Name: Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a produzir conjuntos de motores moleculares de dineína e cinesina em nanoestruturas de DNA origami para observação de molécula única. Este método permite estudar mecanismos de transporte celular com precisão.

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Agradecemos K. Chau, J. Morgan, e A. Driller-Colangelo por contribuir para as técnicas do chassi de origami de DNA segmentada. Também agradecemos aos antigos membros dos laboratórios Reck-Peterson e Shih por discussões úteis e contribuições para o desenvolvimento original dessas técnicas. Agradecemos a J. Wopereis e o Smith College Center for microscopia and Imaging e L. Bierwert e o Smith College Center for molecular biology. Nós reconhecemos agradavelmente o programa da NSF MRI para a aquisição de um microscópio de TIRF.

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<li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

As técnicas de construção molecular do DNA origami proporcionam uma maneira única de construir conjuntos de motores com arquiteturas definidas, números de motores e tipos, possibilitando estudos de como o comportamento emergente surge a partir de configurações específicas do motor31. Como os estudos estruturais e celulares continuam a elucidar exemplos de motores citoesqueléticos que trabalham em equipes, técnicas para isolar e investigar os mecanismos biofísicos e bioquímicos dos motores em conju...

A dynein e a cinesina são proteínas do motor citoesquelético responsáveis por inúmeras funções em células eucarióticas1. Convertendo a energia química da hidrólise de ATP em trabalho produtivo, estes motores translocam em microtúbulos para transportar e distribuir várias cargas intracelulares. Eles também coordenam os rearranjos intracelulares maciços associados à mitose, onde exibem forças orquestradas que contribuem para o posicionamento e separação dos cromossomas. Ensaios estruturais, bioquímicos e biofísicos, incluindo observações de moléculas únicas, revelaram os mecanismos desses motores no nível individual (bem revisado em trabalhos anteriores2,3,4). No entanto, muitas das tarefas dos motores exigem que trabalhem em pequenos conjuntos de tipos de motor semelhantes e mistos. Comparativamente menos é compreendido sobre os mecanismos que coordenam a atividade e a motilidade emergente final destes conjuntos5,6. Essa lacuna de conhecimento é devida, em parte, à dificuldade em criar conjuntos com características controláveis, como tipo de motor e número de cópia. Durante a última década, as técnicas de construção molecular de DNA origami têm sido empregadas para resolver este problema. Para os motores baseados em microtúlulas, alguns exemplos dessas investigações incluem a única molécula de observações de conjuntos de dynein citoplasmático-17,8,9, dynein intraflagellar11, vários motores de cinesina12,13, e misturas de ambos os dyneins e kinesins7,14,15. Aqui, nós fornecemos detalhes da purificação e oligonucleotide rotulagem de motores de levedura7,16,17,18,19,20, o dobradura e purificação de origami de DNA segmentada com conformidade sintonável8, e a imagem dos motores de levedura impulsionando as estruturas do chassi7,18.
Construir conjuntos de motor para a observação in vitro da molécula única exige três esforços preliminares. O primeiro é a expressão, purificação e rotulagem de construções motoras adequadas para anexar ao DNA origami. O segundo é a produção e purificação de estruturas de origami DNA definido (muitas vezes denominado "chassis"). E a terceira é a conjugação dos motores à estrutura do chassi seguida da observação usando a microscopia interna total da fluorescência da reflexão (TIRF). Aqui, nós fornecemos protocolos estabelecidos para este processo para os motores microtubule-baseados de recombinação purificados do fermento Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. os conjuntos de motor baseados em Origami de DNA foram investigados usando ambos os cinesina recombinante15 e dynein7,8,18 construções produzidas neste sistema de expressão de levedura16 ,17,18,19. Este protocolo é válido para estas construções, dado que são controlados pelo promotor induzido galactose, e fundidos aos mesmos Tag da proteína para a purificação (linker do protease de ZZ e de TEV) e para a conjugação do oligo do ADN (SNAPtag).
Cepas específicas de levedura produzem construções motoras específicas. Por exemplo, o dynein usado para estudar o papel da conformidade da carga foi purified da tensão RPY10847,8. Em geral, as cepas contendo construções motoras com as modificações genéticas apropriadas para expressão e purificação podem ser solicitadas a partir dos laboratórios que publicaram o uso desses motores. Construções com novos atributos como mutações ou Tags podem ser feitas usando técnicas genéticas recombinantes, como a transformação de acetato de lítio21 e kits comerciais. Os protocolos detalhados para criar proteínas de motor modificadas no fermento para estudos da única molécula foram publicados19. Além dos motores que estão sendo fundidos ao SNAPtag, os oligos usados para rotular os motores devem ser conjugados ao substrato SNAP, a benzilguanina (BG); os protocolos previamente publicados descrevem a formação e a purificação de conjugados de BG-oligo18. A estratégia global descrita aqui também foi empregada para motores baseados em Actin (ver trabalhos anteriores para exemplos22,23,24), e motores purificados de outros organismos e sistemas de expressão (ver anterior trabalhos para exemplos7,9,10,11,12,13,14).
Microtúbulos polimerizados (MTs) são utilizados nestes experimentos em dois procedimentos diferentes. A purificação da afinidade do MT de motores funcionais exige o MTs que não são etiquetados com outros grupos funcionais, quando o ensaio do TIRF da motilidade do motor-Ensemble exigir o MTs etiquetado com a biotina e os Fluorophores. Em todos os casos, os MTs são estabilizados com Taxol para evitar a desnaturação. A etapa da purificação da afinidade do MT é usada para remover todos os motores não-motile com uma afinidade elevada do MT, porque estes motores podem alterar a motilidade do conjunto se conjugados a um chassi. Durante este processo, os motores activos desligam os MTs e permanecem em solução, enquanto os motores de ligação apertada giram para baixo no pellet MT. Isso ajuda a garantir que todos os motores do chassi sejam de uma população ativa.
Uma variedade de estruturas do origami do ADN foi usada para estudar conjuntos do motor do cytoesquelético. Como a compreensão mecanicista do transporte de Ensemble aumentou, as estruturas de DNA origami empregadas em experimentos têm crescido em complexidade. Em princípio, qualquer estrutura poderia ser adaptada para este fim, desde que seja modificada para incluir sítios de fixação de ADN de ligação única para motores e fluoróforos. Os projetos e os atributos específicos do chassi podem ser úteis para sondar perguntas particulares sobre o comportamento emergente de conjuntos dos motores. Por exemplo, hastes rígidas têm sido usadas para desenvolver o conhecimento fundamental de como o número de cópias afeta o transporte por equipes de dyneins e kinesins7,15,18e 2D plataformas têm sido usadas para estudar miosina Ensemble navegação das redes actina22. As estruturas com flexibilidade variável ou sintonizável foram usadas para compreender as funções do acoplamento elástico entre motores e para sondar como a sincronização de piso afeta a motilidade8,24. Mais recentemente, as estruturas esféricas estão sendo usadas para obter a introspecção em como as limitações geométricas à ligação da motor-trilha afetam a dinâmica da motilidade25.
Neste protocolo, nós oferecemos etapas específicas para experiências do conjunto no chassi segmentado com rigidez variável. Os locais de ligação no chassi são chamados às vezes como "punhos", quando as seqüências complementares do ADN que ligam estes punhos forem denominadas "antihandles". O número de motores nestes chassis é determinado pelo qual os segmentos contêm grampos extendidos do punho com complementaridade ao oligo do antihandle nos motores oligo-etiquetados. O uso de diferentes sequências de alça em diferentes segmentos permite a vinculação de diferentes tipos de motores a locais específicos no chassi. O chassi detalhado aqui é compor de 7 segmentos rígidos sequenciais, cada um compreendido de 12 hélices dobro-encalhado do ADN arranjados em 2 anéis concêntricos8. Os segmentos rígidos contêm os punhos do motor e são conectados através das regiões que podem ser o ADN único-encalhado flexível ou o ADN dobro-encalhado rígido, dependendo da ausência ou da presença, respectivamente, de grampos do "linker". A conformidade da estrutura do chassi é determinada assim pela presença ou pela ausência destes grampos do "linker". Veja os relatórios precedentes para mais detalhes e seqüências específicas8do ADN. Além disso, vários métodos podem ser usados para purificar o chassi26. O método de centrifugação de gradiente de glicerol taxa-zonal27 é descrito aqui.

<table><tbody><tr><td>Tubo de Fundo Redondo de 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de tubulina marcada com biotina: cérebro suíno, >99% puro</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>T333P-A</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-BSA</td><td>Sigma</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Garrafa, Policarbonato, 250 mL, 62 x 120 mm</td><td>Garrafa de 356013</td><td></td><td></td>Beckman Coulter</tr><tr><td>, com Montagem de Tampa, Policarbonato, 10.4 mL, Unidade</td><td>de Filtro Centrífugo 355603</td><td></td><td>Beckman Coulter</td> de 16 x 76 mm</tr><tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td> Colunas de <td></td> Cromatografia Micro <td>Bio-Spin 17096901</td><td></td>GE</tr><tr><td>Healthcare, vazias</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204EDU</td><td></td></tr><tr><td>P8064 Scaffold</td><td>Tilibit</td><td>2 mL a 400nM</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Colunas de Cromatografia</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>ProTev Protease</td><td>Promega</td><td>V6101</td><td></td></tr><tr><td>Fita Dupla Face Scotch com Dispensador</td><td>amazon.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-500 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17061310</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>434302</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Coloração de DNA Segura</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína de tubulina (>99% pura): cérebro suíno</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>T240-B</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina, HiLyte 647</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>TL670M-A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultra-claros</td><td>Beckman Coulter</td><td>344090</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de conjuntos de motor de dynein e de kinesin em nanostructures do adn origami para a única observação da molécula

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Os motores do citoesqueleto são responsáveis para uma grande variedade de funções em pilhas eucarióticas, incluindo o mitosis, o transporte da carga, a motilidade celular, e outro. Muitas dessas funções exigem motores para operar em conjuntos. Apesar de uma riqueza de conhecimento sobre os mecanismos dos motores citoesqueléticos individuais, comparativamente menos se sabe sobre os mecanismos e comportamentos emergentes de conjuntos de motores, exemplos dos quais incluem mudanças na processividade do conjunto e velocidade com alterando o número do motor, a localização e a configuração. A nanotecnologia de DNA estrutural, e a técnica específica de DNA origami, permite a construção molecular de arquiteturas bem definidas de conjuntos de motores. A forma das estruturas da carga assim como o tipo, o número e a colocação dos motores na estrutura podem tudo ser controlados. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para produzir estes conjuntos e observá-los usando a microscopia de fluorescência interna total da reflexão. Embora essas técnicas tenham sido especificamente aplicadas para os motores citoesqueléticos, os métodos são generalizáveis para outras proteínas que se reúnem em complexos para realizar suas tarefas. Globalmente, o método de DNA origami para a criação de conjuntos bem definidos de proteínas do motor fornece uma poderosa ferramenta para dissecação dos mecanismos que levam ao comportamento motile emergente.

Purificações bem-sucedidas de motores e estruturas de chassis foram ensaiadas por eletroforese em gel. A análise de SDS-PAGE confirmou a extração bem sucedida de dynein do fermento (Figura 2), porque o filtrado final coletado na etapa 2.3.7 mostrou uma faixa desobstruída, afiada na posição de ~ 350 kDa. Como esperado, esta faixa do dynein era ausente do flowthrough e da lavagem que removeram proteínas indesejadas, e os grânulos de que o dynein foi clivada. A ...

O objetivo deste protocolo é formar conjuntos de motores moleculares em nanoestruturas de DNA origami e observar a motilidade do conjunto usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total.

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Nosso protocolo foi projetado para sondar os mecanismos biofísicos que regem o transporte de carga por equipes de proteínas motoras citoesqueletal idênticas ou opostas. Usando origami de DNA para construção molecular, este método pode escolher o tipo, número e localização dos motores em formas de carga precisamente definidas. Embora este protocolo se concentre nos motores baseados em microtúbulos dynein e quinase, ele é adaptável à miosina motora baseada em actina, bem como a outros sistemas proteicos que funcionam cooperativamente.Um aspecto desafiador deste protocolo é manter a integridade e a atividade das proteínas motoras durante todo o processo de purificação, pois são sensíveis ao calor e à força mecânica. Para induzir o crescimento e a expressão da proteína motora através do promotor galactose, use uma varinha de inoculação estéril para esticar a levedura congelada de interesse em uma placa de cultura levedura-peptone-dextrose para uma incubação de três a quatro dias a 30 graus Celsius. No quarto dia da cultura, quando a densidade óptica em 600 nanômetros está entre 1,5 e 2, recolhe as células de levedura por centrifugação, e resuspensa a pelota na água para lavá-las e cons

production-dynein-kinesin-motor-ensembles-on-dna-origami

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve um método para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em moléculas de DNA em loci específicos usando imagens de molécula única. Esses condensados são formados devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, que permitem o recrutamento da RNA polimerase II e o aumento da transcrição gênica.

Imagem de molécula única para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em cortinas de DNA

Origami de DNA é um método poderoso para a fabricação de objetos em nanoescala precisos, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui, nós descrevemos como DNA origami pode ser utilizado para criar um robô robótica capaz de sentir sinais biológicos e responder pela forma de deslocamento, posteriormente retransmitida para o efeito desejado.

Projetando um robô Bio-responsivo de DNA Origami

O origami de DNA é um método poderoso para fabricar objetos precisos em nanoescala, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui descrevemos um protocolo para o dobramento de um robô bio-responsivo a partir de origami de DNA, sua purificação e coloração negativa para imagens microscópicas eletrônicas de transmissão (TEM).

Dobragem e Caracterização de um robô Bio-responsivo a partir de ADN de Origami

Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

Descrevemos o protocolo detalhado para projeto, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para um rack de acordeão de DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6.

Design e síntese de um Rack de acordeão de DNA reconfigurável

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para ligadura de T4 e purificação de página desnaturação de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento e análise de página nativa de telhas circulares, montagem e imagens de AFM de nanoestruturas de DNA 1D e 2D, bem como agarose gel eletroforese e centrifugação purificação de nanoestruturas de DNA finitas.

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

Apresentamos um protocolo para construir naves moleculares, onde motor proteínas cinesina aderida a superfície propelir microtúbulos tintura-rotulados. Interações fracas da kinesins com a superfície permite sua fixação reversível para isso. Isto cria um sistema de nanoescala que exibe dinâmica montagem e desmontagem de seus componentes, mantendo sua funcionalidade.

Montagem Molecular vaivéns alimentados por reversivelmente ligado Kinesins

Aqui, descrevemos um protocolo para criar nanoestruturas inorgânicas discretas e precisas em substratos usando formas de DNA origami como modelos orientadores. O método é demonstrado através da criação de antenas de ouro plasmônicas em forma de bowtie em um substrato transparente (safira).

DNA origami-mediada substrato Nanopatterning de estruturas inorgânicas para aplicações de sensoriamento

A cinesinismo mitostática bi-direcional-5 Cin8 acumula-se em aglomerados que se dividem e se fundem durante sua motilidade. O acúmulo em clusters também altera a velocidade e a direcionalidade do Cin8. Aqui, é descrito um protocolo de ensaios de motilidade com Cin8-GFP purificado e análise de propriedades motile de moléculas únicas e aglomerados de Cin8.

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Este estudo detalha a purificação do KIF1A(1-393LZ), membro da família das cinesinas-3, utilizando o sistema de expressão do Sf9-baculovírus. A análise in vitro de deslizamento de molécula única e multimotor desses motores purificados exibiu propriedades de motilidade robustas comparáveis aos motores do lisado de células de mamíferos. Assim, o sistema Sf9-baculovírus é passível de expressar e purificar a proteína motora de interesse.

Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

Aprenda a produzir conjuntos de motores moleculares de dineína e cinesina em nanoestruturas de DNA origami para observação de molécula única. Este método permite estudar mecanismos de transporte celular com precisão.

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

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