Name: Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis cultivada em condições de baixo ferro. Este protocolo demonstrado com M. smegmatis permite obter alta abundância de vesículas puras para análises bioquímicas.

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Somos gratos a Rafael Prados-Rosales por compartilhar o anti-MEV antisera e Navneet Dogra para a realização de análise de rastreamento de nanopartículas.

1. Preparação do meio definido empobrecido em ferro
<ol><li>Prepare 1 L de médio mínimo (MM) dissolvendo 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 mL de glicerol e 2 g de dextrose em 900 mL de água desionizada em um recipiente de plástico. Evite o vidro para evitar a contaminação por ferro. Ajuste o pH para 6,8 com 5 N NaOH e o volume para 1 L com água.</li>
	<li>Adicione 50 g de resina quelante de metal (MCR) e agita-se suavemente usando uma barra de agitação magnética por 24 h a 4 °C. Esterilizar e remover o MCR por filtragem através de uma unidade de filtro de 0,22 μm com um receptor de plástico. Para acelerar a filtragem e evitar entupimento de filtro, deixe o sedimento de resina por cerca de 30 min antes da filtragem. Nota: Este meio contém menos de 2 μM de ferro residual, conforme determinado pela espectroscopia de absorção atômica.</li>
	<li>Suplemento MM com 0,5 mg/L de ZnCl2,40 mg/L de MgSO4,e 0,1 mg/L de MnSO4. Separadamente, prepare estoques concentrados (1.000x) de cada um dos suplementos metálicos em água desionizada e esterilizar por filtragem antes da suplementação mm. O MM suplementado de metal esgotado em ferro será referido aqui como MM de baixo ferro (LIMM).</li>
	<li>A partir de um estoque de 50 mM de FeCl3 dissolvido em 10 mM HCl, adicione 1 mL a 1 L de LIMM (50 μM concentração final) para preparar mm de ferro alto (HIMM).</li>
</ol>2. Growing Mycobacteria in Iron-limited Conditions 2. Growing Mycobacteria in Iron-limited Conditions 2. Growing Mycobacteria in Iron-limited Conditions 2.
<ol><li>Descongele 50 μL de um estoque congelado de 15% de glicerol de Mtb e estria uma placa de ágar complementada com enriquecimento DED 10% (5 g/L albumina, 2 g/L dextrose e 0,85 g/L cloreto de sódio, 0,2% glicerol e 0,05% Tween-80)10. Incubar a placa a 37 °C até que as colônias sejam visíveis.</li>
	<li>Inocular uma única colônia de Mtb10 em 2 mL de meio de caldo micobacteriano(Tabela de Materiais)complementada com enriquecimento ADN. Incubar com agitação a 37 °C.</li>
	<li>Deixe a cultura Mtb crescer até a fase logarítica tardia (OD540 é ~ 0,8). Para verificar isso, medir o OD540 usando um espectrômetro.</li>
	<li>Espalhe 200 μL da cultura logarítica tardia nas placas de ágar micobacterianas(Tabela de Materiais)complementadas com glicerol de 0,2%, 0,05% Tween-80 e ADN. Inocular pelo menos 5 placas. Incubar as placas a 37 °C até que o crescimento bacteriano seja visível como uma camada de confluente. Isso leva ~ 1 semana para Mtb.</li>
	<li>Molhe um cotonete estéril em LIMM. Use este cotonete para coletar bactérias das placas de ágar e inocular 100 mL de LIMM para preparar uma suspensão bacteriana concentrada com um OD540 de ~1.0.</li>
	<li>Diluir esta suspensão 10 vezes a 1 L com LIMM e dividi-lo em dois, 2 L garrafas de plástico estéreis, cada um contendo 500 mL de cultura.</li>
	<li>Tire 2 mL de cultura e transferi-lo para um tubo de cultura 5 mL. Adicione 10 μL de 10% vol/vol tyloxapol.</li>
	<li>Incubar as culturas a 37 °C de pé por 14 dias.</li>
</ol>3. Coleção de MEVs
<ol><li>Medir o OD540 da cultura 2 mL no momento da coleta. Faça 1:10 diluições em série da cultura e placa 100 μL de cada diluição em placas de ágar com ADN e 0,05% Tween-80.</li>
	<li>Transfira a cultura para cinco tubos cônicos de centrífuga de 225 mL e centrífugaa a 2.850 x g por 7 min a 20 °C.</li>
	<li>Colete o supernatant da cultura com uma pipeta de 50 mL e o filtro o esterilizaa através de uma unidade do filtro de 0.22 μm.</li>
</ol>4. Isolamento de MEVs
<ol><li>Transfira a filtragem da cultura para um sistema de ultrafiltração de células agitadas colocada a 4 °C e filtre o concentrado em <50 psi através de uma membrana de corte de 100 kDa para ~50 mL.</li>
	<li>Centrífuga a cultura concentrada filtrar a 15.000 x g por 15 min a 4 °C e recolher o supernatant.</li>
	<li>Centrífuga a cultura filtrada em tubos de ultracentrífugade de policarbonato a 100.000 x g para 2 h a 4 °C.</li>
	<li>Resuspende as pelotas membranosas em um total de 1 mL de soline tampão de fosfato estéril (PBS) por pipetting suave.</li>
	<li>Misture 0,5 mL da suspensão de pelota obtida na etapa 4.4 com 1,5 mL de solução iodixanol de 60%, produzindo uma concentração final de iodixanol de 45% wt/vol. Dispense esta mistura na parte inferior de um tubo de ultracentrífuga de paredefina de 13 mm x 51 mm.</li>
	<li>Sobreposição do MEV-iodixanol 45% suspensão com 1 mL de 40%, 35%, 30%, 25%, e 20% (vol/ vol em PBS) soluções iodixanol e 1 mL de PBS no topo.</li>
	<li>Centrífuga a 100.000 x g para 18 h a 4 °C.</li>
	<li>Colete as frações de gradiente de densidade de 1 mL a partir do topo usando uma seringa Hamilton de 1 mL.</li>
	<li>Diluir cada fração coletada a 20 mL com PBS e centrífuga em 100.000 x g para 2 h em 4 °C.</li>
	<li>Retire o supernatant e suspender a pelota em 0,5 mL de PBS. Guarde esta pelota a 4 °C.</li>
</ol>5. Quantificação de MEVs
<ol><li>Medir a concentração de proteínaem cada fração por um ensaio de Bradford(Tabela de Materiais),seguindo as diretrizes do fabricante.</li>
	<li>
Realizar análise lipídica de membrana.
	<ol>
<li>Incubar 10 μL de cada fração de gradiente com a sonda de membrana fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonato (TMA-DPH) em uma concentração final de 1 μg/mL em um volume final de 50 μL da PBS em 96 bem preto Placas.</li>
		<li>Incubar as placas a 33 °C por 20 min.</li>
		<li>Medir a fluorescência em 360 nm excitação e 430 nm emissão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análise qualitativa de MEVs
<ol><li>
Realizar eletroforese de proteína.
	<ol>
<li>Misture aproximadamente 1 μg de amostras de MEV em 16 μL com 4 μL de buffer de carregamento de amostras 5x (10% w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v glicerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v bromehenol azul) e aqueça as amostras no buffer de amostras a 85 °C por 5 min.</li>
		<li>Carregue em um gel 10% Tris/Glycine SDS-poliacrilamida11 e funcione a 10 V/cm no tampão de corrida (base de 25 mM Tris, 190 mM glicina, 0,1% SDS) até que a frente de tininho azul atinja o fundo do gel.</li>
		<li>Manchar o gel com uma solução de coloração de proteína ultrasensível(Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Executar a mancha de pontos.
	<ol>
<li>Load 2 μL de uma suspensão mevs com uma concentração de aproximadamente 0,5 μg/μL, e duas vezes diluições em série em uma membrana nitrocelulose e processo para uma mancha de pontos de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Use um antiserum criado em camundongos contra uma preparação de MEVs em uma diluição de 1:5,000 como o anticorpo primário e um anti-rato de cabra acoplado à peroxidase rábano (HRP) em uma diluição 1:10,000 como anticorpo secundário. Detecte complexos de anticorpos-antígenos com um reagente apropriado de detecção de borrato de substrato de SAREM e um sistema de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar coloração negativa e microscopia eletrônica.
	<ol>
<li>Fix 250 μL de MEVs com 2% glutaraldeído em 0,1 M cacodylate à temperatura ambiente por 2 h e incubar durante a noite em 4% de formaldeído, 1% glutaraldeído e 0,1% PBS.</li>
		<li>Manchar as amostras fixas com 2% de tetróxido de osmium por 90 min.</li>
		<li>Desidratar seriamente a amostra em etanol e incorporar a resina epóxi de Spurr.</li>
		<li>Observe os MEVs um microscópio eletrônico de transmissão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li>
<li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li>
<li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Pst%2FSenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778(2018).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li>
<li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).</li>
<li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies.+A+laboratory+manual%22">Antibodies. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Vários métodos para purificar exossomos derivados de células eucarióticas foram desenvolvidos12. Em contraste, há informações limitadas sobre métodos eficazes para purificar EVs derivados de bactérias7. O isolamento eficiente dos EVs derivados de Mtb precisa considerar as dificuldades intrínsecas no crescimento dessa micobactéria patogênica. Mtb tem um longo tempo de divisão (~ 24 h) e deve ser tratado em condições de nível de biossegurança três (BSL-3). Portanto, é importa...

As vesículas extracelulares micobacterianas (MEVs) são nanopartículas ligadas à membrana, de 60 a 300 nm de tamanho, naturalmente liberadas por micobactérias de crescimento rápido e lento1. Mevs liberados por micobactérias patogênicas constituem um mecanismo para interagir com o hospedeiro através de proteínas imunologicamente ativas, lipídios e glicolipides secretados de forma concentrada e protegida2,3,4. Para caracterizar MEVs e compreender a sua biogênese e funções, métodos rigorosos e eficientes de purificação e validação de vesículas são cruciais. Até agora, mevs foram isolados da cultura filtrates de micobactérias cultivadas em um meio rico em ferro1,5,6,7,8.
No entanto, trabalhos anteriores demonstraram que a limitação de ferro estimula muito a liberação de vesículas em Mtb, possivelmente para capturar ferro via micobactina, um sideróforo secretado em MEVs9. Embora os procedimentos para o isolamento de MEVs de Mtb cultivados em médio de alto ferro tenham sido descritos, uma metodologia eficiente para obter MEVs de culturas de baixo ferro não foi relatada. Portanto, o objetivo deste método é isolar, purificar e quantificar os MEVs obtidos de culturas de baixo ferro para que possam ser usados para ensaios bioquímicos e funcionais e para a análise de determinantes genéticos da produção de vesículas em micobactérias.

<table><tbody><tr><td>Célula agitada Amicon Modelo 108</td><td>EMD Milipore</td><td>Sistema de</td><td>ultrafiltração de células</td>UFSC40001</tr><tr><td>BD Tubos cônicos de polipropileno 225 mL</td><td>Fisher</td><td>05-538-61</td><td>Tubos de centrífuga cônicos</td></tr><tr><td>Biomax 100 kDa membrana de ultrafiltração de corte</td><td>EMD Milipore</td><td>PBHK07610</td><td>Membrana de ultrafiltração</td></tr><tr><td>Resina Chelex-100 Bio-Rad</td><td></td><td>142-2842</td><td>Metal resina quelante</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Ágar</td><td>BD Difco</td><td>262710</td><td>Placas de ágar micobacterianas</td></tr><tr><td>Caldo Middlebrook 7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Meio de caldo micobacteriano</td></tr><tr><td>Membrana de borrão de nitrocelulose</td><td>GE Healthcare</td> Membrana <td>de</td><td>10600001-borrão</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Iodixanol</td></tr><tr><td>Policarbonato ultra centrifugação tubos de 25 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>Tubos de ultra centrifugação de policarbonato 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de parede fina de polipropileno 13 mm x 15 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>Tubo de centrífuga de parede fina de polipropileno 13 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Corante de ensaio de proteína</td><td>BioRad</td><td>5000006</td><td>Bradford Coloração de proteína</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S12000</td><td></td></tr><tr><td>As pontas de prova moleculares</td> ultrassensíveis <td>T204</td> da mancha<td>TMA-DPH</td><td>da proteína 1- (4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td></tr><tr><td>Frascos da filtragem do vácuo</td><td>Unidade</td> de filtro de <td>CellPro</td><td>V50022</td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Micobactérias, incluindo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose humana, liberam naturalmente vesículas extracelulares (EVs) contendo moléculas imunologicamente ativas. O conhecimento sobre os mecanismos moleculares da biogênese vesícula, o conteúdo das vesículas e suas funções na interface patógeno-hospedeiro é muito limitado. Abordar essas questões requer procedimentos rigorosos para isolamento, purificação e validação de EVs. Previamente, a produção do vesicle foi encontrada para ser realçada quando a tuberculose de M. foi expor à limitação do ferro, uma circunstância encontrada por Mtb no ambiente do anfitrião. Apresentado aqui é um protocolo completo e detalhado para isolar e purificar EVs de micobactérias deficientes em ferro. Métodos quantitativos e qualitativos são aplicados para validar EVs purificados.

Os MEVs foram purificados por sedimentação diferencial em um gradiente de densidade (Figura 1, Figura 2). Nas condições descritas, os MEVs se separaram principalmente na fração de gradiente 3 (F3), o que corresponde a 25% de iodixanol. Esta conclusão baseia-se na detecção de proteínas, lipídios de membrana, visualização microscópica de MEVs intactos, distribuição de tamanho de nanopartículas e reatividade positiva com antiserum d...

Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Este método permite cultivar Mycobacterium tuberculosis sob estritas condições de ferro baixo e purificar vesículas de membrana a partir do filtrado de cultura de baixo ferro. Como a limitação do ferro é conhecida por estimular a produção de vesículas de membrana, este protocolo produz alta abundância de vesículas de membrana pura que podem ser utilizadas para outros ensaios bioquímicos ou funcionais. Quando demonstramos o protocolo usando o Mycobacterium smegmatis, a cepa não virgem, este protocolo pode ser seguido em instalações BSL-2 usando Mycobacterium tuberculosis, a cepa virulenta.Para começar, prepare um litro de meio mínimo dissolvendo cinco gramas de fosfato monopotássio, cinco gramas de L-asparagine, 20 mililitros de glicerol e dois gramas de dextrose em 900 mililitros de água desionizada em um recipiente plástico. Ajuste o pH para 6,8 com cinco hidróxido de sódio normais e ajuste o volume para um litro com água deionizada. Em seguida, adicione 50 gramas de resina de quesina metálica e agitar suavemente usando uma barra de agitação magnética por 24 horas a quatro graus Celsius.No dia seguinte, pare a agitação e deixe o sedimento de resina por cerca de 30 minutos. Esterilize e remova a resina restante da solução através de uma unidade de filtro de 22 mícrons com um receptor plástico. Agora, suplemente o meio mínimo com 0,5 miligramas por litro de cloreto de zinco, 40 miligramas por litro de sulfato de magnésio e 0,1 miligramas por litro de sulfato de manganês.Inocular uma única colônia de MTB em dois mililitros de caldo micobacteriano complementado com enriquecimento ADN. Incubar com agitação a 37 graus Celsius. Quando houver crescimento visível, extraia dois mililitros da cultura e mede o OD 540 em um espectógrafo.Pare a incubação quando o OD 540 atingir 0,8, o que indica a fase logarítmica tardia. Espalhe 200 microlitadores da cultura logarítmica tardia nas placas de ágar micobacteriano suplementadas com 0,2 glicerol, 0,5% Tween 80 e ADN. Inocular pelo menos cinco pratos.Incubar as placas a 37 graus Celsius. E depois de uma semana, o crescimento bacteriano é visível como uma camada confluente. Em seguida, molhe um cotonete estéril em um meio mínimo de ferro baixo.Use este cotonete para coletar bactérias das placas de ágar. Inocular a bactéria em 100 mililitros de baixa mídia de ferro mínimo em um tubo. Colete bactérias suficientes para preparar uma suspensão com um OD 540 de um.Diluir a suspensão 10 vezes para um litro com meio mínimo de ferro baixo e dividi-la em duas garrafas plásticas estéreis. Em seguida, transfira dois mililitros da cultura para um tubo de cultura de cinco mililitros. Adicione 10 microliters de 10% de volume por volume tyloxapol.Incubar as culturas a 37 graus Celsius por 14 dias. Transfira a cultura para cinco tubos de centrífuga cônica de 225 mililitros e centrífuga a 2.850 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Colete a supernascercultura cultural com uma pipeta de 50 mililitros e esterilize-a através de um filtro de 0,22 mícrons.Para isolar os MEVs, transfira o filtrado da cultura para um sistema de ultrafiltração celular agitado colocado a quatro graus Celsius e filtre o concentrado a uma pressão inferior a 50 PSI através de uma membrana de corte de 100 kilodalton. Em seguida, centrifugar a cultura concentrada filtrar a 15.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius e coletar o supernascido em tubos de ultracentrifugação de policarbonato. Centrifugar o supernante a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.Depois disso, remova o supernaspe e resuspenda as pelotas membranous em um total de um mililitro de PBS estéril por tubulação suave. Misture 0,5 mililitros da suspensão da pelota com 1,5 mililitros de solução de 60% iodixanol na parte inferior de um tubo ultracentrifuge de parede fina de polipropileno. Sobreponha esta suspensão de Iodixanol MVE de 45% com um mililitro de 40%35%30%25% e 20% de soluções iodixanol e um mililitro de PBS no topo.Centrifugar a 100.000 vezes g por 18 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma seringa Hamilton de um mililitro para coletar as frações de gradiente de densidade de um mililitro a partir do topo. Diluir cada fração coletada para 20 mililitros com PBS e centrífuga a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.Remova o supernatante e resuspend em 0,5 mililitros de PBS. Armazene os tubos a 4 graus Celsius. Para realizar a análise lipídica da membrana, combine 10 microliters de cada fração gradiente com a sonda de membrana fluorescente TMA-DPH em uma concentração final de um micrograma por mililitro em 50 microlitrais de PBS em cada poço de uma placa preta de 96 poços.Incubar as placas a 33 graus Celsius por 20 minutos. Meça a fluorescência em 360 nanômetros para excitação e 430 nanômetros para emissão. Neste protocolo, os MEVs foram purificados por sedimentação diferencial em um gradiente de densidade.Nas condições descritas, os MEVs foram separados principalmente na fração de gradiente três, o que corresponde a 25% de iodixanol. As proteínas associadas à vesícula foram concentradas na fração três mostrada pela análise da mancha de ponto. A coloração negativa também confirmou a presença de MEVs na fração três e a análise de nanopartículas mostrou que o tamanho do MEV era de cerca de 100 nanômetros.A concentração de proteínas e lipídios normalizada para unidades formadoras de colônias mostrou um aumento de aproximadamente oito vezes no rendimento de MEV em ferro baixo em relação às altas condições de ferro. A análise da mancha de ponto mostrou um sinal mais intenso de marcadores associados ao MEV em frações de gradiente de densidade da cultura MTB limitada de ferro do que de culturas MTB suficientes de ferro. Siga as instruções para a preparação do meio mínimo para assegurar condições limitadas de ferro e evitar a contaminação das vesículas da membrana com agregados de lipoproteína.As vesículas da membrana micobacteriana purificadas desta forma podem ser utilizadas para caracterização bioquímica e análise funcional.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-produced-iron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Gupta, S., et al. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento de cultivo de Mycobacterium tuberculosis sob condições limitadas de ferro para induzir estresse de ferro e promover a secreção de sideróforos que suportam a sobrevivência bacteriana.

Cultivo de Mycobacterium tuberculosis em condições limitadas por ferro

Fonte: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o isolamento gradual de vesículas extracelulares (EVs) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas sob condições limitantes de ferro que imitam o ambiente hospedeiro. Ele descreve o uso de ultrafiltração, centrifugação diferencial e separação de gradiente de densidade para enriquecer e identificar frações contendo...

Isolamento de vesículas extracelulares contendo sideróforo de Mycobacterium tuberculosis

Fonte: Watson, D. C., et.al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de vesículas extracelulares (EVs) derivadas da membrana externa de bactérias geneticamente modificadas. O processo envolve a cultura das bactérias para liberar EVs, seguido por etapas sequenciais de centrifugação e filtração para remover células e detritos. Finalmente, a ultrafiltração é usada...

Isolamento e Enriquecimento de Vesículas Extracelulares Derivadas da Membrana Externa de Bactérias

Este vídeo descreve um método baseado em cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para isolar vesículas extracelulares ou EVs derivadas das células imunológicas do cérebro - a microglia. Os EVs atuam como carga molecular para fornecer mediadores, que regulam uma resposta imune. Portanto, os EVs isolados podem ser usados como um modelo in vitro para estudar a interferência microglia-neurônio durante uma resposta imune neuronal.

Isolamento baseado em SEC de vesículas extracelulares derivadas de microglia: uma técnica para isolar vesículas extracelulares de meios de cultura condicionados por microglia

Este vídeo demonstra a técnica de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para purificar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). A técnica utiliza uma coluna porosa embalada com resina para obter frações purificadas de EVs. As partículas porosas permitem seletivamente que proteínas menores entrem nos poros, resultando em eluição mais lenta. Ao mesmo tempo, os EVs são excluídos de entrar nos poros devido ao seu tamanho maior e são...

Uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

Vesículas extracelulares presentes no sangue têm sido sugeridas como novos biomarcadores para várias doenças. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes microvesículas derivadas da membrana plasmática de amostras de sangue periférico e sua posterior análise por citometria de fluxo convencional e Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para isolamento, concentração e caracterização de vesículas extracelulares de culturas cianobacterianas. Abordagens para purificar vesículas de culturas em diferentes escalas, trocas entre metodologias e considerações para o trabalho com amostras de campo também são discutidas.

Isolamento e Caracterização de Vesículas Extracelulares Cianobacterianas

Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.

Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Aprenda a isolar e caracterizar vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis cultivada em condições de baixo ferro. Este protocolo demonstrado com M. smegmatis permite obter alta abundância de vesículas puras para análises bioquímicas.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

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