Name: Modelo de bexiga de urina de urina descentralizada (Ex Vivo) com o músculo destrusor removido para acesso direto ao suburotelio durante o enchimento da bexiga (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a usar o modelo de bexiga ex vivo sem músculo destrusor para estudar mecanismos de sinalização entre urotélio e suburotélio durante o enchimento. Este método permite analisar mediadores disponíveis na lâmina própria.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Grant DK41315.

Todos os procedimentos envolvendo animais descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e o Institutional Animal Use and Care Committee da Universidade de Nevada.
NOTA:O modelo aqui apresentado consiste na remoção do músculo detrusor, enquanto o urotelio e SubU/LP permanecem intactos(Figura 1B)para permitir aos investigadores o acesso direto ao SubU/LP no decorrer do enchimento da bexiga.
1. Dissecação da Preparação da Bexiga Livre de Detrusor
<ol><li>Coloque a bexiga isolada em um prato de dissecação cheio de frio (10 °C) e oxigenado com 5% co2/95 % O2 Krebs bicarbonato solução (KBS) com a seguinte composição (mM): 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2,23.8 NaHCO3,1.2 KH2PO4,11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.</li>
	<li>Pine uma pequena parte da cúpula da bexiga isolada para um prato de dissecação coberto de Sylgard preenchido com KBS. Certifique-se de que o pino passa por um pedaço da serosa ou a borda mais externa do músculo detrusor longe da borda mais interna do músculo que enfrenta o SubU / LP.</li>
	<li>Usando um microscópio, identifique a uretra e os ureteres e fixe cada um deles à parte inferior do prato de dissecação.</li>
	<li>Retire o excesso de tecidos adiposos e conjuntivos para que todo o corpo principal da bexiga, a uretra e ambos os ureteres sejam exibidos.</li>
	<li>Amarre os ureteres com suturas de nylon 6-0. Em seguida, fixar as extremidades abertas de ureters para o fundo do prato de dissecação para garantir a preparação.</li>
	<li>Usando fórceps de ponta fina, puxe suavemente um pedaço da serosa no canto entre o ureter e o corpo da bexiga.</li>
	<li>Ajuste a luz do microscópio para aumentar a transparência e distinguir a margem da submucosa o músculo detrusor.</li>
	<li>Comece a cortar(não descascar!) a parede da bexiga com tesoura de ponta fina ao longo da superfície interna da camada muscular detrusor, enquanto suavemente puxando o segmento de corte longe da preparação. Em todos os momentos, garantir que a borda lateral da mucosa pode ser visto e evitar tocá-lo.</li>
	<li>Retire o músculo detrusor inteiramente, virando o prato de dissecação para que a posição da preparação é confortável para continuar dissecando o músculo detrusor.</li>
	<li>Deixe um pequeno pedaço de músculo detrusor no topo da cúpula da bexiga para garantir a capacidade de imobilizar a preparação durante as etapas restantes do protocolo.</li>
	<li>Faça um laço duplo de 6-0 fio de nylon, colocá-lo em torno do pescoço da preparação da bexiga, e deixar o laço solto.</li>
	<li>Adicione um segundo laço duplo de 6-0 fio de seda, colocá-lo em torno do pescoço da preparação da bexiga, e deixar o laço perder. Ter duas suturas impede vazamentos em torno das suturas.</li>
	<li>Corte cerca de 2 cm de tubos de 20 PE (cateter), incendiar a ponta, movendo-se lentamente a ponta perto de uma chama.</li>
	<li>Encha o cateter com KBS oxigenado quente (37°C).</li>
	<li>Insira o cateter no orifício da uretra da bexiga e empurre suavemente o cateter até que a ponta do cateter atinja aproximadamente o meio da bexiga.</li>
	<li>Amarre a sutura ao redor do cateter e o tecido circundante do pescoço da bexiga.</li>
	<li>Lentamente encher a bexiga com cerca de 50-100 μL de quente (37 °C) KBS oxigenado, levantá-lo brevemente (<10 s) acima da superfície do KBS, e monitorar vazamentos nas suturas e corpo da bexiga.</li>
	<li>Se nenhum vazamento for observado, a preparação está pronta para o experimento. Se um vazamento em torno da sutura é observada, retire a sutura e substituí-lo. Se um vazamento de um buraco no corpo da bexiga é notado, descartar a preparação.</li>
</ol>2. Enchimento da preparação da bexiga desnudada
<ol><li>Perfuse KBS (37 °C) em uma câmara de 3 mL de um prato de órgão regado de água (37 °C) com um fundo Sylgard.</li>
	<li>Ajuste as linhas de oxigênio e sucção.</li>
	<li>Coloque a preparação da bexiga desnudada na câmara.</li>
	<li>Fixe o cateter para o lado da câmara para que a preparação não flutue acima da superfície da solução de perfusão.</li>
	<li>Ligue o cateter da bexiga a uma tubulação PE20 mais longa (linha de infusão) conectada à torneira de três vias usando o mesmo tamanho.</li>
	<li>Certifique-se de que as linhas entre a bomba de infusão, o transdutor de pressão e a bexiga estão abertas.</li>
	<li>Encha a seringa de infusão com KBS fresco, quente (37 °C) e oxigenado.</li>
	<li>Ajuste os parâmetros da bomba: tipo/volume de seringa (ou seja, 1 mL), operação (ou seja, Infusível), fluxo (ou seja, constante) e taxa de fluxo (ou seja, 15 μL/min).</li>
	<li>Pressione o botão Iniciar na bomba de seringa para encher a bexiga.</li>
	<li>Monitore o volume de enchimento e a pressão intravesa durante o enchimento da bexiga.</li>
</ol>3. Detecção de mediadores no aspecto SubU/LP da preparação da bexiga desnudada
<ol><li>Colete alíquotas da solução de banho em tubos de microcentrífuga sem gelo ou inserções de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).</li>
	<li>Prepare e processe as amostras de acordo com a aplicação de detecção apropriada. No caso da detecção da disponibilidade de purina, processe as amostras por HPLC com detecção de fluorescência13,18.</li>
</ol>

<ol><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).</li>
<li>Fry, C. H., Vahabi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Mucosa+in+Normal+and+Abnormal+Bladder+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).</li>
<li>Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors%2C+channels%2C+and+signalling+in+the+urothelial+sensory+system+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewes+Urology%22%5BJournal%5D)">Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder.</a> Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).</li>
<li>Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+is+released+from+rabbit+urinary+bladder+epithelial+cells+by+hydrostatic+pressure+changes--a+possible+sensory+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism?</a> Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).</li>
<li>Wang, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+and+purinergic+receptor-dependent+membrane+traffic+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+for+Piezo1+in+stretch-evoked+Ca%282%29%28%2B%29+influx+and+ATP+release+in+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPV4+cation+channel+mediates+stretch-evoked+Ca2%2B+influx+and+ATP+release+in+primary+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).</li>
<li>McLatchie, L. M., Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+release+from+freshly+isolated+guinea-pig+bladder+urothelial+cells%3A+a+quantification+and+study+of+the+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved.</a> BJU International. 115, 987-993 (2015).</li>
<li>Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic-+and+capsaicin-evoked+nitric+oxide+release+from+urothelium+and+afferent+nerves+in+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).</li>
<li>Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO%3A+effect+on+bladder+afferent+neurons+and+nitric+oxide+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release.</a> Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor+expression+suggests+a+sensory+role+for+urinary+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-adrenoceptor+agonists+stimulate+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+rat+urinary+bladder+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+cholinergic+system+in+human+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium.</a> Urology. 67, 425-430 (2006).</li>
<li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).</li>
<li>Collins, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnabotulinumtoxinA+significantly+attenuates+bladder+afferent+nerve+firing+and+inhibits+ATP+release+from+the+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium.</a> BJU International. 112, 1018-1026 (2013).</li>
<li>Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+afferent+pathways+and+urothelial+function+in+the+male+mouse+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder.</a> Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).</li>
<li>Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+purine+release+during+filling+of+murine+and+primate+bladders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).</li>
<li>Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signalling+underlies+transforming+growth+factor-beta-mediated+bladder+afferent+nerve+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability.</a> Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).</li>
</ol>

Partes deste trabalho foram publicadas anteriormente no Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). A permissão foi concedida pela Wiley and Sons, Inc. para o uso de materiais desta publicação. Os autores não têm conflitos financeiros ou outros para divulgar.

A bexiga tem duas funções: armazenamento e voiding da urina. O funcionamento normal dessas funções requer sensoriamento mecânico adequado de volume e pressão intralumínio e transdução de sinais através de células na parede da bexiga para regular a excitabilidade muscular detrusora. Acredita-se que a mucosa da bexiga (urotelio) regule a excitabilidade da bexiga, liberando uma variedade de moléculas de sinalização no SubU/LP que afetam vários tipos de células na parede da bexiga. Atualmente, a maioria das tentativas de car...

O objetivo deste modelo é permitir o acesso direto ao lado submucosato da mucosa da bexiga durante diferentes fases do enchimento da bexiga.
A bexiga deve abster-se de contração prematura durante o enchimento e vazio quando o volume crítico e a pressão são alcançados. Continência anormal ou voiding da urina são freqüentemente associados com excitabilidade anormal do músculo liso detrusor (DSM) no curso do enchimento da bexiga. Excitabilidade do DSM é determinada por fatores intrínsecos às células musculares lisas e por influências geradas por diferentes tipos de células dentro da parede da bexiga. A parede da bexiga urinária consiste em urotelio (mucosa), suburotelio (SubU)/lamina propria (LP), músculo suave detrusor (DSM) e serosa (Figura 1A). O urotelio consiste em células guarda-chuva (ou seja, a camada mais externa do urotelio), células intermediárias e células basais (ou seja, a camada mais interna do urotelio). Vários tipos de células, incluindo células intersticiais, fibroblastos, terminais nervosos aferentes, pequenos vasos sanguíneos e células imunes residem no SubU/LP. É amplamente assumido que o urotelio da bexiga é um órgão sensorial que inicia mictura e continência reflexa, liberando mediadores na submucosa que afetam as células do SubU/ LP e do DSM1,2,3. Para a maior parte, tais pressupostos são baseados em estudos que demonstraram liberação de mediadores: a partir de pedaços de mucosa expostos a mudanças na pressão hidrostática4,5; de células uroteliais cultivadas expostas ao trecho6,7,célulainduzida pela hipotonicidade inchando7 ou forças de arrasto8; de tiras de parede da bexiga isoladas sobre receptor ou ativação nervosa9,10,11,12,13,14; e na bexiga lúmen no final da bexiga enchimento15,16,17,18,19. Embora tais estudos foram fundamentais para demonstrar a liberação de mediadores sobre a estimulação mecânica de segmentos da parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas, eles precisam ser apoiados por evidências diretas para a liberação de mediadores na submucosa que é eliciada por estímulos fisiológicos que reproduzem o enchimento da bexiga. Esta é uma tarefa desafiadora, dado que o SubU / LP está localizado no fundo da parede da bexiga dificultando o acesso direto à vizinhança de SubU / LP durante o enchimento da bexiga.
Aqui, ilustramos um modelo descentralizado (ex vivo) da bexiga da urina com o músculo detrusor removido13 que foi desenvolvido para facilitar estudos nos mecanismos locais do mechanotransduction que participam na sinalização entre o urothelium da bexiga, dSM e outros tipos da pilha na parede da bexiga. Esta abordagem é superior ao uso de folhas de parede da bexiga plana, tiras de parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas porque permite medições diretas nas proximidades de SubU/LP de mediadores derivados de urotelium que são liberados ou formados em resposta a pressões fisiológicas e volumes na bexiga e evita possíveis mudanças fenotípicas na cultura celular. Ele pode ser usado para medir a disponibilidade, liberação, metabolismo e transporte transurotelial de mediadores em SubU/LP em diferentes estágios de enchimento da bexiga (Figura 1B). A preparação também pode ser usada para examinar a sinalização urotelial e mechanotransdução em modelos de síndromes da bexiga hiperativa e subativa.

<table><tbody><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Pinos de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P284</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>SCHOTT ACEI</td><td></td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus SZX7</td><td></td><td>Flexível para usar qualquer escopo</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S671</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Agulhas 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Banho de órgão</td><td>Feito sob medida</td><td></td><td>Fonte flexível; Nós o fizemos a partir de Radnoti prato de dissecação</td></tr><tr><td>PE-20 tubulação</td><td>Intramedic</td><td>427405</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Transdutor de pressão</td><td>AD instrumento</td><td></td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>S & T Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Software pressão-volume</td><td>AD Instruments</td><td>Power lab</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Nylon, 6-0</td><td>AD cirúrgico</td><td>S-N618R13</td><td>Source flexível</td></tr><tr><td>Sutura Seda, 6-0</td><td>Deknatel via Braintree Scientific, Inc.</td><td>07J1500190</td><td>Fonte seringas flexíveis</td></tr><tr><td>1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>Fonte flexível</td></tr><tr><td>Circulador de água</td><td>Baxter</td><td>K-MOD 100</td><td>Fonte flexível</td></tr></tbody></table>

modelo de bexiga de urina de urina descentralizada (ex vivo) com o músculo destrusor removido para acesso direto ao suburotelio durante o enchimento da bexiga

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

Estudos anteriores estabeleceram a liberação de substâncias químicas de folhas de mucosa de bexiga plana afixadas nas câmaras de Ussing e expostas a mudanças na pressão hidrostática ou alongamento mecânico e de células urotelia cultivadas após alterações de pressão hidrostática, alongamento, inchaço celular ou forças de arrasto, e em lúmen da bexiga no final do enchimento. Tais achados levaram à suposição de que esses mediadores também são liberados em suburotelio (SubU)/lamina propria (LP) durante o enchimento da bexiga, onde afetam as células profundas na parede da bexiga para, em última análise, regular a excitabilidade da bexiga. Há pelo menos duas limitações óbvias em tais estudos: 1) nenhuma dessas abordagens fornece informações diretas sobre a presença de mediadores em SubU/LP, e 2) os estímulos utilizados não são fisiológicos e não recapitulam o preenchimento autêntico da bexiga. Aqui, discutimos um procedimento que permite o acesso direto à superfície suburotelial da mucosa da bexiga no decorrer do enchimento da bexiga. A preparação livre de intrusão de urina que criamos se assemelha ao enchimento da bexiga intacta e permite que estudos de volume de pressão sejam realizados na bexiga na ausência de sinalização confusa de reflexos espinhais e músculos suaves destruor. Usando o modelo de bexiga livre de detrusor, demonstramos recentemente que medições intravesivas de mediadores não podem ser usadas como um proxy para o que foi lançado ou presente no SubU/LP durante o enchimento da bexiga. O modelo permite o exame de moléculas de sinalização derivadas de urotelium que são liberadas, geradas pelo metabolismo e/ou transportadas para o SubU/LP durante o recheio da bexiga para transmitir informações aos neurônios e músculos lisos da bexiga e regular sua excitabilidade durante continência e micturição.

A parede da preparação da bexiga livre de detritos e urina está intacta e contém todas as camadas, exceto o DSM e a serosa. Estudos de prova de princípio demonstraram que a parede da bexiga livre de DSM inclui urotelium e SubU/LP, enquanto a tunica muscular e a serosa estão ausentes (Figura 2)13.
O enchimento da bexiga livre de detrusor aproxima-se do enchimento norm...

O modelo de bexiga livre de detrusor permite o acesso direto ao suburotelio para estudar os mecanismos locais de regulação da disponibilidade de mediadores biologicamente ativos na propria suburotelio/laminado durante o armazenamento e a anulação da urina. A preparação assemelha-se pròxima ao enchimento de uma bexiga intata e permite que os estudos do pressão-volume sejam executados sem influências sistemáticas.

Modelo de bexiga de urina de urina descentralizada (Ex Vivo) com o músculo destrusor removido para acesso direto ao suburotelio durante o enchimento da bexiga

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in ...

Nosso modelo de bexiga com um músculo detrusor removido é uma nova abordagem experimental para estudar simultaneamente a disponibilidade de mediadores uroteliais na propria lamia e lúmen da bexiga durante o preenchimento da bexiga. Este modelo pode fornecer novas percepções sobre os mecanismos de sinalização entre urotélio, suburotélio e músculo detrusor que regulam a excitabilidade da bexiga durante o preenchimento. Comece colocando a amostra intacta da bexiga murina em um prato de dissecação sob um microscópio de dissecção contendo 10 graus celsius de KBS oxigenados e limpando os tecidos conjuntivos e gordos ao redor da bexiga.Fixe uma pequena porção da cúpula da bexiga isolada por todo o caminho através da borda mais externa do músculo detrusor longe da borda mais interna do músculo que enfrenta o suburotélio lamia propria para um prato de dissecação coberto sylgard cheio de KBS, e fixar os ureteres e pescoço da bexiga para exibir a preparação intacta da bexiga. Usando fórceps finos, puxe suavemente um pedaço da serosa no canto entre o ureter e o corpo da bexiga e ajuste a luz do microscópio para aumentar a transparência e distinguir a margem da submucosa sob o músculo detrusor. Para evitar perfurar a parede de preparação, certifique-se de cortar o músculo detrusor apenas enquanto a borda lateral da mucosa da bexiga é claramente visível.Usando uma tesoura de ponta fina, comece a cortar a parede da bexiga ao longo da superfície interna da camada muscular detrusor enquanto puxa suavemente o segmento de corte para longe da preparação, tomando cuidado para que a borda lateral da mucosa possa ser observada evitando tocar na borda do tecido. Deixe um pequeno pedaço do músculo detrusor em cima da cúpula da bexiga para permitir que a preparação seja imobilizada durante as etapas restantes do protocolo e encha uma peça de dois centímetros de tubos de polietileno com KBS oxigenados de 37 graus celsius. Depois de inserir o cateter no orifício da uretra da bexiga, empurre suavemente o cateter até que a ponta do cateter atinja o meio aproximado da bexiga.Em seguida, fixe o cateter no tecido circundante do pescoço da bexiga com uma sutura de nylon de 6,0 laços duplos. Depois de verificar se há vazamentos no tecido, coloque a preparação da bexiga desnudada em uma câmara de três mililitros de 37 graus celsius com um fundo sylgard e fixe o cateter ao lado da câmara para que a preparação não flutue acima da superfície da solução de perfusão. Conecte o cateter da bexiga a um pedaço de tubo de polietileno 20 conectado a uma torneira de três vias e uma seringa de infusão preenchida com KBS oxigenados de 37 graus celsius e inicie a bomba de infusão para encher a bexiga com KBS tomando cuidado para monitorar o volume de enchimento na pressão intravesical durante o enchimento.Para detectar mediadores dentro do aspecto suburotélio lamina propria da preparação, colete alíquotas da solução de banho em vários pontos de tempo experimentais apropriados e processe as amostras de acordo com a análise planejada a jusante. A parede de preparação da bexiga desnudada contém o urotélio e o suburotélio, mas não o músculo liso destrusor. As relações de volume de pressão são notavelmente semelhantes nos preparativos intactos e desnudos.A adequação do modelo para medir mediadores derivados do urotélio que são liberados no lado suburothelium lamina propria durante o enchimento pode ser testada medindo a liberação de mediadores de purina na solução que banha a suburothelium lamina propria da preparação desnudada. Como demonstrado, quantidades insignificantes de purinas podem ser detectadas em um banho contendo uma preparação isolada da bexiga com um músculo detrusor intacto;enquanto as quantidades dessas purinas são significativamente maiores em amostras coletadas do banho contendo uma preparação desnudada da bexiga. Notavelmente, a distribuição de purinas e metabólitos em amostras coletadas do lúmen e da suburothelium lamina propria no final do enchimento difere significativamente.A adição do ATP de Atheno, um análogo altamente fluorescente da ATP, ao lado suburotelial da preparação sem detrusor resulta em uma diminuição no ATP de Atenas e um aumento nos produtos da ATP de Atheno, Atheno ADP, Atheno AMP e Atheno ADO. Da mesma forma, a adição do ATP de Atheno à preparação do lúmen resulta em uma diminuição no ATP de Atheno e um aumento no Atheno ADP, Atheno AMP e Atheno ADO no lúmen. Além disso, a adição do ATP de Atheno ao lado suburothelium lamina propria da preparação desnudada resulta no aparecimento de ATHENO AMP e Atheno ADO dentro do lúmen.Da mesma forma, adicionar ATP de Atenas ao lúmen resulta no aparecimento de Atheno AMP e Atheno ADO na suburothelium lamina propria. Após este procedimento, a disponibilidade de mediadores excitatórios e inibitórios pode ser medida na álmina propria e no lúmen da bexiga em diferentes estágios de enchimento da bexiga. O transporte transuretral bilateral de mediadores e o metabolismo dos mediadores também podem ser estudados utilizando esse modelo.O uso deste novo modelo de bexiga resultará em uma nova compreensão da sinalização mecanosensível local entre o urotélio e o músculo liso destrusor que controlam a excitabilidade da bexiga na saúde e na doença.

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