Fluorescência de reflexão interna total de alta taxa de transferência e microscopia de reconstrução óptica estocástica direta usando um chip fotônico
November 16th, 2019
Microscopia óptica baseada em chip é uma nova abordagem à microscopia de fluorescência e oferece vantagens na relação custo-eficácia e taxa de transferência. Aqui, os protocolos de preparação e imagem de chips são mostrados para microscopia tirf e microscopia de super-resolução baseada em localização.
O principal objetivo deste manuscrito é apresentar um procedimento de imagem da recém-desenvolvida microscopia TIRF baseada em chip fotônico e microscopia de localização de moléculas únicas, como dSTORM. O principal componente aqui é o chip fotônico que são feitos de série de guia de onda óptica. A luz dentro do guia óptico de ondas é guiada com base na reflexão interna total.
Parte da luz está presente na superfície na forma das ondas evanescentes. Essas ondas evanescentes, elas se deterioram exponencialmente longe da superfície, com uma profundidade de penetração de algumas centenas de nanômetros. Isso os torna adequados para iluminação TIRF.
A iluminação TIRF através do guia óptico de ondas está disponível em uma área extremamente grande, que é definida pela geometria do guia de ondas, e é, portanto, idealmente adequada para imagens de alto rendimento. A principal diferença entre uma configuração tradicional de TIRF e dSTORM em comparação com nossa abordagem é que usamos um chip fotônico para iluminar a amostra, em vez de enviar luz através de uma lente objetiva de imagem. Nossa abordagem desacopda a iluminação e a parte de luz da coleção, abrindo novas possibilidades de imagem.
Coloque o chip na placa de vidro Petri usando uma pinça de wafer, e cubra completamente com uma solução Hellmanex de 1%. Coloque a placa de Petri em uma placa quente a 70 graus por 10 minutos. Enquanto ainda estiver na placa quente, esfregue a superfície com um cotonete de tecido limpo.
Remova o chip da placa de Petri. Enxágüe com pelo menos 100 mililitros de água deionada. Enxágüe com pelo menos 100 mililitros de isopropanol, tomando cuidado para que o solvente não seque na superfície para evitar manchas de evaporação.
Enxágüe com pelo menos 100 mililitros de água deionada. Estouraça o chip com uma arma de nitrogênio. Prepare um PDMS de 150 micrômetros girando-o em uma placa de Petri.
Use um bisturi para cortar um quadro de aproximadamente 1,5 por 1,5 centímetros da camada PDMS. Levante a moldura da placa de Petri com uma pinça. Deposite-o em um chip limpo e polido.
A amostra está pronta para semeadura celular. Após a semeadura da célula, remova o chip da mídia. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de fluido fora da câmara PDMS.
Remova o fluido de corrente de dentro da câmara PDMS com uma tubulação, adicionando aproximadamente 60 microliters pbs limpos ao mesmo tempo. Substitua o PBS por 60 microliters limpe o PBS e deixe incubar por um minuto. Repita a etapa anterior, deixando-a incubar por cinco minutos desta vez.
Remova o PBS e substitua-o por 60 microliters da solução de corante. Deixe a amostra incubar por cerca de 15 minutos, protegendo-a da luz. Lave a amostra com PBS usando o procedimento descrito anteriormente.
Remova o PBS e substitua-o por 40 microliters do buffer de imagem ao mesmo tempo. Coloque uma mancha de cobertura por cima, impedindo que bolhas de ar se formem por baixo. Pressione suavemente a mancha de cobertura contra a câmara de imagem para remover qualquer excesso de mídia.
Use uma pipeta para remover qualquer excesso de mídia fora da tampa. Limpe a área fora da tampa com um cotonete úmido para evitar cristais formados por resíduos de mídia de imersão seca. Esta versão da configuração consiste em três componentes principais.
O microscópio com o suporte do filtro, fonte de luz branca, câmera e revólver objetivo. O estágio de acoplamento, que é um estágio piezo de três eixos, com um laser acoplado de fibra, e uma lente de acoplamento. O estágio amostral, que é um estágio manual de um eixo, com ponta e inclinação, com suporte a vácuo.
Tanto o estágio de acoplamento quanto o estágio amostral são montados em um estágio motorizado de dois eixos para tradução amostral. Coloque o chip no caminhão de vácuo, com a faceta de acoplamento em direção ao objetivo de acoplamento. Certifique-se de que o chip está aproximadamente a uma distância focal do objetivo de acoplamento.
Ligue a bomba de vácuo. Ligue o laser para um miliwatt. Ajuste aproximadamente a altura do chip para que o feixe atinja a borda dele.
Desligue o laser. Ligue a fonte de luz branca. Escolha uma lente objetiva de baixa ampliação, por exemplo, uma 10x.
Concentre o microscópio em um guia de ondas. Traduza o microscópio ao longo do guia de ondas para ver se ele está bem alinhado com o caminho óptico. Mova o microscópio para a borda do acoplamento.
Ligue o laser a um miliwatt ou menos. Traduza o microscópio ao longo da borda do acoplamento para encontrar a luz laser. Concentre o feixe na borda do chip.
Ajuste o estágio de acoplamento ao longo do caminho óptico na direção que reduz o tamanho do ponto do feixe de laser até que ele desapareça. O feixe está agora acima ou abaixo da superfície do chip. Ajuste a altura do estágio de acoplamento até que o ponto do feixe reapareçam e seja maximizado.
Repita as duas etapas anteriores até que o laser forme um ponto focal. Mova o ponto focado para o guia de ondas de interesse. Traduza o microscópio a uma curta distância da borda para que o ponto de feixe focal não seja mais visível.
Desligue a luz branca. Ajuste o contraste. Se o guia de ondas estiver guiando, a luz dispersa ao longo do guia de ondas deve ser claramente visível.
Ajuste o eixo do estágio de acoplamento para maximizar a intensidade da luz dispersa. Desligue o laser. Acenda a luz branca.
Ajuste o contraste se necessário. Navegue até a região de imagem. Concentre-se com o objetivo imaginado desejado.
Desligue a luz branca. Insira o filtro de fluorescência e gire a potência laser para um miliwatt. Ajuste o tempo de exposição da câmera para aproximadamente 100 milissegundos.
Ajuste o contraste conforme necessário. Certifique-se de que o acoplamento ainda está otimizado. Localize uma região de interesse para imagens.
Ligue o looping do palco piezo para a média de nódulos. Capture pelo menos 300 imagens. Carregue a pilha de imagens capturadas para Fiji usando uma pilha virtual.
No menu de imagem em Fiji, escolha Stacks e Z Project. Calcule a imagem TIRF escolhendo o tipo de projeção, intensidade média. Ligue o laser para um miliwatt, e ajuste o tempo de exposição da câmera para 30 milissegundos.
Ajuste o contraste e o foco. Aumente a potência do laser até que o piscar seja observado. Amplie em uma pequena região da amostra.
Ajuste o contraste. Capture algumas imagens para ver se os pisca-piscas estão bem separados. Ajuste o tempo de exposição da câmera para piscar melhor.
Ligue o looping do palco piezo. Registo uma pilha de imagens de pelo menos 30.000 quadros, dependendo da densidade piscando. Abra Fiji e carregue a pilha dSTORM como imagens virtuais.
Ajuste o contraste se necessário. Use a ferramenta retângulo para selecionar a área que deseja reconstruir. Análise open Run no plugin ThunderSTORM em Fiji.
Defina as configurações básicas da câmera no ThunderSTORM, correspondente ao seu dispositivo. Os parâmetros padrão restantes são geralmente satisfatórios. Comece a reconstrução.
A lista de localização fornecida pelo software de reconstrução é filtrada para remover localizações inespecíficas. Uma correção adicional de deriva é aplicada se necessário. A principal diferença entre imagem baseada em chip e imagem tradicional está na instrumentação e aquisição de dados.
A qualidade das imagens reconstruídas pode, portanto, ser avaliada da mesma forma que uma imagem de um microscópio comercial de super-resolução. Uma vez que os guias de onda multi-modo são usados, a imagem resultante pode, no entanto, exibir excitação inhomogênea se poucas imagens forem coletadas. Isso é mostrado no painel a.
O aumento da quantidade de padrões de excitação deve resultar em excitação inhomogênea, como mostrado no painel b. Aqui temos a imagem de célula endotelial sinusoidal hepática, com membrana plasmática fluorescentemente rotulada. Painéis a e b são imagens limitadas à difração.
O painel c mostra uma imagem limitada de difração do inset no painel b. O painel d mostra uma imagem dSTORM da mesma região. As células endoteliais sinusoidais do fígado têm fenestrações nano-dimensionadas em sua membrana plasmática, que são claramente visíveis na imagem de super-resolução no painel d.
Uma das principais vantagens da imagem de super-resolução baseada em chips é o grande campo de visão que é alcançável. Painel a mostra uma imagem dSTORM de 500 mícrons de grande porte de células endoteliais sinusoidais hepáticas com microtubulina fluorescentemente rotulada. O painel b mostra o conjunto magenta do painel a, com imagens limitadas à difração e super-resolução para comparação.
O painel c mostra o inset verde do painel a. A resolução da imagem capturada é de 77 nanômetros. Neste vídeo, realizamos um grande campo de visão TIRF e dSTORM imagens de células endoteliais sinusoidais hepáticas usando um chip fotônico para iluminação.
Nosso método é menos complexo, mais compacto e mais flexível do que a maneira convencional de realizar o TIRF usando um objetivo de microscópio de uma abertura numérica predeterminada e baixo campo de visão. A microscopia de localização, como dSTORM, é uma das várias técnicas de imagem de super-resolução que exploramos usando chip fotônico. Por exemplo, a luz pode ser muito mais restrita dentro de um material de guia de onda óptica de alto índice de refração do que é possível usando uma lente objetiva de imagem.
Esta propriedade da iluminação do chip encontrou aplicação no aumento da resolução do método de microscopia óptica baseado em intensidade e microscopia de iluminação estruturada. Além disso, os chips fotônicos também se beneficiam da miniaturização, custo-benefício e uma configuração óptica simples. Ser uma tecnologia integrada o torna compatível com outras funções ópticas no chip.
Ao todo, isso possibilita a adaptação em microscópios convencionais limitados à difração, permitindo a super resolução a um custo baixo.
Visão Geral
Este artigo apresenta uma nova técnica de microscopia óptica de super-resolução baseada em chip, focando na microscopia TIRF e microscopia de localização de molécula única. Os protocolos para preparação e imagem do chip são detalhados, destacando as vantagens desta abordagem em termos de custo-efetividade e rendimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia de fluorescência
- Imagem de super-resolução
- Tecnologia de chip fotônico
Fundamentos
- A microscopia TIRF tradicional depende da iluminação da lente objetiva.
- Os chips fotônicos utilizam guias de onda ópticas para guiar a luz.
- As ondas evanescentes permitem imagem de alta resolução no nível da superfície.
- Este método melhora a área de imagem e o rendimento.
Propósito do Estudo
- Demonstrar um novo procedimento de imagem usando microscopia TIRF baseada em chip fotônico.
- Comparar métodos tradicionais com a abordagem baseada em chip.
- Fornecer protocolos detalhados para preparação e imagem do chip.
Métodos Utilizados
- Preparação de chips fotônicos usando guias de onda ópticas.
- Protocolos de semeadura de células e incubação para preparação da amostra.
- Configuração de imagem envolvendo microscópio, laser e câmera.
- Captura e processamento de imagem usando o software Fiji.
Principais Resultados
- Demonstração bem-sucedida de capacidades de imagem de alto rendimento.
- Visibilidade clara da luz dispersa ao longo da guia de onda.
- Localização eficaz de moléculas únicas usando o novo setup.
- Resolução de imagem melhorada em comparação com métodos tradicionais.
Conclusões
- A abordagem baseada em chip oferece vantagens significativas na microscopia de fluorescência.
- A desacoplação da iluminação e coleta melhora as possibilidades de imagem.
- Este método abre caminho para futuros avanços na microscopia de super-resolução.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Chip-based nanoscopy decouples excitation and collection pathways, enabling large field-of-view TIRF imaging with low magnification optics. This approach supports high-throughput super-resolution imaging while maintaining resolution comparable to traditional methods, addressing discovery-stage bottlenecks in target validation and phenotypic screening. The technique enhances predictive confidence by providing quantitative, reproducible subcellular imaging data across scalable sample areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of subcellular structures like liver sinusoidal endothelial cell fenestrations and plasma membrane organization at 76 nm resolution.
- Operational Value: Decoupled illumination and collection allow use of low magnification lenses, increasing field of view for population-level target engagement analysis.
- Predictive Value: Large-area dSTORM imaging supports statistical robustness in target localization and heterogeneity assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uniform evanescent wave excitation across waveguide-defined areas enables consistent single-molecule localization for assay readouts.
- Operational Value: Compatibility with standard microscopes and on-chip integration supports assay standardization and reuse across discovery campaigns.
- Scalability: Demonstrated 500 µm x 500 µm imaging area enables multiplexed condition testing in a single acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Disease-relevant LSEC imaging validates applicability to endothelial pathophysiology models.
- Mechanistic De-risking: Super-resolution visualization of nano-scale membrane features aids in understanding drug-target spatial relationships.
- Preclinical Alignment: Resolution and throughput support biomarker localization studies in primary or stem-cell-derived systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification workflows, providing super-resolution readouts that inform target confidence and assay reproducibility prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of target localization and clustering in native membrane environments.
- Screening: Enables assay readiness through quantifiable, high-density localization data from large sample regions.
- Analytics: Generates filtered localization lists and drift-corrected reconstructions for objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through imaging of disease-relevant cellular ultrastructure in primary cell models.
- Enterprise Reuse: Photonic chip infrastructure can be retained across projects, reducing retooling costs for super-resolution capable imaging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through nanoscale resolution of membrane protein organization and dynamics.
- Operational Value: Standardized chip preparation and imaging protocol ensures reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on subcellular target distribution data, reducing late-stage attrition from mechanistic misunderstanding.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets supported by super-resolution spatial evidence in relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Expertise in photonic chip handling, fluorescence microscopy, and single-molecule localization analysis required.
- Instrumentation includes laser source, piezo stage, vacuum holder, and fluorescence filter set compatible with TIRF and dSTORM.
- Cross-team standardization needs include chip cleaning procedures, PDMS chamber fabrication, and Fiji/ThunderSTORM analysis pipelines.
- Adaptation considerations involve optimizing excitation patterns for homogeneous illumination across different waveguide geometries and sample types.
- Practical limitations include potential inhomogeneous excitation with insufficient pattern averaging and minor resolution trade-off versus high-NA objective TIRF.
