Name: Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a gerar organóides endometriais primários humanos multicelulares para estudar biologia reprodutiva e respostas hormonais. Este método permite pesquisar doenças endometriais e testar fármacos.

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Este estudo foi financiado pela NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) e pela Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Nós gostaríamos de reconhecer a facilidade do núcleo da patologia do noroeste para processar os organóides fixos para a incorporação da parafina. Gostaríamos de reconhecer toda a equipe UG3, incluindo os laboratórios Woodruff, Burdette e Urbanek para as discussões e colaborações perspicazes.

Amostras endometriais foram coletadas de mulheres na pré-menopausa submetidas à histerectomia de rotina para condições uterinas benignas no hospital das mulheres da Universidade do noroeste, de acordo com protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional. O consentimento por escrito foi obtido de todas as mulheres incluídas no estudo.
1. preparação de moldes de agarose
<ol><li>Antes do início da célula de isolamento, elenco e equilibrar 1,5% agarose micro moldes (tabela de materiais) para abrigar os organóides de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>2. geração de Organoides endometriais
<ol><li>Colheita de células estromal primárias e epiteliais
	<ol>
<li>Em um gabinete de biossegurança usando técnica asséptica, prepare a solução enzimática (2,5 mg/ml de colagenase tipo i + 0,1 mg/ml DNase i em 10 ml de Dispase [500 unidades]) a 37 ° c e esterilizado-filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,2 μm em um tubo cônico de 15 ml.</li>
		<li>Em um gabinete de biossegurança usando técnica asséptica, raspar o endométrio das biópsias uterinas e picar o tecido a capa em pedaços muito pequenos com um bisturi. Nota: O tecido endometrial com pelo menos 20 mm x 10 mm x 1 mm é necessário para gerar números suficientes de organóides.</li>
		<li>Coloque o tecido recém-picado na solução enzimática em um tubo cônico de 15 mL. Feche a tampa e enrole a parte superior com um filme de cera (tabela de materiais) para evitar a contaminação.</li>
		<li>Põr o tubo com o tecido em um banho de água ou em uma incubadora em 37 ° c por 30 minutos com agitação delicada (80 − 100 RPM).</li>
		<li>Empilhe um filtro de células de 100 μm na parte superior de um filtro de célula de 20 μm em um tubo cônico de 50 mL. Filtre a solução através dos dois filtros e, em seguida, enxague o tubo cônico de 15 mL com 10 mL da solução de sal balanceada de Hank (HBSS; Tabela de materiais) e põr a lavagem através do filtro para assegurar-se de que todas as pilhas estejam coletadas. Nota: O líquido de fluxo-através contem pilhas stromal e glóbulos vermelhos (~ 20 mL total). As células epiteliais são coletadas no filtro de 20 μm. Os pedaços de tecido não digerido permanecem em cima do filtro de 100 μm. Descarte o tecido não digerido em um recipiente de resíduos de risco biológico.</li>
		<li>Inverta o filtro de células de 20 μm da etapa 2.1.5 para um novo tubo cônico de 50 mL e lave as células epiteliais fora do filtro com 20 mL de meio organoide (tabela de materiais) suplementado com 1% de caneta/Strep.</li>
		<li>Centrifugue os tubos cônicos das etapas 2.1.5 e 2.1.6 em 500 x g por 5 min.</li>
		<li>Com as células estromais coletadas, retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet com 10 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos.  Incubar a 37 ° c por 10 − 15 min. centrifugar o tubo cônico a 500 x g durante 5 min, retirar o sobrenadante e ressuscite o pellet com 200 − 300 μL de meio organoide (ver passo 2.2.2 para mais instruções).</li>
		<li>Com as células epiteliais coletadas, retire o sobrenadante e Resuspenda com 100 μL de meio organoide (ver passo 2.2.2 para mais instruções).</li>
	</ol></li>
	<li>Células de semeadura
	<ol>
<li>Após equilibrar os moldes do agarose de 1,5% nos poços (1 molde por o poço) de uma placa de 24 poços, remova meios organoid na parte externa dos moldes do agarose e incline a placa da cultura do tecido de modo que o meio da câmara de semeadura da pilha dos pratos do agarose possa igualmente ser cuidadosamente removidos.</li>
		<li>Veja as suspensões epiteliais (da etapa 2.1.9) e stromal (da etapa 2.1.8) o microscópio.  Adicione mais meios organoid às suspensões epithelial ou stromal da pilha 100 μL em um momento, de modo que as suspensões sejam aproximadamente iguais na densidade. Nota: Células epiteliais irão se juntar, e não é aconselhável para digerir/Trypsinize células epiteliais em suspensões de células únicas.</li>
		<li>Combine 1 parte de pilhas stromal com 3 porções de pilhas epithelial pelo volume.</li>
		<li>Pipeta 50 μL (60.000 pilhas) da suspensão combinada da pilha na câmara de semeadura da pilha do molde do agarose.</li>
		<li>Uma vez que os moldes do agarose são enchidas com as pilhas, adicione com cuidado 400 μL de meios organoid frescos no poço da placa 24-well. Nota: O meio atinge logo abaixo da superfície dos pratos de agarose e não fará com que as células flutuem para fora dos moldes. Após 2 − 3 dias, as células se instalam e começam a formar organóides.</li>
		<li>Mude o meio cada segundo dia com 500 μL de meios organoid.</li>
		<li>Após 2-3 dias, mude o meio a um que é suplementado com o estradiol de 0,1 nanômetro (E) e a testosterona de 0,8 nanômetro (T) para promover a organização de pilhas epithelial e stromal. Nota: Embora a organização de pilhas epithelial e stromal possa ocorrer com ou sem hormonas, mais organóides organizará na presença de hormonas.</li>
	</ol></li>
</ol>3. colhendo Organoides endometriais para experimentos
Nota: Depois que o experimento é feito, os organóides endometriais podem ser processados para histologia ou análise de RNA. As etapas a seguir descrevem como processar os organóides.
<ol><li>
Histologia
	<ol>
<li>Dissolva 1,5% de agarose em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) por ebulição. Permita que o agarose líquido esfrie a aproximadamente 50 ° c.</li>
		<li>um microscópio de dissecação, incline a placa 24-well e pipeta com cuidado para fora o meio da parte externa do molde do agarose. Cuidadosamente pipeta para fora o meio do interior do molde do agarose para evitar interromper os organóides.</li>
		<li>um microscópio de dissecação, cuidadosamente Pipetar 70-75 μL de quente (50 ° c) 1,5% agarose na câmara do prato de agarose. Tenha cuidado para não perturbar os organóides.</li>
		<li>Deixe esfriar a 4 ° c por 5 min.</li>
		<li>Adicione o paraformaldeído de 4% (PFA) em cada poço da placa de 24 poços e fixe o molde selado inteiro do agarose que contem organóides durante a noite em 4 ° c. Em seguida, armazene em 70% etanol a 4 ° c até estar pronto para o processo de incorporação de parafina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolação do RNA
	<ol>
<li>um microscópio de dissecação, incline a placa 24-well e pipeta com cuidado para fora o meio da câmara do molde do agarose.</li>
		<li>A pipeta forcefully 1 ml do meio organoid fresco diretamente no molde do agarose assim que os organóides são liberados fora dos micropoços. Tenha cuidado para não criar muitas bolhas.</li>
		<li>Repita a pipetagem novamente com o mesmo meio da etapa 3.2.2.</li>
		<li>Colete todo o meio contendo os organóides. Centrifugue na velocidade máxima para recolher os organóides e para proceder à extração do RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós geramos os organóides endometrial humanos compreendidos das pilhas epithelial e stromal do endométrio sem o uso de materiais exógenos do andaime. Embora já tenha sido demonstrado que as células epiteliais do endométrio primário podem formar organóides6,7, essascélulas foram encaixadas em uma matriz gelatinosa de proteínas secretadas por células de sarcoma de camundongo (ver tabela de materiais) para ajudar forma spheroid-como estruturas. Além...

O endométrio humano alinha a cavidade uterine e sere como o primeiro contato para o embrião durante a implantação. O endométrio é composto de células epiteliais luminais e glandulares, fibroblastos estromais favoráveis, células endoteliais e células imunes. Juntos, esses tipos de células compõem o tecido endometrial, que é um dos tecidos mais responsivos aos hormônios esteróides sexuais1. As mudanças que ocorrem durante cada ciclo menstrual são impressionantes. O crescimento e a remodelação apropriados do endométrio são exigidos para permitir que a implantação do embrião ocorra. A resposta aberrante ao estrogênio e progesterona pode resultar em um endométrio refratário que não permite o estabelecimento bem-sucedido da gravidez e pode até resultar em doenças, incluindo neoplasia endometrial.
A fim de estudar as respostas hormonais e alterações essenciais que ocorrem no endométrio, as células dos tecidos endometriais extirpada de pacientes durante a cirurgia ou biópsia endometrial têm sido propagadas na cultura celular. Células estromais endometriais preferencialmente proliferam e se propagam prontamente, e o processo de diferenciação induzido pela progesterona pode ser recapitulado in vitro. Como resultado, muita coisa foi aprendida durante esse processo de diferenciação, denominada decidualização2,3. O outro tipo principal da pilha no endométrio, as pilhas epithelial Luminal e glandular, entretanto, não cresce bem como monolayers tradicionais, perdendo a polaridade, tornando-se senescent, e tendo o potencial proliferative limitado. Como resultado, menos é conhecido de sua biologia e seu papel no endométrio humano. Como muitas Neoplasias se originam das células epiteliais, os mecanismos associados à hiperplasia ou transformação de células cancerosas permanecem totalmente definidos. Além disso, estudos estabeleceram que a resposta hormonal envolve as ações paracrinas íntimas entre as células epiteliais e estromais do endométrio4,5.
Recentemente, umacultura organoid tridimensional (3D) de pilhas epithelial endometrial foi estabelecida por dois grupos independentes6,7, quesão os primeiros relatórios dos organóides dados forma do tecido endometrial. Estes organóides foram compreendidos das pilhas epithelial endometrial encaixadas dentro de uma matriz da proteína (tabela dos materiais) e não incluiu um compartimento hormonalmente responsivo importante do endométrio endometrial, os fibroblasto stromal. Como as proteínas da matriz podem variar de lote para lote e pode desencadear vias de sinalização que não ocorrem necessariamente no tecido, seria ideal para substituir as proteínas da matriz com componentes do endométrio. No estudo atual, um protocolo para gerar organóides endometrial humanos Scaffold-livres de pilhas epithelial e stromal do endométrio humano é apresentado. A presença de células estromais não só fornece o suporte para células epiteliais, mas também fornece as ações paracrinas necessárias que foram estabelecidas para serem importantes para a resposta hormonal endometrial4,8,9 .
O organoid endometrial multicelular novo oferece um sistema modelo do endométrio que é simples de gerar e que incorpora pilhas epithelial e stromal. Estes organóides podem ser usados para estudar as mudanças hormonais a longo prazo e os eventos adiantados da doença tais como o tumorigênese devido ao desequilíbrio hormonal ou aos insultos exógenos. A complexidade destes organóides poderia eventualmente ser expandida para incluir outros tipos da pilha, incluindo pilhas endothelial e imunes com as pilhas possivelmente myometrial para imitar verdadeiramente a fisiologia humana do tecido.

<table><tbody><tr><td>Agarose HS, grau de biologia molecular</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td> <td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr> <tr><td>Cloreto de amônio (NH4Cl)</td> <td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, Tipo II, pó</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Stain</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Receptor de estrogênio (SP1), anticorpo monoclonal de coelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield com DAPI, meio de montagem histológica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x sem cálcio, magnésio e fenol vermelho</td></tr><tr><td>Solução de mancha de hematoxilina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>Formulação Harris modificada,</td></tr><tr><td>solução de heparina</td> sem mercúrio <td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>adicionado ao meio MammoCult</td></tr><tr><td>Solução estoque de hidrocortisona</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>adicionado ao meio MammoCult</td></tr><tr><td>Meio organoide - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>suplementado com 2 &micro; L/mL de heparina e 5 &micro; L/mL de hidrocortisona</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, solução a 16%</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4</td> Receptor de progesterona <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>, PgR 1294, não conjugado, sobrenadante de cultura</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>matriz proteica - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-E-caderina de camundongo purificado</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vimentina recombinante [EPR3776]</td>Kit de lise e isolamento de RNA <td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testosterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Mancha Tricrômica</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Filme de cera - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

O endométrio humano é um dos tecidos mais responsivos hormonalmente no corpo e é essencial para o estabelecimento da gravidez. Este tecido também pode tornar-se doente e causar morbidade e até mesmo a morte. Os sistemas modelo para estudar a biologia endometrial humana foram limitados aos sistemas in vitro da cultura de únicos tipos da pilha. Além disso, as células epiteliais, um dos principais tipos de células do endométrio, não se propagam bem ou mantêm suas características fisiológicas na cultura e, portanto, nossa compreensão da biologia endometrial permanece limitada. Nós geramos, pela primeira vez, os organóides endometrial que consistem em pilhas epithelial e stromal do endométrio humano. Estes organóides não exigem nenhuns materiais exógenos do andaime e organizam-se especificamente de modo que as pilhas epithelial engloquem a estrutura spheroid-like e se tornem polarizada com as pilhas stromal no centro que produzem e secretam o colagénio. Os receptores de estrogênio, progesterona e andrógeno são expressos nas células epiteliais e estromais e tratamento com níveis fisiológicos de estrogênio e testosterona promovem a organização dos organóides. Este novo modelo de sistema pode ser usado para estudar a biologia endometrial normal e doença de maneiras que não eram possíveis antes.

Um esquema do protocolo é representado na Figura 1. O tecido uterine foi obtido da cirurgia depois que foi examinado por patologistas. O forro endometrial foi separado do miométrio raspando e o tecido endometrial foi digerido enzimaticamente às pilhas como esboçado no protocolo. As pilhas epithelial e stromal foram adicionadas em micropoços nos moldes do agarose. Após 7 dias na cultura, os organóides foram tratados com o e e o T por uns 7 − 14 dias adicionais.
Par...

Um protocolo para gerar os organóides endometrial preliminares humanos que consistem em pilhas epithelial e stromal e retêm características do tecido endometrial nativo é apresentado. Este protocolo descreve métodos da aquisição uterine do tecido ao processamento histologic de organoids endometrial.

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

O endométrio é um tecido que muda todos os meses em resposta aos hormônios. O desequilíbrio hormonal pode prevenir o apego de embriões e também causar doenças como o câncer. Nosso protocolo reconstrói o endométrio para que possa ser estudado fora do corpo da mulher de forma fisiológica.A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma estrutura 3D de células compostas por dois tipos de células hormonicamente responsivas, as células epiteliais e estroma que se organizam e se comportam especificamente como no corpo. Uma vez que os organoides podem imitar melhor o comportamento do tecido, eles podem eventualmente ser usados para testar diferentes drogas. Os organoides endometrial podem ser usados para estudar efeitos diretos de fatores de risco atualmente conhecidos para o câncer, incluindo obesidade e síndrome do ovário policístico.Nossos organoides enfatizam a importância das ações paracrínas entre dois tipos de células. É importante começar com uma quantidade adequada de tecido. Obter a densidade certa de células epiteliais e estromais pode ser complicado.Além disso, os organoides são bastante pequenos e podem ser difíceis de visualizar com a coloração do IHC. A visualização desse procedimento é importante porque existem algumas etapas que serão muito mais fáceis de entender depois de vê-las. Estes incluem obter a camada tecidual certa do útero, obter a densidade certa das células para combinar, e semear os moldes de agarose.Antes de iniciar o isolamento celular, funde e equilibre micro moldes de 1,5% agarose de acordo com as instruções do fabricante para abrigar os organoides. Em um armário de biossegurança, use técnicas assépticas para preparar uma solução enzimática a 37 graus Celsius e filtrar a solução usando um filtro de seringa de 0,2 micrômetros em um tubo cônico de 15 milímetros. Usando um bisturi, raspe o endométrio das biópsias uterinas e pique o tecido em pedaços muito pequenos.Coloque o tecido recém-picado no tubo cônico de 15 mililitros contendo a solução enzimática. Feche a tampa e enrole a parte superior do tubo com uma filme de cera para evitar contaminação. Coloque o tubo em um banho de água ou incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação suave.Depois disso, empilhe um coador de células de 100 mícrons em cima de um coador de células de 20 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Filtre a solução através dos dois filtros. Enxágüe o tubo cônico de 15 mililitros com HBSS e coloque esta lavagem através do coador para garantir que todas as células sejam coletadas.Em seguida, inverta o coador de células de 20 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros e lave as células epiteliais do coador com 20 mililitros de mídia organoide suplementada com 1%penicilina e estreptomicina. Centrifugar os tubos cônicos a 500 G por cinco minutos. Para as células estromais coletadas, remova o supernasal e resuspense a pelota em 10 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos.Incubar a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Centrifugar essas células a 500 G por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspenja a pelota com 200 a 300 microliters de mídia organoide.Para células epiteliais coletadas, remova o sobrenascer e resuspenja a pelota em 100 microliters de mídia organoide. Depois que os moldes de 1,5% de agarose forem equilibrados, remova a mídia organoide na parte externa dos moldes de agarose e incline a placa de cultura tecidual para que o meio da câmara de semeadura celular dos pratos agarose também possa ser cuidadosamente removido. Veja as suspensões epiteliais e células estrobomais sob um microscópio e adicione mais mídia organoide às suspensões, certificando-se de adicionar apenas 100 microlitros por vez para que a suspensão seja aproximadamente igual em densidade.Em seguida, combine uma parte das células estromas com três partes das células epiteliais em volume. Pipeta 50 microliters da suspensão celular combinada na câmara de semeadura celular do molde de agarose. Uma vez que os moldes de agarose são preenchidos com células, adicione cuidadosamente 400 microliters de mídia organoide fresca nos poços da placa de 24 poços.Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, certificando-se de mudar o meio a cada dois dias com 500 microliters de mídia organoide. Após sete dias, mude o médio para um que é suplementado com estradiol nanomolar 0,1 e 0,8 testosterona nanomolar para promover a organização das células epiteliais e estromal. Primeiro, dissolver 1,5% de agarose na PBS por ebulição.Coloque o líquido em uma béquer de água quente e deixe esfriar a aproximadamente 50 graus Celsius. Sob um microscópio dissecando, incline a placa de 24 poços e cuidadosamente pipeta para fora do molde de agarose. Em seguida, cuidadosamente pipeta para fora do meio do interior do molde de agarose para evitar perturbar os organoides.Adicione cuidadosamente entre 70 e 75 microliters de calor, 1,5% de agarose na câmara do prato de agarose, tomando cuidado para não perturbar os organoides. Deixe a placa esfriar a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, adicione 4% de paraformaldeído em cada poço da placa de 24 poços e fixe todo o molde de agarose selado durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, armazene a placa em 70% de etanol a quatro graus Celsius até estar pronto para processar a incorporação de parafina. Para iniciar o isolamento do RNA, veja a placa sob um microscópio dissecando. Incline a placa e cuidadosamente pipeta para fora do meio da câmara do molde agarose.Pipeta com força um mililitro de meio organoide fresco diretamente no molde de agarose para que os organoides sejam liberados dos microwells, tomando cuidado para não criar muitas bolhas. Repita este processo de pipetação forte uma vez usando o mesmo meio. Depois disso, colete todos os meios que contenham os organoides.Centrífuga a 500 G para coletar os organoides, e proceder à extração de RNA. Neste estudo, organoides endometrial humanos compostos por células epiteliais e estromais do endométrio são gerados sem o uso de materiais exógenos de andaimes. Para o processamento histológico, os moldes de agarose contendo os organoides endometrial são selados com agarose, seguidos de fixação com 4% de paraformaldeído durante a noite.Estes moldes são processados para incorporação padrão de parafina seccionada e manchada para histologia, imunfluorescência ou imunohistoquímica. A hematoxilina na coloração de eosina revela uma estrutura semelhante a esferoides com uma única camada de células forrando o exterior e as células no centro. Marcadores específicos de células para células endometrial, epitelial e células estromais revelam células epiteliais ao redor do organoide com células estromais no centro.Marcadores da fisiologia endometrial confirmam que os organoides endometrial mantiveram certas características do tecido nativo. A coloração tri-cromada, que mancha o azul de colágeno e as células vermelhas, mostra a presença de colágeno dentro do centro onde residiam as células estromal, demonstrando produção ativa e secreção de colágeno por células estromicas semelhantes ao tecido nativo. Além disso, a coloração imunohistoquímica revela a presença de receptores de estrogênio, receptores de andrógeno e receptores de progesterona nas células epiteliais e estrômais.É importante emplacar as células densamente para que tenhamos organoides suficientes para experimentos a jusante. Isso vai levar algum prática. Organoides endometrial podem ser cultivados em diferentes condições e depois colhidos para experimentos como imunohistoquímica ou coloração de imunofluorescência para estudar expressão proteica ou colhidos para RNA estudar a expressão genética.Nosso laboratório investiga como o endométrio responde aos níveis hormonais alterados, o que pode levar à hiperplasia endometrial e câncer. Podemos usar esses organoides para tratamentos de longo prazo de hormônios e adicionar condições patológicas, como o excesso de testosterona encontrada na síndrome do ovário policístico, ou sinais de adipócitos para estudar alterações endometrial induzidas pela obesidade. Os tecidos humanos são considerados biogásionos, e será importante tomar as precauções apropriadas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.

Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Este protocolo descreve o estabelecimento de organoides de tecido tridimensionais (3D) a partir de células primárias do epitélio da superfície ovariana humana (hOSE). O protocolo inclui isolamento de hOSE de ovários recém-coletados, expansão celular do hOSE, procedimentos de criopreservação-descongelamento e derivação de organoides. Imunofluorescência, análise quantitativa e demonstração da utilidade como plataforma de triagem estão incluídas.

Organoides do Epitélio da Superfície do Ovário Humano como Plataforma para Estudar a Regeneração Tecidual

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células-tronco epiteliais endometriais (reESCs) de ratos, gerando organoides endometriais de ratos. Este método facilita estudos in vitro de doenças endometriais, permitindo a edição de genes e outras manipulações celulares.

Geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato

Apresentamos um protocolo detalhado para estabelecer e manipular geneticamente organoides cervicais humanos.

Geração e manipulação genética de organoides cervicais humanos

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

A modelagem do desenvolvimento do cérebro humano foi prejudicada devido à complexidade sem precedentes do tecido epitelial neural. Aqui, é descrito um método para a geração robusta de organoides cerebrais para delinear eventos iniciais do desenvolvimento do cérebro humano e modelar a microcefalia in vitro.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Aprenda a gerar organóides endometriais primários humanos multicelulares para estudar biologia reprodutiva e respostas hormonais. Este método permite pesquisar doenças endometriais e testar fármacos.

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

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