Name: Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprenda a estabelecer organoides 3D derivados de pacientes com câncer de próstata metastático ósseo. Este protocolo otimizado permite criar modelos ex vivo para estudar patologia e testar tratamentos.

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Este estudo contou com o apoio da Fundação de Caridade Leo e Anne Albert e da Fundação JM. Agradecemos aos membros do Centro de Câncer da Universidade da Califórnia de San Diego Moores, Dr. Jing Yang e Dr. Kay T. Yeung por nos permitirem o uso de seu microtome e Randall French, Departamento de Cirurgia para perícia técnica.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Conselho de Revisão Institucional (UCSD) da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD). O IRB #090401 Aprovação foi recebido do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da UCSD para coletar amostras cirúrgicas de pacientes para fins de pesquisa. Um consentimento informado foi obtido de cada paciente e um espécime cirúrgico de metástase do câncer de próstata foi obtido a partir do reparo ortopédico de uma fratura patológica no fêmur. Os protocolos animais foram realizados o #S10298 protocolo aprovado pelo Comitê de Assistência e Uso de Animais Institucionais (UcSD) da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD). Células de tecido tumoral mecanicamente e enzimático dissociado foram injetadas intra-femoralmente em Rag2masculino de 6 a 8 semanas-/-;γc-/- camundongos como descrito anteriormente17. O volume do tumor de xenoenxerto foi determinado usando um sistema de imagem de bioluminescência in vivo e medidas de pinça. Após o crescimento do tumor até 2,0 cm (o tamanho máximo permitido aprovado pelo IACUC), o tumor foi colhido para o estabelecimento de organoides 3D.
NOTA: A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a criação de Organoides 3D e um número de protocolo para cada etapa dos procedimentos experimentais.
1. Processamento de tecidos tumorais derivados do paciente (PDX)
NOTA: Este é um passo inicial para o estabelecimento organoide para um tumor derivado de um modelo de rato xenoenxerto. Este protocolo é adaptado de uma publicação anterior de Drost et al.5 e modificamos as condições da mídia para incluir suplementação soro a mídia organoide.
<ol><li>Processe o espécime tumoral como descrito abaixo.<ol>
<li>Mince amostras de tumor escaneie amostras de tumor escaneie 1-3 mm3 pedaços de tamanho e digerir as amostras com 10 mL de solução de dissociação celular por 45 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Para interromper a digestão, adicione 20 mL de mídia completa DMEM às amostras.</li>
		<li>Filtre a suspensão através de um filtro de célula de 70 μm. Use uma flange de êmbolo estéril para empurrar qualquer tecido restante na parte superior do filtro celular de 70 μm.</li>
		<li>Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Lave a pelota celular três vezes com mídia completa adDMEM fresca. Combine o volume de mídia para lavagem e resuspensão com o volume de mídia sugerido na Tabela 3. Por exemplo, para uma condição de cultura de placa de poço 24, o volume para a lavagem deve ser de 500 μL. NOTA: Como mostrado na Tabela 3,o protocolo é aplicável a diferentes condições culturais.</li>
		<li>Determine contagem final de células usando tinantes azuis trypan e um hemocímetro.</li>
		<li>Após a obtenção da contagem de células, suspenda novamente a pelota celular em 80 μL de 2% de FBS em PBS por 2 x 106 células tumorais.</li>
		<li>Adicione 20 μL do Coquetel de Esgotamento celular do rato por 2 x 106 células tumorais. Misture bem e incuba por 15 min a 2-8 °C.</li>
		<li>Ajuste o volume para 500 μL com 2% de FBS em tampão PBS por 2 x 106 células tumorais. NOTA: Até 1 x 107 células tumorais em 2,5 mL de suspensão celular podem ser processadas em uma coluna de LS.</li>
		<li>Carregue as colunas LS no separador da coluna magnética e coloque um tubo cônico de 15 mL em um rack por baixo para coletar o fluxo-through.</li>
		<li>Enxágüe cada coluna com 3 mL de 2% FBS em tampão PBS. Descarte o tubo cônico com o fluxo de lavagem e substitua por um novo tubo cônico estéril de 15 mL.</li>
		<li>Adicione a suspensão celular (até 2,5 mL de 1 x 107 células tumorais) na coluna. Coletar fluxo-through que será o enriquecido com células tumorais humanas.</li>
		<li>Lave a coluna duas vezes com 1 mL de 2% FBS no buffer PBS. NOTA: É importante realizar etapas de lavagem assim que a coluna estiver vazia. Além disso, tente evitar formar bolhas de ar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot o volume apropriado de suspensão celular a um tubo de 1,5 mL para a cultura desejada configurada(Tabela 3).</li>
	<li>Centrífuga o tubo de 1,5 mL a 300 x g e 4 °C para 5 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente e descarte o supernatante.</li>
</ol>2. Processamento de tecidos tumorais primários pacientes
NOTA: Este é um passo inicial para o estabelecimento organoide.
<ol><li>Siga toda a etapa 1, exceto o processo de esgotamento das células do camundongo, o que não é necessário para o processamento de tecidos tumorais primários do paciente.</li>
</ol>3. Formando uma cúpula redonda anexada na placa
NOTA: Este manuscrito descreve três maneiras de fazer uma cúpula a partir de uma mistura da pelota celular e da membrana do porão (por exemplo, Matrigel) como mostrado na Figura 1 e Figura 2. Nos passos 2-4, as células e a membrana do porão devem ser mantidas no gelo para evitar a solidificação da membrana do porão.
<ol><li>Resuspender a pelota celular no volume apropriado da membrana do porão (por exemplo, 40 μL) para uma placa de 24 poços configurada(Tabela 3).</li>
	<li>Pipette para cima e para baixo suavemente para garantir que as células sejam resuspensas bem na membrana do porão.</li>
	<li>Pipette o volume apropriado (Tabela 3) da mistura de membrana do porão celular (e opcional 10 μL de mídia completa adDMEM) no centro da placa de cultura do tecido pré-aquecido.</li>
	<li>Inverta a placa e coloque imediatamente a placa de cabeça para baixo na incubadora de cultura celular CO2 situada em 5% CO2, 37 °C para 15 min. Isso impede que as células se acomodem e aderem ao fundo da placa, permitindo que a membrana do porão se solidifique.</li>
	<li>Pipette o volume apropriado (Tabela 3) de médio pré-aquecido contendo 10 μM Y-27632 dicloridor em cada poço.</li>
	<li>Coloque a placa do lado direito dentro da incubadora de cultura celular CO2 (5% CO2, 37 °C).</li>
	<li>Troque a mídia a cada 3-4 dias. Após 5-7 dias, use o meio cultural sem 10 μM Y-27632 dihidrocloreto para manter as culturas.</li>
</ol>4. Formando uma cúpula flutuante de uma cúpula redonda anexada na placa
<ol><li>Após o passo 3.7, desapego a cúpula usando um raspador de celular.</li>
</ol>5. Formando contas flutuantes
NOTA: Este protocolo é nomeado como contas flutuantes, uma vez que a mistura de membrana de porão, mídia e organoides parecem contas.
<ol><li>Corte um pedaço de filme de parafina de 2 polegadas x 4 polegadas.</li>
	<li>Coloque o filme de parafina na parte superior dos divots de um rack vazio de uma caixa de ponta de 1000 μL.</li>
	<li>Pressione suavemente o filme parafina para rastrear os divots usando um dedo indicador enluvado, mas sem quebrar o filme parafina.</li>
	<li>Pulverize a parafina com 70% de etanol e ligue a lâmpada UV no capô da cultura celular para esterilizar o filme de parafina preparado por pelo menos 30 min.</li>
	<li>Prepare uma mistura de células e 20 μL de membrana do porão. A densidade de sementes pode ser de 50.000 - 250.000 células por cúpula.</li>
	<li>Pipeta a mistura de células processadas a partir da etapa 1 ou 2, e 20 μL de membrana do porão no molde do divot formado no filme de parafina preparado.</li>
	<li>Resuspender a pelota celular na membrana do porão e pipeta a suspensão celular na parafina preparada filmada divots.</li>
	<li>Coloque as contas solidificadas e o filme de parafina em uma placa de 6 poços. Uma bem em uma placa de 6 poços pode caber até 5 contas.</li>
	<li>Pipette 3-5 mL de meio pré-aquecido contendo 10 μM Y-27632 dicloridor em cada poço enquanto escova suavemente contas fora do filme parafina. NOTA: Como volume mínimo, recomenda-se 3 mL. Para um número máximo de contas (N=5) por poço, recomenda-se 5 mL de médio.</li>
	<li>Coloque a placa dentro de uma incubadora co2 (5% CO2, 37 °C).</li>
	<li>Troque a mídia organoide a cada 3-4 dias. Após 5-7 dias, use o meio cultural sem 10 μM Y-27632 dihidrocloreto para manter as culturas.</li>
</ol>6. Na costura de imagem de organoides vivo usando microscópio8
NOTA: Certos microscópios são incapazes de alcançar o perímetro externo da placa celular (parede de borda); portanto, sugerimos usar os poços próximos ao perímetro da placa celular quando a costura da imagem.
<ol><li>Coloque a placa de cultura celular em uma posição ascendente no suporte da placa no microscópio Keyence.</li>
	<li>Coloque a lente no centro da cúpula alvo.</li>
	<li>Configure o processo de costura automática selecionando o número dos quadros. Por exemplo, 3 x 3 ou 5 x 5 podem ser escolhidos para gerar 9 imagens ou 25 imagens no total.</li>
	<li>Pressione o botão de captura para iniciar o processo de imagem.</li>
	<li>Abra o software do visualizador de imagens e carregue um grupo de imagens tiradas pelo passo 4.</li>
	<li>Clique em Costura de Imagem para criar uma imagem costurada de alta resolução. NOTA: A captura de imagens em série 9 ou 25 pode ser realizada por configuração manual ou automática para focar as células.</li>
</ol>7. Processamento organoide para histologia: o método de rotação de agarose
NOTA: Este protocolo é adaptado de uma publicação anterior de Vlachogiannis et al.7. Adicionamos um passo envolvendo a incorporação de agaroses para incorporar com sucesso todas as populações de organoides.
<ol><li>Remova a mídia existente do poço. Tenha cuidado para não aspirar as cúpulas da membrana do porão.</li>
	<li>Adicione um volume igual (igual ao volume de mídia removido da etapa 1) de solução de recuperação celular e incubar por 60 min a 4 °C.</li>
	<li>Desalojar a cúpula da membrana do porão usando uma pipeta e esmague a cúpula da membrana do porão usando uma ponta de pipet. Colete a solução de cúpula dissociada e recuperação celular em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g e 4 °C por 5 min.</li>
	<li>Remova o supernatant (solução de recuperação celular). Salve todos os supernatantes em tubos separados até o final, quando a presença de organoides for confirmada na etapa final de peloção.</li>
	<li>Adicione o volume desejado (Tabela 3) de PBS frio e delicadamente pipette para cima e para baixo para perturbar mecanicamente a pelota.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g e 4 °C por 5 min.</li>
	<li>Remova o supernatant (PBS).</li>
	<li>Fixe a pelota em um volume combinado (por exemplo, 500 μL para uma pelota da condição de cultura da placa de poço 24, Tabela 3) de 4% PFA por 60 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a fixação, centrífuga sem 300 x g e 4 °C por 5 min.</li>
	<li>Retire o supernatant (PFA).</li>
	<li>Lave com volume combinado (por exemplo, 500 μL para uma pelota da condição de cultura da placa de 24 poços, Tabela 3) de PBS e centrífuga em 300 x g e 4 °C por 5 min.</li>
	<li>Prepare a garose quente (2% agarose na PBS). NOTA: Aqui, as pelotas de células para seções congeladas podem ser diretamente resuspensas em 200 μL de composto OCT sem mais passos no Protocolo 7.</li>
	<li>Resuspender a pelota de célula em 200 μL de agarose (2% na PBS).<ol>
<li>Imediatamente após a adição de agarose, retire delicadamente a pelota celular da parede do tubo de 1,5 mL usando a agulha de 25 G presa à seringa de 1 mL. Como mostrado na Figura 3,se a pelota celular não estiver fisicamente separada da parede do tubo de 1,5 mL, então há o risco de perder toda ou parte da pelota celular durante o processo de incorporação de agarose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Espere até que a agarose de 2% na PBS seja completamente solidificada.</li>
	<li>Desadere o bloco de agarose solidificado do tubo de 1,5 mL usando uma agulha de 25 G presa à seringa de 1 mL.</li>
	<li>Transfira o bloco de agarose separado contendo a pelota celular para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Encha o tubo com 70% de EtOH e prossiga ainda mais usando o protocolo convencional para desidratação tecidual e incorporação de parafina.</li>
</ol>8. Histologia e citoquímica imunofluorescente (IFC) de organoides
<ol><li>Selecione os slides para histologia ou IFC.</li>
	<li>Antes de início do processo de coloração, descubra onde as células estão localizadas no slide e desenhe um círculo ao redor das células do slide usando um marcador.</li>
	<li>Desenhe o perímetro ao redor da borda ou pensionista do slide e onde os círculos estão localizados no slide em um notebook de laboratório para registrar suas localizações.</li>
	<li>Realizar a coloração desejada. NOTA: Durante este processo, círculos marcados desaparecem, uma vez que o fabricante regular não é resistente aos produtos químicos. Mesmo alguns marcadores permanentes de histologia podem ser apagados durante o processo de coloração.</li>
	<li>Após o processo de coloração, coloque o slide sobre o desenho no notebook de laboratório para encontrar os locais das células no slide.</li>
</ol>

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</ol>

Sanghee Lee e Christina A.M. Jamieson são os editores convidados da JoVE Methods Collection.

Organoides 3D derivados da metástase óssea paciente células cancerígenas de próstata ainda são relativamente raras. Aqui, descrevemos estratégias e protocolo otimizado para obter organoides derivados de pacientes 3D (PDOs) de BMPC. Além disso, são descritos protocolos para proteger os organoides em amostras com menor densidade celular para análise ifc e IHC. Fenótipos diferenciais na forma de cisto, esferoides e organoides mais complexos indicam que esse protocolo fornece condições culturais que permitem que populações d...

Organoides culturais tridimensionais têm chamado a atenção por seu potencial de recapitular a arquitetura in vivo, funcionalidade celular e assinatura genética de seus tecidos originais1,2,3,4,5. Mais importante, organoides 3D estabelecidos a partir de tecidos tumorais pacientes ou modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) oferecem oportunidades inestimáveis para entender mecanismos de sinalização celular sobre tumorigênese e determinar os efeitos do tratamento medicamentoso em cada população celular6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 desenvolveram um protocolo padrão para o estabelecimento de organoides de próstata humano e rato, que tem sido amplamente adotado no campo da urologia. Além disso, foram dedicados esforços significativos para maior caracterização de organoides 3D e para compreender os mecanismos detalhados de tumorigênese e metástase4,12,14,15. Além do protocolo previamente estabelecido e amplamente aceito para culturas de organoides 3D, descrevemos aqui um protocolo passo a passo para a cultura 3D do PDO usando três métodos de doming diferentes em condições culturais otimizadas.
Neste manuscrito, os organoides 3D foram estabelecidos como um modelo ex vivo de câncer de próstata metastático ósseo (BMPC). As células utilizadas para essas culturas vieram da série DeSone câncer de próstata San Diego (PCSD) e foram derivadas diretamente de tecidos tumores metastáticos do câncer de próstata paciente (PCSD18 e PCSD22) ou modelos de tumor derivados do paciente (PDX) (amostras chamadas PCSD1, PCSD13 e PCSD17). Como a metástase óssea espontânea das células cancerígenas da próstata é rara nos modelos de camundongos geneticamente modificados16,usamos injeção intra-femoral direta (IF) de células tumorais humanas em rag2 masculino-/-γc-/- camundongos para estabelecer os modelos PDX de câncer de próstata metastáticoósseo 17.
Uma vez que os organoides 3D são estabelecidos a partir de células tumorais heterogêneas ou xenoenxertos derivados do paciente, é essencial confirmar sua identidade como células tumorais de próstata e determinar seus fenótipos nas culturas organoides 3D. A química da imunofluorescência (IFC) permite a visualização da expressão proteica in situ em cada célula, muitas vezes indicando as funções potenciais para populações específicas de células2,4. Em geral, os protocolos IFC para uma grande maioria das amostras, incluindo tecidos e células, são simples e totalmente otimizados. No entanto, a densidade celular e o número de organoides podem ser significativamente menores do que o da cultura convencional. Portanto, o protocolo IFC para organoides requer etapas adicionais para garantir o processamento adequado e incorporação em parafina para todos os organoides nas amostras. Descrevemos etapas adicionais para um processo de preincorporação de agarose e dicas para rotular a localização de organoides seccionados no slide que aumenta a taxa de sucesso do IFC em organoides especialmente quando as amostras de organoides têm menor densidade celular do que o desejado.

<table><tbody><tr><td>1 mL Pipettman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringa</td><td>BD Seringa</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 1,5 mL</td><td>Spectrum Lab Products</td><td>941-11326-ATP083</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 25G BD</td><td>Agulha PrecisionGlide</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído (PFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol (EtOH)</td><td>VWR</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>adDMEM</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - para citoqueratina 5</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo para citoqueratina 8</td><td>Biolegend</td><td>904801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem de bioluminescência, IVIS 200</td> Placa de Cultura de Células <td>IVIS 200</td><td></td> <td>da Perkin Elmer Inc</td></tr><tr><td>- 24 poços</td> Placa de Cultura de Células <td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>- 48 poços</td> Placa de Cultura de Células <td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr> - Solução de Dissociação de Células <tr><td>Costar</td><td>3516</td><td></td><td>de 6 poços</td></tr><tr><td>, Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Recuperação de Células</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de Células</td><td>Sarstedt</td><td>83.180</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células</td><td>Falcon (Corning)</td> <td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>3546</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073-1ML</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Corning/Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Denville Scientific</td><td>S728696</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi</td><td>130-0420401</td><td></td></tr><tr><td>Separador de Coluna Magnética: Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Marcador</td><td>VWR</td><td>52877-355</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Fator de Crescimento Reduzido)</td><td>Mediatech Inc. (Corning)</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>Matrigel (alta concentração)</td><td>BD (Fisher Scientific)</td><td>CB354248</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem de microscópio, Keyence</td><td>BZ-X800 (software mais recente) BZ-X700 (software antigo)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio, Keyence</td><td>BZ-X700 (modelo 2016-2017)/BZ-X710 (modelo 2018-2019)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de depleção de células de camundongo</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>OCT Composto</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Mediatech Inc. (Corning)</td> <td>30-002-CI-1</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta para 1 mL (Pontas Azuis)</td><td>Fisherbrand Redi-Tip</td><td>21-197-85</td><td></td></tr><tr><td>Êmbolo (de seringa de 3 mL)</td><td>BD Seringa</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandina E2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 1</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>SB2021190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Pequena Mesa de Mesa Centrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002426</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Sci</td><td>2320</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento e análise de organoides tridimensionais (3d) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus xenoenxertos

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Cultura tridimensional (3D) de organoides de tumores de pacientes humanos e modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) de câncer de próstata, referidos como organoides derivados do paciente (PDO), são um recurso inestimável para estudar o mecanismo de câncer de próstata tumorigênese e metástase do câncer de próstata. Sua principal vantagem é que eles mantêm a heterogeneidade genômica e funcional distinta do tecido original em comparação com as linhas celulares convencionais que não. Além disso, culturas 3D de PDO podem ser usadas para prever os efeitos do tratamento medicamentoso em pacientes individuais e são um passo para a medicina personalizada. Apesar dessas vantagens, poucos grupos utilizam rotineiramente esse método em parte devido à ampla otimização das condições culturais pdo que podem ser necessárias para diferentes amostras de pacientes. Demonstramos anteriormente que nosso modelo de Metástase Óssea do câncer de próstata PDX, PCSD1, recapitulou a resistência da metástase óssea do paciente doador à terapia antiandgênica. Usamos organoides PCSD1 3D para caracterizar mais os mecanismos de resistência antiandrogênica. Seguindo uma visão geral dos estudos publicados atualmente dos modelos PDX e PDO, descrevemos um protocolo passo a passo para a cultura 3D de PDO usando esferas de membrana de porão de domed ou flutuante (por exemplo, Matrigel) em condições de cultura otimizadas. Também são descritas imagens de pontos vivos e processamento celular para histologia. Este protocolo pode ser ainda mais otimizado para outras aplicações, incluindo mancha ocidental, co-cultura, etc. e pode ser usado para explorar características do PDO cultivado cultivado em 3D relativos à resistência a medicamentos, tumorigênese, metástase e terapêutica.

Os organoides 3D foram criados com sucesso a partir de um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PcD) de câncer de próstata metastático ósseo (BMPC), bem como diretamente do tecido do câncer de próstata metastático do paciente(Figura 4). Resumidamente, nossos modelos PDX de BMPC foram estabelecidos por injeção intra-femoral (IF) de células tumorais em rag2 masculino-/- c-/- camundongos e, em seguida, tumores PDX foram colhidos e processados como descrito neste manu...

Culturas tridimensionais de amostras de BMPC pacientes e xenoenxertos de câncer de próstata metastático mantêm a heterogeneidade funcional de seus tumores originais resultando em cistos, esferoides e organoides complexos, semelhantes a tumores. Este manuscrito fornece uma estratégia de otimização e protocolo para a cultura 3D de amostras derivadas de pacientes heterogêneos e sua análise utilizando IFC.

Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Descrevemos estratégias e protocolos passo a passo para estabelecer organoides 3D em série derivados do câncer de próstata metastático. Nossos protocolos otimizados são práticos para configurar culturas 3D para experimentos usando material inicial limitado diretamente de pacientes ou tecidos tumorais de xenoenxerto derivados do paciente. Os organoides 3D deste protocolo podem ser usados como modelos ex vivo para entender mecanismos básicos da patologia do câncer de próstata metastático ósseo e para testar o tratamento.A mídia de cultura organoide 3D neste protocolo é específica para células derivadas da próstata. Outras partes de nossos protocolos são aplicáveis a diferentes tipos de tecidos tumorais e locais metastáticos. A técnica de doming pode ser a parte mais difícil deste processo.A prática da técnica de doming garantirá um tamanho consistente da mistura de organoides, mídia e Matrigel, e minimizará a formação de bolhas durante a suspensão da amostra. Demonstrar visualmente este método fornece uma melhor compreensão de como lidar com o Matrigel viscoso para culminar com sucesso organoides de menor densidade a partir de um baixo número de células. Comece reutilizando a pelota de célula no volume apropriado da membrana do porão para uma configuração de placa de 24 poços.Pipeta para cima e para baixo suavemente para garantir que as células sejam resuspended, em seguida, pipeta o volume apropriado da suspensão celular para o centro de uma placa de cultura de tecido pré-aquecido. Inverta a placa e coloque-a imediatamente de cabeça para baixo na incubadora de cultura celular fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Pipeta o volume apropriado de meio pré-aquecido contendo 10 micromolar Y-27632 dihidrocloreto em cada poço.Para formar uma cúpula flutuante da cúpula redonda anexada, retire a cúpula da placa usando um raspador de células. Corte um pedaço de dois por quatro polegadas de filme de parafina e coloque-o em cima dos divots de uma ponta vazia segurando rack de uma caixa de ponta de pipeta de plástico de um mililitro. Use um dedo indicador de luvas para pressionar suavemente o filme de parafina para rastrear os divots tomando cuidado para não romper o filme.Pulverize o filme de parafina com 70% de etanol e ligue a lâmpada UV no capô da cultura celular para esterilizar o filme preparado por pelo menos 30 minutos. Enquanto isso, resuspense as células pré-processadas em 20 microliters de membrana do porão. Em seguida, pipeta a suspensão para os divots formados no filme de parafina.Coloque as contas solidificadas e o filme de parafina em uma placa de seis poços e pipeta de três a cinco mililitros de meio pré-aquecido contendo 10 micromolar Y-27632 dihidrocloida em cada poço enquanto escova suavemente as contas do filme de parafina. Para processar os organoides para histologia, remova a mídia existente do poço tomando cuidado para não aspirar as cúpulas de membrana do porão. Adicione um volume igual de solução de recuperação celular e incubar a placa por 60 minutos a quatro graus Celsius.Após a incubação, desaloja a cúpula da membrana do porão usando uma pipeta e esmague-a com uma ponta de pipeta. Colete a cúpula dissociada e a solução de recuperação celular em um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 300 vezes g em quatro graus Celsius por cinco minutos, em seguida, remova o supernante e reserve-o.Guarde todos os supernantes até o passo final quando a presença de organoides for confirmada no volume desejado de PBS frio e pipeta suavemente para cima e para baixo para desalojar mecanicamente a pelota sem interromper os organoides. Repita a centrifugação e remova o sobrenatante. Fixar a pelota em um volume combinado de 4%PFA por 60 minutos em temperatura ambiente.Após a fixação, repita a etapa de centrifugação e a lavagem do PBS. Em seguida, adicione lentamente 200 microliters de 2%de agarose quente e imediatamente, mas suavemente desprender a pelota celular da parede do tubo sem interrompê-la usando uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de um mililitro. Para o método de rotação de garose, é fundamental separar a pelota celular da parede do tubo logo após a adição de agarose usando uma agulha de calibre 25.Uma vez que a agarose tenha se solidificado completamente, retire-a do tubo com uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de um mililitro e transfira-a para um novo tubo de 1,5 mililitro. Encha o tubo com 70% de etanol e proceda com o protocolo convencional de desidratação tecidual e incorporação de parafina. Este protocolo foi usado com sucesso para estabelecer organoides 3D de modelos de xenoenxerto derivados do paciente do câncer de próstata metastático ósseo, bem como diretamente do tecido cancerígeno.Os organoides apresentaram diferentes fenótipos que se manifestaram como cistos, esferoides e organoides de maior complexidade. Uma cúpula inteira de membrana de porão e organoides pode ser vista em uma imagem costurada a partir de 25 imagens de ampliação de alta resolução e 10X. Para investigar melhor o tecido tumoral, a citoquímica imunofluorescente foi realizada em uma seção de cinco micrômetros de parafina de organoides visando o marcador de células epiteliais basais citokeratin-5, marcador de célula epitelial luminal cytokeratin-8 e DAPI.Este protocolo pode ser otimizado para outras aplicações como manchas ocidentais, cocultura e citometria de fluxo para explorar características de organoides 3D e os efeitos dos tratamentos medicamentosos. Esses experimentos poderiam abordar mecanismos de resistência a medicamentos e a eficácia de novas terapêuticas isoladamente ou em combinação com as terapias atuais. Os organoides 3D desta técnica retêm heterogeneidade entre sujeitos e intra-sujeitos e, portanto, são um modelo mais preciso da doença em pacientes.Essa técnica abre caminho para que os pesquisadores explorem mecanismos de resistência a medicamentos, tumorigênese, metástase e terapêutica que podem ser mais previsíveis da progressão da doença em pacientes e sua resposta à terapia.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Organoides derivados de tumores são um tipo de modelo de cultura de células 3D que pode manter as características patológicas e a linhagem celular específica de órgãos de tumores. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem organoides a partir de um tumor de próstata a partir de um modelo de camundongo geneticamente modificado.

Preparação de organoides a partir de tumores: um modelo de tumor 3D in vitro

Este manuscrito detalha um método usado para gerar xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de próstata (PDXs) a partir de células tumorais circulantes (CTCs). A geração de modelos PDX a partir de CTCs fornece um modelo experimental alternativo para estudar o câncer de próstata; o tumor mais comumente diagnosticado e uma causa frequente de morte por câncer em homens.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

O câncer de próstata é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Um modelo de câncer ortotópico fornece uma abordagem útil para entender a biologia do câncer de próstata e avaliar a eficácia dos regimes terapêuticos. Este protocolo descreve as etapas detalhadas necessárias para estabelecer um modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata.

Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

Aqui, apresentamos um protocolo para orientar a manipulação de organoides humano de próstata primário, em seguida, sugerir pontos de extremidade para avaliar o fenótipo. Semeadura, manutenção de cultura, recuperação de gel da matriz, quantificação morfológica, incorporação e seccionamento, FFPE seccionamento, toda a montagem coloração e aplicação de ensaios comerciais são descritos.

Manipulação e avaliação da cultura de organoides humano de próstata primário

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Apresentado aqui é um protocolo para estudar as respostas farmacológicas em organóides epitelia da próstata. Organóides se assemelham à biologia in vivo e recapitulam a genética do paciente, tornando-os sistemas modelo atraentes. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de próstatas wildtype, modelos de camundongos geneticamente modificados, tecido humano benigno, e câncer de próstata avançado.

Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas

Um método é descrito para criar organoides usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX) para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Os tumores PDX foram colhidos/processados em pequenos pedaços mecanicamente ou enzimáticamente, seguidos pelo método dos Clevers para cultivar organoides tumorais que foram passagem, criopreservados e caracterizados contra o PDX original.

Criando pares de modelos derivados do paciente in vivo/in vitro de PDX e Organoides Derivados de PDX para pesquisa de farmacologia do câncer

Os organoides derivados do paciente (PDOs) são uma ferramenta poderosa na pesquisa de câncer translacional, refletindo tanto a heterogeneidade genética e fenotípica da doença quanto a resposta a terapias anticânculas personalizadas. Aqui, um protocolo consolidado para gerar PDOs de câncer de bexiga primário humano em preparação para a avaliação de análises fenotípicas e respostas medicamentosas é detalhado.

Cultura dos Organoides do Câncer de Bexiga como Ferramentas de Medicina de Precisão

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

Os organoides tumorais revolucionaram a pesquisa do câncer e a abordagem da medicina personalizada. Eles representam um modelo de tumor clinicamente relevante que permite aos pesquisadores ficar um passo à frente do tumor na clínica. Este protocolo estabelece organoides tumorais a partir de amostras de tecido tumoral pancreático fresco e xenoenxertos derivados do paciente de origem adenocarcinoma pancreático.

Estabelecimento de organoides tumorais derivados do câncer de pâncreas e fibroblastos a partir de tecido fresco

A heterogeneidade do câncer de próstata e a resistência ao tratamento continuam sendo desafios. Descrevemos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes (PDOs) que preservam as principais características do tumor parental. Este modelo padronizado suporta a triagem de medicamentos e os avanços da medicina de precisão.

Estabelecimento e manutenção de organoides de câncer de próstata derivados de pacientes: um protocolo experimental detalhado

Aprenda a estabelecer organoides 3D derivados de pacientes com câncer de próstata metastático ósseo. Este protocolo otimizado permite criar modelos ex vivo para estudar patologia e testar tratamentos.

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Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

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