas da tesoura raspando ao longo da parte ventral do canal espinhal para garantir que os cortes estejam completos, e levante o pedaço da medula espinhal do canal.Para fechar a ferida cirúrgica, coloque suturas de nylon de 10 pontos O da parte mais caudal da incisão horizontal fechando as feridas em uma camada e trabalhando em direção à parte vertical da incisão. Quando um ângulo é atingido, gire a placa de Petri e sutura a outra incisão horizontal, em seguida, coloque suturas nas incisões verticais. Antes de encerrar a anestesia, use um ultrassom de alta frequência para adquirir imagens da lesão.Alinhe a ponta do transdutor com o eixo de comprimento do animal e submerse-a na solução de benzocaína até que esteja apenas alguns milímetros acima da quilha atrás dos membros traseiros do animal. Identifique o local do ferimento e adquira imagens de acordo com as instruções do manuscrito. Quando terminar, devolva o axolotl à solução livre de anestésicos submergindo a placa de Petri em cinco centímetros de água doce profunda e deixando o animal deslizar.As lesões da medula espinhal criadas usando este protocolo foram validadas usando hematoxilina e manchas de eosina em axolotes feridos e sham. Para confirmar a regeneração, seções histológicas foram preparadas nove semanas após a lesão. As imagens mostraram uma conexão medular restabelecida nos animais feridos.Lesões e regeneração também somos seguidos pelo exame da função neurológica. A reação do animal à estimulação da cauda foi pontuada com escores mais elevados indicando funções sensoriais táteis e nociceptivas mais elevadas. Entre os animais feridos, houve perda da função neurológica três semanas após a lesão, e uma restauração gradual dentro de nove semanas.A lesão medular também foi visualizada utilizando imagens gráficas ultrassônicas, o que permitiu a visualização da artéria dorsal como um marcador de integridade do vaso. Os exames de ressonância magnética foram realizados imediatamente após a lesão e aos três, seis e nove semanas. Esses exames foram capazes de visualizar edema e restauração da integridade da medula espinhal.Os exames imediatamente após lesões, eram propensos a ruídos. A cirurgia paciente e meticulosa abrirá caminho para um resultado bem sucedido após laminectomia sem danos prematuros à medula espinhal. Após esse procedimento, diversos métodos in vivo podem ser aplicados, como imagens e técnicas eletrofisiológicas.

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Research

JoVE Journal

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