Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos

A reparação esofágica circunferencial é tecnicamente desafiadora em um modelo de rato, necessitando do desenvolvimento de esôfagos projetados por tecido que permite a regeneração da mucosa esofágica e muscular sem vazamento de anastomose esofágica. Implementamos um andaime tubular de duas camadas como modelo piloto, consistindo de nanofibra interna e um fio externo de impressão 3D em conjunto com uma anastomose microvascular para minimizar o vazamento de saliva após o transplante. A reconstrução esofágica padrão convencional está associada a uma ampla gama de complicações e morbidade.

Portanto, a engenharia de tecidos esofágulas pode ser uma estratégia alternativa promissora para o desenvolvimento de modelos de esôfago de pacientes nativos. A combinação de andaime híbrido, cultivo de bioreatores e um sistema de nutrição oral pode ser aplicada a qualquer sistema que tenha um ambiente contaminado semelhante com sua pressão mecânica contínua. Comece esterilizando um andaime de esôfago impresso em 3D com uma exposição de uma hora à luz ultravioleta, um mergulho de 10 minutos em etanol e três lavagens com PBS.

Após a última lavagem, coloque o andaime tubular de duas camadas em uma placa de cultura de tecido nãoadherent de 24 poços, e adicione suavemente, mas uniformemente, uma vez 10 às seis células-tronco mesenquimais humanas derivadas de adiposos por mililitro da matriz de membrana do porão complementada com meio de crescimento à superfície interna do andaime. Use um sistema bioreator de fluxo pulsatil para fixar firmemente o andaime tubular semeado por células ao suporte acrílico na câmara de cultura do bioreator, e adicione 500 mililitros de meio de crescimento à câmara. Em seguida, aplique 1 dyne por centímetro quadrado de estresse de cisalhamento induzido pelo fluxo sob uma atmosfera úmida contendo 5% de dióxido de carbono.

Após cinco dias, use um Kit de Ensaio de Viabilidade LIVE/DEAD para determinar as respostas celulares na superfície interna do andaime de acordo com os protocolos padrão e imagem das células por microscopia confocal. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal no rato anestesiado e coloque o animal na posição supina em uma cortina estéril. Use cortadores para remover o cabelo do local cirúrgico e desinfetar a pele exposta com betadine sequencial e 70% de esfoliantes de etanol.

Para a colocação do tubo T, faça uma incisão de pele e músculo médio no abdômen do rato, e use uma lâmina de bisturi para criar um orifício de três milímetros na parede gástrica anterior. Insira a ponta de um tubo T de silicone no local do defeito para fixá-lo na parede estomacal e sutura cuidadosamente o tubo ao tecido muscular gástrico. Sutura a parede abdominal com sutura VICRYL 4-0.

Insira cuidadosamente a extremidade distal do tubo T implantado através do túnel subcutâneo na parte de trás do pescoço, e use um angiocateter para conectar uma tampa de heparina à extremidade do tubo T para evitar que o conteúdo estomacal flua para trás. Quando a tampa estiver no lugar, use suturas de poliglatina 4-0 para fechar todas as camadas da pele abdominal, e coloque o rato em uma gaiola metabólica com monitoramento até a recumbência total. Uma semana após a colocação do tubo T, prepare o rato para a cirurgia como demonstrado.

Coloque o rato sob o microscópio, e faça uma incisão anterior do pescoço mediano na pele desinfetada exposta. Separe os músculos da correia para expor a estrutura traqueoesofágica. Isole o lado esquerdo do esôfago da traqueia.

Separe cuidadosamente a parte superior do esôfago da glândula tireoide e use uma tesoura cirúrgica para criar um defeito circunferencial completo de cinco milímetros contendo todas as camadas do esôfago. Em seguida, insira uma sutura 9-0 entre a margem inferoposterior direita do remanescente e andaime superior do esôfago, e continue suturando da direita para a esquerda entre o remanescente superior do esôfago e o andaime para criar uma microanastomose na extremidade superior do defeito esofágico distal. Em seguida, anastomose o andaime da mesma forma que a margem superior do remanescente inferior do esôfago.

Quando as anastomoses estiverem completas, coloque a retalho da glândula tireoide circundante sobre o local transplantado para garantir um suprimento vascular e manutenção estável do enxerto. Em seguida, costure o músculo subcutâneo e o tecido da pele com uma sutura VICRYL 4-0, e coloque o rato em uma gaiola metabólica em um dispositivo de aquecimento infravermelho com monitoramento até a completa recumbência. Após uma aplicação uniforme na parede interna do andaime via injeção, a matriz de membrana de porão incorporada por células-tronco humanas demonstra a esperada morfologia de células-tronco mesenquimais, avaliada pela microscopia eletrônica de varredura.

Após o transplante esofágico em ratos com defeitos esofágios circunferenciais completos, como demonstrado, o enxerto é coberto com uma reta da glândula tireoide para fixação estável e fornecimento vascular ao local implantado. Os ratos transplantados do esôfago permanecem em 340 gramas até cerca de nove dias após o procedimento, momento em que os animais diminuem rapidamente de peso devido a várias causas, resultando em morte até o dia 15. Embora a maioria dos ratos desenvolva obstrução não esofágica causada por bolas de cabelo, no geral não há evidência grosseira de perfuração, vazamento de anastomose com fístula, acúmulo de soroma, formação de abscesso ou necrose de tecido mole circundante em qualquer animal experimental.

A reetelialização do local do transplante pode ser confirmada por coloração de imunofluorescência para queratina, e a camada regenerada de colágeno e as fibras de elastina podem ser claramente observadas pela coloração tricrática de Masson. A regeneração da camada muscular esofágica também é evidenciada por uma neovascularização abundante, avaliada pela análise imunohistoquímica desmin. O sucesso deste procedimento depende da manutenção estável do tubo T através da fixação atrás do pescoço para fornecer nutrição durante a reconstrução esofágica.

Para superar a mortalidade precoce típica desse procedimento, a tecnologia organoide ou vascularização precoce poderia ser aplicada após a implantação do esôfago para auxiliar na reconstrução funcional do esôfago.