Sistema de microininjeção para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia

Este sistema de microinjeção é projetado para infusão de drogas, eletrofisiologia e entrega e recuperação de sondas experimentais como microeletrodos e nanosensores. É otimizado para uso repetido em animais de comportamento acordado com pequenos danos de penetração aos tecidos circundantes. O sistema de microinjetorode pode ser configurado para múltiplos propósitos.

O primeiro é um simples arranjo da cânula para a colocação de uma sonda experimental que de outra forma seria muito frágil para penetrar na dura-mater. A segunda é uma infusão microfluida de uma droga independentemente ou acoplada a uma cânula contendo uma sonda experimental. Os componentes microfluidos do sistema permitem a entrega de volumes na escala de nanoliter.

Meça o comprimento da cânula e da sonda nanosensor ou microeletrodes. A sonda deve ser mais longa que a cânula pelo comprimento que é se projetar da ponta da cânula mais aproximadamente um centímetro. Sob uma lupa, carregue a sonda na cânula através da parte de trás para proteger a ponta da sonda.

Insira a cânula contendo a sonda na junção T a partir da ferrula inferior. Coloque o lado superior da cânula no meio da junção T. Evite bloquear a junção através da cânula, retraindo-a de volta para a junção e, em seguida, aperte-a.

Coloque uma tubulação no topo da microeletrídroa. Carregue de volta o microeletrodo através da tubulação capilar, junção T, cânula e ferrules correspondentes. Corte a microeletrídroa no comprimento desejado e raspe a extremidade.

Certifique-se de que a parte de trás do eletrodo se projeta a menos de um centímetro da parte de trás da tubulação capilar e a ponta do eletrodo se projeta da cânula na distância desejada na parte inferior. Coloque o terminal de microeletrodo no pino de ouro e solde o pino de ouro no terminal de microeletrodo. Adicione cola epóxi entre o pino de ouro e a ferrule superior para fixar o microeletrou à ferrula.

Depois que o epóxi for curado, de preferência por mais de 24 horas, desaparafusar a ferrule superior para garantir que o microeletrodo se retraia totalmente dentro da cânula. Para construir o circuito microfluido, coloque uma placa larga sobre uma superfície estável. Coloque as duas válvulas de três vias paralelas aos lados mais longos da placa larga com cerca de 12 centímetros de distância com uma porta voltada para a outra.

Use parafusos para fixar as válvulas na placa larga e corte mais 10 centímetros de tubulação capilar para a linha de régua e coloque-a no meio. Use ferrules padrão para apertar o tubo nas portas viradas das válvulas. Corte de 10 a 20 centímetros da tubulação capilar e use as ferrules padrão e os conectores de trava Luer para conectar o tubo na seringa a uma das portas da válvula de entrada.

Corte um pequeno pedaço de capilar e conecte-o à válvula de saída como a linha de descarga. Corte dois pedaços mais longos de tubulação capilar em torno de 100 centímetros para conectar a válvula de saída ao microinjetorode. Conecte a bomba de droga e a bomba de marcador à válvula de entrada.

Primeiro, certifique-se de que a sonda experimental de microeletrodo seja retraída na cânula. Para anexar um adaptador personalizado ao microinjeto usando parafusos, carregue o microinjeto através do tubo-guia e fixe-o no adaptador de micro acionamento personalizado usando um par de parafusos. Meça a profundidade da posição de acionamento micro na qual o microinjeto se projeta do tubo-guia e, em seguida, retraia-o um centímetro para se preparar para a inserção.

Para experimentos de microinfusão, conecte a linha cerebral à abertura de junção T nãousada do microinjetorode. Use uma ferrule padrão e aperte com a chave de fenda. Certifique-se de que a ferrula superior também está apertada.

Em seguida, posicione a micro unidade sobre um béquer. Carregue a clorexidina a 20 gramas por litro na seringa apertada de um mililitro e coloque-a na bomba de drogas. Gire a direção de fluxo das válvulas e defina uma baixa taxa de fluxo de 50 a 200 microliters por minuto de modo que o fluido vá da bomba de drogas através da válvula de entrada para a válvula de saída e para fora da linha cerebral.

Lave o circuito com clorexidina por pelo menos 10 minutos. Repita a descarga com soro fisiológico estéril e depois com ar. Aplique suavemente lenços sem fiapos nas junções para ajudar a revelar quaisquer vazamentos líquidos através das ferrulas.

O passo mais crítico é verificar se a montagem do circuito injetado e microfluido é livre de vazamentos. Carregue a droga na seringa apertada de 500 microliter, comprima o ar e coloque-a na bomba de drogas. Ajuste o fluxo para 50 microliters por minuto e deixe o líquido viajar até que algumas gotas sejam deixadas no microinjeto.

Em seguida, mergulhe o tubo-guia em clorexidina na concentração de 20 gramas por litro por 15 minutos. Gire a direção da válvula de saída em direção à linha de descarga para deslocar o marcador à medida que a bomba de marcador é avançada até que uma borda clara de cor e óleo seja observada na linha de régua. Certifique-se de que sempre há óleo entre a droga e a cor para não misturar os dois materiais solúveis em água e perder a borda afiada entre eles.

Marque a posição inicial desta linha de corante de óleo. Após a configuração experimental necessária, retraia o microeletro na cânula afrouxando a ferrula superior. Conecte a micro unidade à câmara de gravação e baixe o tubo-guia para penetrar na dura.

Em seguida, abaixe o microinjeto para cerca de dois milímetros acima do local de gravação localizado no cérebro. Aperte a ferrula superior e conecte os pinos de ouro ao sistema de gravação. Continue avançando o microinjeto para o local alvo.

Em seguida, mude a válvula de saída para a linha cerebral. Para experimentos de infusão, use a bomba manual de microsiringe para mover a coluna de óleo em 0,5 centímetros a cada minuto. Uma vez infundido o volume desejado, troque a válvula de saída em direção à linha de descarga.

Neste estudo, foi realizada a injeção de um Agonista GABA A através da área FEF do hemisfério direito para inativação reversível do campo ocular frontal enquanto o animal terminava uma tarefa de saccade guiada pela memória. O enredo polar mostra o desempenho da excentricidade para diferentes locais em relação ao ponto de fixação. O desempenho diminuiu claramente no hemifield visual esquerdo duas horas após a injeção.

Os traços de saccade para oito locais de memória periférica antes e depois da injeção de Muscimol no FEF são mostrados aqui. A precisão de Saccade no hemifield visual esquerdo diminuiu após a injeção de Muscimol. Uma vez que a configuração esteja completa, o método é muito confiável e robusto.

No entanto, devido à precipitação de pequenas moléculas dentro do tubo e das portas, é necessária uma descarga completa antes de cada uso e após cada experimento, a fim de manter o microfluidic livre de obstruções e vazamentos. Embora o método tenha sido demonstrado no campo do olho frontal em um primata não humano, o princípio pode ser aplicado a qualquer outra região cerebral onde alguma combinação de estimulação elétrica, registro e injeção de drogas são desejadas em espécies do tamanho de roedores ou maiores. Nosso sistema tem a flexibilidade de ser usado para gravar independentemente ou em combinação com a injeção de drogas e tem a capacidade de colocar precisamente qualquer sonda experimental frágil protegida contra danos através da dura mater e tecido neural com danos mínimos de tecido devido ao seu pequeno diâmetro de cânula.