Name: Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a avaliar respostas farmacológicas em culturas de organoides prostáticos usando o método de plaqueamento em domo. Este protocolo permite modelar resistência a medicamentos e estudar como o genótipo influencia as respostas terapêuticas.

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K.P. é apoiado pelo NIH 1F32CA236126-01. A C.L.S. é apoiada pela HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; e Starr Cancer Consortium. W.R.K. é apoiado pela Dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 e pela Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.

Todo o trabalho descrito neste protocolo foi executado com organóides previamente estabelecidos do murine e organoids paciente-derivados. Todo o trabalho animal foi realizado em conformidade com as diretrizes do Centro de Recursos Animais de Pesquisa do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Todos os tecidos derivados do paciente foram coletados em conformidade com as regras e regulamentos do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).
1. Preparação média e tampão
<ol><li>Descongele a matriz da membrana do porão (por exemplo, Matrigel) a 4 °C durante a noite antes de iniciar o experimento. Mantê-lo no gelo durante o uso.</li>
	<li>Coloque as placas de cultura a 37 °C por 24 h antes dos experimentos. Isso ajudará a cúpula da matriz de membrana do porão (a partir daí referida como cúpula matriz) a polimerizar. Os organóides de revestimento são descritos na etapa 2.1.2.</li>
	<li>Prepare o meio organóide de acordo com o protocolo estabelecido5.</li>
	<li>Prepare o meio organóide sem a adição do fator de crescimento epidérmico (EGF; consulte tabela de materiais para componentes). EGF suprime a saída transcricional AR e confere resistência anti-andrógeno5.</li>
	<li>Prepare o meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) com o soro bovino fetal de 10% (FBS). NOTA: Esta mídia é usada para inibir a digestão enzimática com substituição de trippsina nas seções 2-4.</li>
	<li>Prepare soluções de medicamentos de acordo com o protocolo do fabricante. Para enzalutamide/mdv3100 (posteriormente referido como anti-andrógeno de segunda geração), prepare uma solução de estoque de 100 μM em dimetil sulfoxide (DMSO). O estoque pode ser armazenado a -20 °C por até 6 meses e não precisa ser feito fresco.</li>
</ol>2. Isolamento, digestão enzimática e estabelecimento de organóides
<ol><li>Isolar organóides da próstata do rato ou tecido humano de acordo com os protocolos previamente estabelecidos5,7. Uma breve descrição é fornecida abaixo.<ol>
<li>Mince e enzimaticamente digerir tecido da próstata para produzir uma única suspensão celular. Neste experimento, 1 mL de 5 mg/mL collagenase tipo II em ADMEM/F12 foi utilizado para a digestão de 50 mg de tecido da próstata.</li>
		<li>Coletar células por centrífuga a 300 x g por 5 min, contar as células, resuspendê-las na matriz da membrana do porão e placa na densidade apropriada5,7 nas cúpulas matricia em placas de cultura organóide pré-aquecida (chapeamento método é mostrado na Figura 1A).</li>
		<li>Permita que as cúpulas se solidiem e adicionem mídia nos topos das cúpulas para que elas estejam completamente cobertas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescer organóides para a quantidade desejada para aplicações a jusante. O número celular pode ser determinado por métodos de contagem padrão. Veja a seção específica do protocolo para obter detalhes adicionais sobre densidade.</li>
	<li>Usando uma pipeta P1000, elaborar o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper. Quando a matriz da membrana do porão é interrompida inteiramente, transfira a suspensão a um tubo cónico de 15 mL. Não coloque mais de 10 cúpulas por único tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Desenhe o supernatant e lave a pelota da pilha com 5 mL de PBS. Centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Resumo para 5-10 min com agitação a 37 °C. Adicione um volume igual de meio organóide + 10% FBS para inibir a substituição de tripsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Desenhe o supernatant e resuspenda em 1 mL de PBS.</li>
	<li>Filtrar a suspensão com um filtro de 40 μm para garantir uma única suspensão celular. Quantifique o número da célula usando um hemocytometer ou dispositivo de contagem equivalente. NOTA: Se a obtenção de células únicas viáveis é difícil, use a classificação do fluxo para obter uma solução de célula única.</li>
</ol>3. Avaliação da capacidade de formação organóide
NOTA: Para determinar a porcentagem de células que podem gerar um organóide, um ensaio de semeadura pode ser realizado como um proxy para o potencial de tronco/progenitor. A capacidade de formação organóide também é importante para definir um número de semeadura celular para os ensaios de viabilidade.
<ol><li>Diluir a suspensão celular obtida na etapa 2,7 a 100 células por 10 μL da suspensão usando o meio organóide contendo 10 μM Rho kinase inibidor Y-27632.</li>
	<li>Transfira 1.100 células (110 μL de suspensão) para um novo tubo cônico.</li>
	<li>Adicione 285 μL de matriz de membrana do porão e resuspenda as células. Isso resultará em uma concentração de matriz de ~70%. NOTA: Diluição da matriz de membrana do porão durante a semeanação reduz muito a variação no tamanho da cúpula, causada pela viscosidade da matriz proteica.</li>
	<li>Células de sementes em 35 μL de cúpulas matricias em uma placa de 24 poços pré-aquecida, resultando em 200 células/poço. Placa 3-5 replica por amostra (também ver o método de revestimento na Figura 1A e passo 2.1.2).</li>
	<li>Para garantir que as células permaneçam dentro da cúpula da matriz, vire a placa e coloque-a em uma incubadora celular para solidificar a matriz da membrana do porão.</li>
	<li>Após 10 min, retire a placa da incubadora e adicione o meio contendo o inibidor da quinase Rho.</li>
	<li>Refresque o meio a cada 2 dias. Após 7 dias, quantifique o número de organóides. Mantenha o inibidor da quinase Rho na mídia durante todo o experimento.</li>
	<li>Conte o número de organóides estabelecidos por cúpula e calcule a porcentagem de organóides formados a partir do número total de células banhadas (200 células). NOTA: As proporções de estabelecimento organóide variam de 3% a 60%, dependendo do tipo celular e do genótipo.</li>
</ol>4. Determinando respostas farmacológicas de organóides
<ol><li>Continuando a partir do passo 2.7, sementes 1.000-10.000 células em uma cúpula matriz. Use a eficiência de formação organóide e velocidade de crescimento como um proxy para determinar o número final da célula. NOTA: Os números de celular recomendados são fornecidos na Tabela 1. Use três a cinco replica por condição por análise. Use uma concentração final de 70% de matriz de membrana do porão para reduzir os erros de tubulação induzidos pela viscosidade.</li>
	<li>Semente 35 μL de cúpulas matricezem em uma placa de 24 poços e deixe as cúpulas solidificarem como feito na seção 3 (também veja o método de revestimento na Figura 1A e passo 2.1.2). Adicione o meio contendo o inibidor de quinase Rho e a droga de escolha. Este método pode ser aplicado a todas as drogas, mas neste protocolo, um anti-andrógeno de segunda geração é usado em 10 μM por exemplo. Para determinar a concentração inibidora máxima (IC50), realize um log10 incremental e, como controle, use o veículo no qual a droga foi dissolvida.</li>
	<li>Refresque o meio a cada dois ou três dias e analise os organóides no dia 7 para determinar a resposta farmacológica da droga. Os pontos de tempo podem variar entre a escolha do experimento e da droga. NOTA: Organóides não precisam ser trypsinizados para realizar esses ensaios.</li>
	<li>Para manter os organóides intactos, usando uma pipeta P1000, elabore o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz da membrana do porão.</li>
	<li>Quando a matriz da membrana do porão é interrompida inteiramente, transfira a suspensão a um tubo cónico de 15 mL. Não transfira mais de 10 cúpulas matricadas por tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g por 5 min. Tire o supernatant e lave com 5 mL de PBS.</li>
	<li>Resuspenda organóides em 1 mL de PBS e interrompa os organóides usando trituração e uma pipeta pasteur de vidro.</li>
	<li>Quantificar o número de fragmentos organóides. Semente 5 replica contendo 100 fragmentos organóides, conforme descrito no passo 2.1.2.</li>
	<li>Realize o ensaio de viabilidade celular descrito abaixo na seção 7.</li>
</ol>5. Isolamento de RNA de organóides
NOTA: Os métodos baseados em colunas comercialmente disponíveis produzem boa quantidade e qualidade de RNA. Para garantir rna de boa quantidade, use um mínimo de uma cúpula por amostra; no entanto, o uso de três cúpulas é recomendado, que pode ser semeado em um único poço de uma placa de 12 poços.
<ol><li>Adicionar ß-mercaptoetanol (1%) para o tampão de linéia glutationa no kit de isolamento RNA.</li>
	<li>Retire o meio das cúpulas de membrana do porão contendo organóides e adicione 750 μL deste buffer. Pipeta para cima e para baixo usando uma pipeta P1000. Verifique se toda a matriz de membrana do porão foi dissolvida.</li>
	<li>Adicione 750 μL de 70% de etanol e misture por pipetting. Posteriormente transferir 700 μL da mistura para a coluna, centrífuga em 12.000 x g por 1 min, e repita com o restante do lysate.</li>
	<li>Executar laves e tratamento de DNase na coluna de acordo com as instruções do fabricante. Elute RNA em 30-50 μL de água livre de RNAse.</li>
	<li>Medir as concentrações usando um flódromo em OD = 260 nm e 280 nm e armazenar a -80 °C ou continuar com aplicações a jusante.</li>
</ol>6. Isolamento proteico de organóides
NOTA: Para o isolamento de proteínas, prepare o amortecedor RIPA padrão contendo inibidores de fósforoe protease(Mesa de Materiais). Usando pelo menos três cúpulas é recomendada, que pode ser semeada em um único 12 bem.
<ol><li>Usando uma pipeta P1000, elabore o meio da célula com as cúpulas de membrana do porão contendo organóides e pipetos para cima e para baixo para interromper a matriz da membrana do porão.</li>
	<li>Quando totalmente interrompido, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS gelado. Centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Dime por 5-10 min enquanto treme a 37 °C.</li>
	<li>Adicione um volume igual de meio organóide + FCS de 10% para inibir a substituição da trippsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min. NOTA: Pós-centrífugação, nenhuma matriz de membrana do porão deve ser visível na pelota.</li>
	<li>Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS gelado. Desenhe o supernatant e resuspenda a pelota da pilha em 300 μL do amortecedor da lyse usando um pipet de P1000, a seguir transfira a um tubo do microcentrífuga de 1.5 mL.</li>
	<li>Incubar no gelo por 10 min e, posteriormente, sonicate 2x para 30 s cada em água resfriada com uma temperatura de 4 °C. Coloque o tubo de volta no gelo e realizar quantificação de proteína usando métodos padrão.</li>
	<li>Desnaturar a proteína adicionando sulfato dodcyl de sódio (SDS) contendo tinuoso de carregamento e deixe ferver por 5 min a 95 °C. Armazenar lysates a -80 °C ou continuar com aplicações a jusante.</li>
</ol>7. Ensaio de viabilidade celular com organóides
NOTA: A viabilidade celular pode ser avaliada usando o kit de ensaio de viabilidade celular disponível comercialmente e um luminomômetro. Prepare buffers de acordo com as instruções do fabricante. Recomenda-se cinco réplicas por condição: uma réplica consistindo de uma cúpula de matriz de membrana de porão de 35 μL em um poço de uma placa de 24 poços.
<ol><li>Desenhe o meio da cultura organóide, tendo o cuidado de deixar as cúpulas matricia intactas.</li>
	<li>Adicione 65 μL de PBS e pipeta para cima e para baixo para interromper a cúpula matriz.</li>
	<li>Adicione 100 μL do buffer do kit de ensaio de viabilidade celular e resuspenda por pipetting.</li>
	<li>Incubar à temperatura ambiente (RT) para 10 min com agitação.</li>
	<li>Transfira 100 μL de mistura para uma placa não translúcida adequada para o lumimosômetro e execute a leitura de acordo com as instruções do fabricante para o kit de ensaio de viabilidade celular.</li>
</ol>8. Preparação de organóides para xenoenxerto
NOTA: Organóides também são passíveis de enxerto subcutâneo em ambos os animais imunocomprometidos, bem como, ratos isógênicos. Para garantir que os organóides injetados sejam in vivo, rotule organóides com um fluorofiforre constitutivamenteexpressor 5. Recomenda-se realizar um experimento piloto para enxertia usando 5 x 105 células para 2 x 106 células por injeção, com incrementos de 5 x 106 células, já que a eficiência do enxerto varia entre as linhas organóides.
<ol><li>Usando uma pipeta P1000, elabore o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz de membrana do porão. Quando totalmente interrompido, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min. NOTA: Não transfira mais de 10 cúpulas matrica por tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS. Centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Dime por 5-10 min enquanto treme a 37 °C.</li>
	<li>Adicione o volume igual de meio organóide + 10% FBS para inibir a substituição de tripsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Desenhe o supernatant e resuspenda em 1 mL de PBS. Filtrar a suspensão com um filtro de 40 μm para garantir uma única suspensão celular. Quantificar as células usando métodos padrão.</li>
	<li>Desça e resuspenda as células do inibidor pbs + rho para uma concentração de 2 x 106 células por 100 μL (ver Tabela 2 para concentrações celulares e número de células absoluta necessária para diferentes concentrações). Use um volume igual de matriz de membrana do porão para gerar uma suspensão 1:1. Coloque a suspensão no gelo.</li>
	<li>Injetar células de acordo com protocolos padrão e monitorar o crescimento xenoenxerto usando métodos padrão8.</li>
</ol>

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</ol>

A C.L.S atua no conselho de administração da Novartis; é co-fundador da ORIC Pharmaceuticals e coinventor da enzalutamida e apalutamida; é consultor científico da Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra e PMV; e é co-fundador da Seragon, comprada pela Genentech/Roche em 2014. W.R.K. é um coinventor e detentor de patentes da tecnologia organóide.

Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência antiandrógena e descobrir potenciais vulnerabilidades terapêuticas requer testes de respostas farmacológicas em sistemas modelo que imitem o câncer de próstata. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a análise confiável das respostas farmacológicas em organóides de próstata derivados e geneticamente modificados do paciente e a preparação dessas amostras organóides para aplicações a jusante.
Há dois passos críticos neste proto...

A resistência aos medicamentos é um dos principais problemas clínicos no tratamento do câncer. O tratamento metastático do câncer de próstata (PCa) é direcionado principalmente para o eixo de sinalização de andrógenos. Terapias anti-andrógenos de última geração (por exemplo, enzalutamida e abiraterona) mostraram grande sucesso clínico, mas praticamente todas as PCa eventualmente progridem em direção a um estado independente de andrógeno, ou câncer de próstata resistente à castração (CRPC).
Perfil genômico e transcriptômico recente do CRPC revelou que existem três mecanismos gerais de resistência no câncer de próstata: 1) ativando mutações, resultando na restauração do receptor andrógeno (AR) sinalização1; 2) ativação da sinalização de bypass, como exemplificado em um modelo pré-clínico para a resistência à terapia anti-andrógeno de última geração em que a ativação do receptor glicocorticoide (GR) pode compensar a perda de sinalização ar2; e 3) o processo recentemente identificado de plasticidade da linhagem, em que as células tumorais adquirem resistência ao alternar linhagens de um tipo de célula dependente do alvo da droga para outro tipo de célula que não depende disso (que, em PCa, é representado como AR-negativo e/ou doença neuroendócrina [NEPC])3,4. No entanto, os mecanismos moleculares que causam resistência aos medicamentos não são compreendidos. Além disso, a resistência antiandrógena adquirida pode levar a vulnerabilidades terapêuticas que podem ser exploradas. Portanto, é essencial avaliar as respostas de medicamentos em sistemas modelo que imitam fenótipos e genótipos de pacientes.
Organóides da próstata são culturas organotípicas cultivadas em uma matriz de proteína 3D com um meio definido. Importante, organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de tecido benigno e canceroso de urina ou origem humana, e eles mantêm características erofópicas e genotípicas encontradas in vivo5,6. É importante ressaltar que tanto as células sensíveis ao PCa e crpc antiandrógenas estão representadas no atual compêndio de organóides. Além disso, os organóides da próstata são facilmente manipulados geneticamente usando CRISPR/Cas9 e shRNA5. Assim, organóides da próstata são um sistema modelo adequado para testar respostas de medicamentos e elucidar mecanismos de resistência. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para realizar testes de drogas e analisar as respostas farmacológicas usando organóides da próstata.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Componente do meio organoide: Concentração final 200 nM</td></tr><tr><td>ADMEM/F12</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>12634028</td><td>Componente do meio organoide</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>17504-044</td><td>Componente do meio organoide</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células</td><td>Fisher</td><td>657185</td><td></td></tr><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073</td><td>Componente do meio organoide: Concentração final 1 nM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Componente do meio organoide: Concentração final 50 ng/ml para camundongo, 5 ng/nl para humano</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Componente do meio organoide específico humano: Concentração final 10 ng/ ml</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Componente de meio organoide específico humano: Concentração final 5 ng/ml</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>35050079</td><td>Componente de meio organoide</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FABRICADO INTERNAMENTE</td><td>N/A</td><td>Componente de meio organoide: Concentração final 10 mM</td></tr><tr><td>Matrigel (Fator de crescimento reduzido & Livre de vermelho de fenol)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td>Componente do meio organoide</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Componente do meio organoide: Concentração final 1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>Componente do meio organoide específico humano: Concentração final 10 mM</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>Peprotech ou células 293t transfectadas estáveis com construção Noggin (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-10C</td><td>Componente do meio organoide: Concentração final 10% do meio condicionado ou 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptavidina</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-109</td><td>Componente do meio organoide</td></tr><tr><td>Inibidores da fosfatase</td><td>Merck Millipore</td><td>524629</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandina E2</td><td>Tocris</td><td>3632464</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores da protease Merck</td><td>Millipore</td><td>539131</td><td></td></tr><tr><td>R-SPONDIN</td><td>Peprotech ou células 293t transfectadas estáveis com construção R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-38</td><td>Componente do meio organoide: Concentração final 10% de meio condicionado ou tampão RIPA de 500 ng/ml</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>RNA-easy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=152121-30-7&amp; interface=CAS%20No.& lang=pt-br& região = EUA & focus=product">152121-30-7</a></td><td>Componente do meio organoide específico humano: Concentração final 10 &mu; M</td></tr><tr><td>TryplE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>Componente médio organoide: Concentração final 10 &mu; O</td></tr></tbody></table>

culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Apresentado aqui é um protocolo para estudar farmacodinâmica, potencial de células-tronco e diferenciação de câncer em organóides epitelia da próstata. Organóides da próstata são culturas orrógenas e tridimensionais (3D) cultivadas em um meio definido que se assemelha ao epitélio prostático. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de modelos de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, tecido humano benigno e câncer de próstata avançado. Importante, os organóides derivados pacientes assemelham-se pròxima a tumores na genética e na biologia in vivo do tumor. Além disso, os organóides podem ser manipulados geneticamente usando sistemas CRISPR/Cas9 e shRNA. Essas genéticas controladas tornam a cultura organóide atraente como uma plataforma para testar rapidamente os efeitos dos genótipos e perfis mutacionais nas respostas farmacológicas. No entanto, os protocolos experimentais devem ser especificamente adaptados à natureza 3D das culturas organóides para obter resultados reprodutíveis. Descritos aqui são protocolos detalhados para a realização de ensaios de semeada para determinar a capacidade de formação organóide. Posteriormente, este relatório mostra como realizar tratamentos medicamentosos e analisar a resposta farmacológica através de medições de viabilidade, isolamento de proteínas e isolamento de RNA. Finalmente, o protocolo descreve como preparar organóides para xenoenxerto e subsequentes ensaios de crescimento in vivo usando enxerto subcutâneo. Esses protocolos produzem dados altamente reproduzíveis e são amplamente aplicáveis a sistemas de cultura 3D.

Eficiência de semeada A capacidade de formação de organóides é determinada por fenótipo e genótipo. As células basais da próstata do tipo selvagem (WT) apresentaram capacidade superior de formação organóide (30%-40%) em comparação com as células luminais (3%) (Figura 1A). Após o estabelecimento organóide, a capacidade de formação aumentou drasticamente. Normalmente, 25%-30% das células derivadas de um organóide WT podem fo...

Apresentado aqui é um protocolo para estudar as respostas farmacológicas em organóides epitelia da próstata. Organóides se assemelham à biologia in vivo e recapitulam a genética do paciente, tornando-os sistemas modelo atraentes. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de próstatas wildtype, modelos de camundongos geneticamente modificados, tecido humano benigno, e câncer de próstata avançado.

Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Este protocolo fornece métodos padrão e reprodutíveis para avaliar respostas farmacológicas em culturas organoides de próstata. As culturas organoides da próstata fornecem um sistema in vitro que preserva muitos aspectos da biologia in vivo e da resposta farmacológica, permitindo que as células adotem uma estrutura tridimensional em uma matriz de membrana de porão. Estamos particularmente entusiasmados com o uso desses métodos para avaliar como o genótipo dita a resposta farmacológica na próstata e para modelar a resistência medicamentosa.Esses métodos podem ser aplicados a sistemas de cultura organoide que usam o método de revestimento de cúpula. No entanto, os componentes da mídia, como fatores de crescimento, podem diferir dependendo do tipo de tecido. A demonstração visual permitirá uma discussão mais específica e detalhada das etapas do protocolo e como elas diferem dos muitos outros sistemas de cultura organoide publicados disponíveis aos pesquisadores.A cultura organoide é tipicamente mais demorada do que a cultura celular bidimensional. Certifique-se de alocar tempo extra para esses métodos. Comece isolando organoides de próstata de camundongos ou tecido humano.Mince e enzimaticamente digerem o tecido para produzir uma única suspensão celular, em seguida, coletar as células por centrifugação a 300 vezes g durante cinco minutos. Conte as células e repusam-as na matriz de membrana do porão. Em seguida, emplaque-os na densidade apropriada nas cúpulas matriciais em placas de cultura organoide pré-aquecidas.As cúpulas devem estar a dois milímetros uma da outra e do lado do poço. Uma vez solidificado, adicione suavemente a mídia do lado do poço para evitar interromper a matriz. Depois que as cúpulas se solidificarem, adicione mídia em cima da cúpula para que elas estejam completamente cobertas.Cresça organoides à quantidade desejada para aplicações a jusante determinando o número celular com métodos de contagem padrão. Quando os organoides estiverem prontos para usar, elabore o meio com uma pipeta Pten00 e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz de membrana do porão. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes g durante cinco minutos.Aspire o supernasce e lave a pelota celular com cinco mililitros de PBS. Repita a centrifugação, depois resuspenda a pelota em quatro mililitros de substituição de trippsina e deixe digerir por cinco a 10 minutos enquanto treme a 37 graus Celsius. Adicione um volume igual de meio organoide com 10% FBS para inibir a substituição da trippsina e centrifugar o tubo a 300 vezes g durante cinco minutos.Aspire o supernasce e resuspend as células em um mililitro de PBS. Em seguida, coe as células com um filtro de 40 micrômetros para garantir a suspensão de célula única e conte-as usando um hemótmetro. Diluir a suspensão celular para 100 células por 10 microliters usando meio organoide com 10 micromolar rho kinase inibidor Y27632.Transfira 1.100 células para um novo tubo cônico e adicione 285 microliters de matriz de membrana de porão que resultará em uma concentração matricial de 70%. Em seguida, semeou as células em 35 microliters de cúpulas matriciais em uma placa pré-aquecida de 24 poços certificando-se de emplacar três a cinco réplicas por amostra. Vire a placa e coloque-a em uma incubadora celular para solidificar a matriz do porão.Após 10 minutos, retire a placa da incubadora e adicione o meio contendo o inibidor de rho quinase. Refrescar o meio a cada dois dias e após sete dias, contar o número de organoides estabelecidos por cúpula e calcular a porcentagem de organoides formados do número total de células. Depois de isolar os organoides como descrito anteriormente, a semente 1.000 a 10.000 células na cúpula matricial usando eficiência de formação organoide e velocidade de crescimento como proxy para determinar o número de células finais.Em seguida, semente 35 microliters de cúpulas matriciais em uma placa de 24 poços e deixar a cúpula solidificar. Adicione o meio contendo o inibidor de rho quinase e a droga de escolha. Realize um registro 10 incremental para determinar a concentração inibitória semi-máxima usando o veículo em que a droga foi dissolvida como controle.Atualize o meio a cada dois ou três dias e analise os organoides no sétimo dia para determinar a resposta farmacológica à droga, realizando um ensaio de viabilidade celular, conforme descrito no manuscrito. Para emplacar fragmentos organoides sem trippsinização, use uma pipeta Pten00 para aspirar a pipeta média e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz de membrana do porão. Quando a matriz estiver totalmente interrompida, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes g durante cinco minutos.Aspire o supernasário e adicione cinco mililitros de PBS. Após a lavagem, resuspenque os organoides em um mililitro de PBS e interrompa os organoides por trituração com uma pipeta Pasteur de vidro. Quantifique o número de fragmentos organoides e cinco réplicas de sementes com 100 fragmentos como descrito anteriormente.Sete dias depois, realize um ensaio de viabilidade celular de acordo com as instruções do manuscrito. Células basais de próstata do tipo selvagem demonstraram formação organoide superior em comparação com células luminais. Um pequeno aumento na formação organoide foi alcançado com a perda mediada pelo CRISPR-Cas9 de Pten ou P53 e perda de capacidade de formação ainda maior.Os efeitos das moléculas anti-androgênicas no crescimento foram testados em organoides murinas com diferentes genótipos. A perda de P53 não causou resistência às moléculas anti-androgênicas, mas a perda de Pten aumentou a resistência. A perda dupla de P53 e Pten, no entanto, resultou em resistência completa.A inibição do receptor andrógeno também alterou fenótipos. Tipo selvagem Pten excluído e organoides excluídos P53 demonstraram a diminuição do tamanho do lúmen organoide, enquanto organoides com perda de Pten e P53 foram fenotipicamente não afetados. Como esperado, quando essas células foram enxertadas subcutâneamente no flanco, apenas os organoides Pten e P53 duplamente excluídos cresceram.Dois organoides distintos do câncer de próstata humano MSKPCA2 e MSKPCA3 foram testados para sua resposta a moléculas anti-androgênicas. A proliferação de organoides MSKPCA2 foi fortemente inibida, enquanto os organoides MSKPCA3 não foram afetados. MSKPCA2 expressou altos níveis de receptores de andrógeno e FKBP5, bem como proteínas luminais marcantes.MSKPCA3 também expressou marcadores basais e mesenquimais e não mostrou nenhuma expressão de FKBP5 sugerindo que esses organoides modelam um fenótipo não luminal andrógeno independente. Os organoides precisam ser interrompidos periodicamente, seja por experimentação ou trituração com uma pipeta de vidro para permanecer viável. A frequência depende da origem das espécies e do genótipo.Qualquer tipo de sequenciamento de próxima geração ou experimento de proteômica pode ser realizado após os procedimentos descritos. Esses experimentos investigariam a base molecular dos fenótipos e respostas farmacológicas. Esta técnica de cultura organoide tridimensional permite que os pesquisadores estudem respostas farmacológicas em um contexto genético altamente controlado in vitro.Esta pode ser uma alternativa confiável para estudos in vivo demorados.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Aqui, apresentamos um protocolo para orientar a manipulação de organoides humano de próstata primário, em seguida, sugerir pontos de extremidade para avaliar o fenótipo. Semeadura, manutenção de cultura, recuperação de gel da matriz, quantificação morfológica, incorporação e seccionamento, FFPE seccionamento, toda a montagem coloração e aplicação de ensaios comerciais são descritos.

Manipulação e avaliação da cultura de organoides humano de próstata primário

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

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Os organóides da próstata do rato representam um contexto prometedor para avaliar os mecanismos que regulam a diferenciação. Este artigo descreve uma abordagem melhorada para estabelecer organóides da próstata e introduz métodos para (1) coletar lysato de proteína de organóides e (2) corrigir e manchar organóides para microscopia confocal de montagem inteira.

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

Culturas tridimensionais de amostras de BMPC pacientes e xenoenxertos de câncer de próstata metastático mantêm a heterogeneidade funcional de seus tumores originais resultando em cistos, esferoides e organoides complexos, semelhantes a tumores. Este manuscrito fornece uma estratégia de otimização e protocolo para a cultura 3D de amostras derivadas de pacientes heterogêneos e sua análise utilizando IFC.

Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

Este protocolo descreve uma avaliação padronizada da sensibilidade medicamentosa a inibidores de sinalização direcionados em modelos organoides derivados do paciente NSCLC.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Este protocolo descreve um método semi-automatizado para rastreios de drogas organoides de médio a alto rendimento e software de análise de imagem automatizado e agnóstico ao microscópio para quantificar e visualizar respostas multiparamétricas de drogas organoides únicas para capturar a heterogeneidade intratumoral.

Triagem de Drogas Organoides Tumorais Multiparamétricas Usando Imagem de Células Vivas de Campo Amplo para Análise a Granel e Organoide Único

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

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Estabelecimento de organoides tumorais derivados do câncer de pâncreas e fibroblastos a partir de tecido fresco

A heterogeneidade do câncer de próstata e a resistência ao tratamento continuam sendo desafios. Descrevemos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes (PDOs) que preservam as principais características do tumor parental. Este modelo padronizado suporta a triagem de medicamentos e os avanços da medicina de precisão.

Estabelecimento e manutenção de organoides de câncer de próstata derivados de pacientes: um protocolo experimental detalhado

Este protocolo descreve a geração de um modelo murino baseado em organoide prostático cultivado em 2D. Inclui dissociação organoide, semeadura celular, diferenciação, avaliação da integridade epitelial e infecção in vitro com Escherichia coli uropatogênica. O modelo oferece acessibilidade apical e é adequado para estudar interações hospedeiro-patógeno, superando limitações dos sistemas organoides 3D tradicionais.

Geração de um modelo baseado em organoides prostáticos de camundongos para estudar as interações hospedeiro-patógeno

Aprenda a avaliar respostas farmacológicas em culturas de organoides prostáticos usando o método de plaqueamento em domo. Este protocolo permite modelar resistência a medicamentos e estudar como o genótipo influencia as respostas terapêuticas.

Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas

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