Name: Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a analisar a dinâmica de oligomerização de receptores em células HeLa vivas usando microscopia TIRF combinada com análise de número e brilho. Este método permite observar em tempo real a organização espacial e temporal de moléculas de membrana.

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O CNIC é apoiado pelo Ministério de Ciencia, Innovación y Universidades e pela Fundação Pro CNIC, e é um Centro de Excelência Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Também somos apoiados pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) "Una manera de hacer Europa". A UC reconhece o apoio da Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, da Association for International Cancer Research (agora conhecida como Worldwide Cancer Research) e do Ministério da Saúde italiano. A.T. reconhece o "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" por apoiar parcialmente seu trabalho com a Bolsa PV "Progetto Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.

1. Preparação da amostra
<ol><li>Dia 1. Células HeLa semente em meio completo em uma concentração de 100.000-200.000 células / mL em pratos de fundo de vidro. Sementes 6-8 replicar pratos. Nota: Neste exemplo, o meio é complementado com 10% de calor inativado Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM piruvado de sódio, 100 U/100 μg penicilina/estreptomicina. Vários pratos de replicar são preparados.</li>
	<li>Dia 2-3. Quando as células estão em sub-confluência, transfect metade dos pratos com o plasmídeo de proteína e a segunda metade com plasmídeos de referência (monomer e dimer), em meio livre de soro. Nota: A transfecção é feita em meio livre de soro complementado com antibióticos, 0,1% De Soro Bovi Albumin e 25 mM HEPES buffer, sem Fenol Red.</li>
	<li>Dia 3-4. Verifique se as células transfeccionadas são aderentes ao fundo dos pratos e a membrana celular é fluorescente. Descarte pratos com células cobertas de vegetação ou com fluorescência muito baixa. Nota: Não deixe que as células cresçam demais. As células devem ser bem distribuídas e ser aderidas à área de vidro do prato (Figura 1A). Os pratos inferiores de vidro pré-revestidos podem ser usados favorecendo a adesão celular. A cultura celular é testada para contaminação por micoplasma antes de qualquer experimento. Neste exemplo, as células são transfeccionadas com plasmplasmida (A207K)mEGFP-FGFR1 e as células de referência são transfectadas com plasmsiem GPI-(A207K) e plasmplas mEGFP de GPI usando protocolos padrão. Para a microscopia de células vivas, recomenda-se um meio livre de indicadores; 25 mM tampão HEPES é adicionado para evitar alterações de pH durante a imagem.</li>
</ol>2. TIRF Imaging - Alinhamento da Linha Laser e Otimização da Iluminação TIRF
<ol><li>Quatro horas antes do experimento, ativar a incubadora de temperatura do microscópio em 37 °C.</li>
	<li>Ligue o microscópio, computadores e câmeras e esperar que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho adequada. Nota: A temperatura de trabalho da câmera utilizada neste estudo é de -75 °C.</li>
	<li>Coloque uma pequena gota de óleo no objetivo. Coloque um prato de amostra no lugar. Feche as portas da incubadora e deixe a temperatura do prato equilibrar (~ 10 min).</li>
	<li>Ligue a lâmpada de epifluorescência e o laser de 488 nm.</li>
	<li>Selecione o modo de contraste de epifluorescência para explorar a amostra, pesquisando uma célula para se concentrar no ocular. Nota: O uso de uma lâmpada fluorescente para procurar pilhas através do ocular não é imperativo. Uma linha laser apropriada pode ser usada preferivelmente.</li>
	<li>Selecione o filtro adequado para coletar a emissão verde através da câmera do microscópio (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, ou similar.</li>
	<li>Mude da porta ocular para a câmera (câmera #1 na Figura 1)no modo epifluorescência, refine o foco e a mudança para o modo TIRF. Os modos epifluorescência e TIRF podem ser nomeados com uma nomenclatura diferente, dependendo da marca do microscópio. Nota: Pode haver problemas focando ou alinhando o laser se não houver marcadores fluorescentes na interface coverslip. Para alinhar o laser corretamente (essencial para a boa TIRF), concentre-se no deslizamento de capa. Muitas vezes é muito difícil determinar se o coverslip está em foco. Como sugestão, concentre-se nas bordas das células.</li>
	<li>Ativar o alinhamento automático seguindo as instruções do microscópio TIRF. Nota: Resumidamente, para passos de 2,4 a 2,8, primeiro encontrar as células através do ocular e se concentrar neles, em seguida, enviar a emissão para a porta da câmera do microscópio TIRF, re-foco das células na tela do computador microscópio e ativar o procedimento para o alinhamento a laser. O alinhamento consiste em encontrar o ângulo crítico em que a iluminação se torna evanescente(Figura 3). Microscópios comerciais podem ter protocolos de alinhamento ligeiramente diferentes e também ser totalmente automatizados; outros podem ter uma pequena câmera para facilitar a visualização das condições de ângulo crítico.</li>
	<li>Escolha uma profundidade de iluminação adequada e otimize a direção do campo evanescente(Figura 3). Nota: A profundidade de penetração é mantida constante para todos os controles e amostras.</li>
</ol>3. TIRF Imaging: Captura da Série Time
<ol><li>Defina uma região de interesse (ROI) de pelo menos 256 x 256 pixels. Nota: Nesta configuração, a captura é feita com câmera #2 software que controla diretamente apenas a câmera (Veja a lenda da Figura 1).</li>
	<li>Defina a exposição a 1 ms e o ganho em EM para 1.000 (este é o fator G no eq. 12 e 13). A tal velocidade, pode ser necessário ajustar ou aumentar a potência laser. Aqui a potência a laser é de 0,5 mW. Nota: Dependendo do tipo da câmera e dos limites impostos pelo coeficiente de difusão da proteína, intensidade e fundo de fluorescência, os critérios gerais para definir a potência laser não são para saturar o detector, minimizar o clareamento de fotos e capturar como rápido possível em um S/N razoável. O ganho EM é sempre definido no máximo da câmera (ver Introdução).</li>
	<li>Executar uma primeira seqüência de teste em condições iniciais e estima aproximadamente o valor S / N. As condições são aceitáveis em S/N = 2-3 ou superior, medida no primeiro quadro da série de primeira vez.</li>
	<li>Use o controle deslizante do sistema de divisão de emissões que conecta a câmera #2 ao microscópio para mascarar um lado da imagem (Figura 1B, Figura 4A-B) Nota: Neste conjunto, um conector de imagem multicanal é instalado na câmera #2 para permitir a aquisição de duas imagens espacialmente idênticas simultaneamente. O sistema é equipado com slides para a montagem de diferentes filtros de emissão. Um dos controles deslizantes monta uma máscara preta para cobrir um lado da imagem. A área mascarada é usada para a calibração interna de cada série de tempo, para determinar os parâmetros da câmera (eq. 12 e eq. 13). Desta forma, não há necessidade de uma etapa de calibração independente e, importante, calibração é realizada em paralelo com a captura de cada série de tempo. Na ausência deste sistema, a câmera pode ser calibrada aplicando protocolos publicados33.</li>
	<li>Selecione a opção de autosave do arquivo da câmera.</li>
	<li>Comece a aquisição da série de imagens. Adquirir um mínimo de 700 quadros em uma relação Mínima S / N de 2. Nota: O número de quadros necessários para análise depende da estabilidade da amostra para o fotobranqueamento e da dispersão dos dados. Portanto, a qualidade de cada série de tempos é avaliada durante a análise de N&amp;B.</li>
	<li>Sem tirar o prato do microscópio, adicione o ligand.</li>
	<li>Selecione uma célula com uma membrana de fluorescência brilhante e comece rapidamente a primeira série da corrida cinética. Nota: Se a adição do ligand é feito rapidamente, esta primeira captura define o ponto = 0 tempo da cinética ligand. O software registra a hora exata da captura.</li>
	<li>Pesquise uma segunda célula e adquira o segundo ponto de encontro da cinética. Nota: As rotinas de visita ao ponto estão disponíveis em alguns microscópios equipados com estágios motorizados x,y,z. Estes permitem a memorização de múltiplas posições no prato celular, e pode ajudar a manter um intervalo mais constante de tempo entre a imagem-série em diferentes células.</li>
	<li>Capture uma nova célula para cada ponto de tempo da corrida cinética. Nota: Após a captura, uma célula é parcialmente fotobranda e não pode ser re-imagem. Por causa disso, a cinética é obtida acombinando séries de tempo de muitas células, cada uma capturada em um momento diferente.</li>
	<li>Para cada novo prato, repita o protocolo do passo 2.3 para 3.9. Nota: Para pratos de referência, adicione um volume do veículo (PBS complementado com 0,01% de albumina de soro bovina) equivalente ao usado para o ligand.</li>
</ol>4. Número e Brilho (N&amp;B): Verificação de qualidade da Série Time
<ol><li>Converter e salvar como . TIFF os arquivos adquiridos com o software da câmera (.sif arquivos neste exemplo).</li>
	<li>Importação. Tiff arquivos na rotina de software de análise, ativando a interface gráfica do usuário N &amp; B (GUI) MATLAB. Nota: Uma rotina de N&amp;B executável matlab personalizada é usada aqui (análise de N&amp;B na https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Abrindo um importado. O arquivo TIFF, a rotina gera a imagem de intensidade média, o perfil de intensidade média e permite inspecionar a série quadro a quadro(Figura Suplementar 1). Outros softwares estão disponíveis para análise de N&amp;B (por exemplo, software SimFCS).</li>
	<li>Descartar séries para as quais o perfil de intensidade média mostra mais de 10% de fotobranqueamento, e séries em que houve uma distorção ou tradução evidente da membrana celular durante a aquisição.</li>
	<li>Os frames de colheita que são evidente fora-de-foco. Nota: Uma ferramenta de corte é implementada na rotina para descartar quadros individuais ou múltiplos dentro da série de imagens. Esta operação é permitida porque o tempo quadro-a-quadro não é crítico, enquanto o pixel habitar o tempo (tempo de exposição) é (ver Discussão).</li>
	<li>Mantenha para a série de análise apenas com pelo menos 500 prazos.</li>
</ol>5. Número e Brilho (N&amp;B): Determinação dos Parâmetros da Câmera (Offset, σ e S)
<ol><li>Ativar a rotina calibrar câmera.</li>
	<li>Selecione uma área de pelo menos 20 x 50 pixels na região de ruído do detector(Figura 4). Nota: A rotina origina um histograma dos valores (também definido Nível Digital, DL) e retorna um enredo logarithm da Frequência versus Níveis Digitais.</li>
	<li>No lote de frequência de registro versus nível digital, mova o cursor vermelho linear para delimitar o gaussiano e a parte linear da curva. Nota: O cursor vermelho divide as duas seções da curva, e ativa a rotina retornando o deslocamento, que é o centro da função gaussiana da resposta da câmera, o σ do ajuste gaussian, e o fator S, que é a inclinação da parte linear da câmera respons e (Figura 4C-D).</li>
</ol>6. Número e Brilho (N&amp;B): Computação dos valores B na Região Selecionada de interesse (ROI)
<ol><li>Ativar a chave B. Nota: Essa ação gera a imagem de intensidade média(Figura 5,primeira coluna) e a imagem B em que cada valor B individual está associado ao pixel relacionado na imagem(Figura Suplementar 1).</li>
	<li>Aplique um binning mínimo (2 2) para reduzir a dispersão dos dados e para gerar o histograma B-I (Figura 5,segunda coluna). Nota: O histograma B-I representa a distribuição dos valores B de todos os pixels da imagem versus a intensidade do pixel. Y = B/S; X =<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> ( - offset)/S (Figura Suplementar 1 e eq. 11 e 15).</li>
	<li>Inspecione o histograma B-I usando o cursor quadrado interativo.</li>
	<li>Selecione um ROI quadrado para a análise(Figura 5,terceira coluna). Nota: O cursor sincroniza uma máscara móvel na imagem de intensidade média, destacando os pixels que são selecionados dentro da área do cursor quadrado(Figura Suplementar 1). Por esta inspeção, é possível excluir da análise o fundo e as áreas com intensidade muito baixa.</li>
	<li>Gerar o mapa B do ROI selecionado (Figura 5,quarta coluna).</li>
	<li>Salve o arquivo ASCII dos valores B associados à seleção.</li>
	<li>Importe o arquivo ASCII em um software gráfico para calcular a distribuição de frequência dos dados e obter o valor B médio ± S.E (Figura 5,quinta coluna). Nota: Se os dados forem homogêneos, a distribuição de frequência dos valores B aproxima-se de uma distribuição gaussiana.</li>
	<li>Aplique eq. 15 para derivar <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq18.jpg"> o <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq19.jpg"> brilho médio = - 1 [((contagens/molécula) por tempo de permanência] para cada célula em cada ponto de tempo da corrida cinética. Normalizar os dados de acordo com: <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq17.jpg"> onde <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq20.jpg"> está o valor B médio medido no tempo "t" após adição de ligand, e <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq21.jpg"> é o valor B médio medido no momento t=0 (10-20 s após adição de ligand). Nota: A normalização dos resultados permite a comparação direta de experimentos realizados em dias diferentes. Compensa diferenças no brilho medido devido ao poder do laser e às flutuações técnicas.</li>
	<li>Trace o Brilho Médio Normalizado versus tempo de aquisição para construir a corrida cinética (Figura 6).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A N&B requer várias precauções na escolha do modelo celular e da estratégia de rotulagem. Ele pode ser aplicado apenas para células vivas que permanecem aderidas de forma enova durante o tempo de captura de imagem. Flutuações extras devido ao deslocamento rígido de toda a célula podem ser tratadas com abordagens adequadas de restauração de imagem38. No entanto, geralmente quando uma célula se move, a membrana celular também se deforma, e a deformação da estrutura, produzindo grande variação extra,...

Descrevemos uma abordagem de imagem total de reflexão interna fluorescência-número e brilho (TIRF-N&amp;B) para determinar o estado oligomérico médio das moléculas receptoras na membrana plasmática das células vivas, com o objetivo de vincular a montagem do receptor dinâmica para a função biológica das proteínas (Figura 1).
Após a ligação extracelular do ligand, os receptores iniciam a transdução de sinal intracelular dependendo de sua conformação, oligomerização, potenciais co-receptores e composição da membrana. Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, reconhecida como um evento-chave na sinalização celular1,2,3,4,5,6, 7,poucos métodos podem detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento experimentalmente8,9. O volume confocal (x, y - 300 nm, z 900 nm) é insuficientemente resolvido para provar a interação molecular e stoichiometria, mesmo após a otimização por algoritmos de restauração de imagem10. A composição sub-unitária de oligomeros proteicos não pode ser resolvida de forma puramente espacial, mesmo por métodos de super-resolução em x,y resolução de 20-70 nm, como PALM11, STORM12,e STED13. Além disso, sua resolução temporal (na ordem dos minutos por imagem) não pode seguir a cinética na faixa de segundos. Único molécula passo-branqueamento resolve a stoichiometria de oligomeros de proteína apenas se eles são imóvel14.
Um dos métodos mais versáteis para medir a densidade e o oligomerização de proteínas fluorescentes marcadas dentro de imagens individuais é a análise de distribuição de intensidade espacial (SpIDA), que depende da amostragem espacial. É aplicável a células quimicamente fixas e vivas, e permite a análise de várias regiões de interesse da célula simultaneamente usando microscopia fluorescência padrão15. Alternativamente, métodos momentâneos, como espectroscopia fluorescência-correlação (FCS)16,fótons contando histograma (PCH)17, e Número e Brilho (N&amp;B)18,19, são adequados para oligomer quantitativo Medidas. Esses métodos analisam as flutuações de intensidade da fluorescência que podem ser observadas no tempo em que os fluorofforas se difundem dentro e fora de um volume de iluminação. As amplitudes das flutuações de intensidade podem ser descritas exclusivamente pelo brilho molecular do fluorofforre (ε) e pelo número médio de fluorofônicos (n) dentro do volume de iluminação17 (Figura 2). Normalmente, o coeficiente de difusão dos fluorofforos e o número médio de moléculas (inversamente relacionadas ao valor G(0) dentro do volume de iluminação podem ser obtidos pela FCS20. No entanto, uma vez que o tempo de difusão apenas escalas com a raiz cúbica da massa, FCS não é suficientemente sensível para detectar alterações na massa molecular21. Na prática, a FCS de cor única não consegue detectar a dimerização dos receptores de membrana. PCH resolve misturas de diferentes oligomeros com precisão. Usando mais de dois momentos da distribuição da amplitude, detecta moléculas do brilho diferente que ocupam o mesmo volume da iluminação. Digitalização FCS22 e desenvolvimentos, como a interessante par-correlação de brilho molecular (pCOMB) abordagem23, introduzido para estender a gama de aplicabilidade dos métodos de correlação fluorescência em sistemas biológicos24 , permanecem métodos de ponto único sem a capacidade de medições rápidas em uma grande área de uma célula, exigindo muitas observações consecutivas em cada pixel e aquisição de dados na ordem de segundos.
A N&amp;B é uma versão simplificada do PCH que considera apenas o primeiro e segundo momentos da amplitude da distribuição de fluorescência, ou seja, a intensidade média, e a variação, σ2 (Figura 2)18,19 e, por causa disso, não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima somente o estado médio do oligomerization da mistura. No entanto, a N&amp;B tem a vantagem de trabalhar com uma série de imagens de imagens de células vivas relativamente menores do que a PCH em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações no tempo da intensidade da fluorescência. Como a N&amp;B reduz o tempo por pixel para alguns microssegundos, ela pode seguir cinética de oligomerização rápida sobre grandes áreas celulares, permitindo a aquisição de imagem em uma escala de tempo de segundos em microscopia de varredura de raster (por exemplo, confocal, 2 fótons) e milissegundos em microscopia baseada em câmera (por exemplo, TIRFM).
Vários relatos demonstraram a capacidade da N&amp;B de quantificar o número de subunidades em aglomerados de proteínas por meio de imagens de regiões celulares estendidas. Os clusters Paxillin-EGFP foram detectados nos locais de adesão nas células CHO-K125,e a agregação intracelular do peptídeo httex1p patogênico foi descrita nas células COS-726. A N&amp;B foi aplicada para seguir a oligomerização ativa da ligand do receptorErbB 27,e o efeito do ligand FGF21 em Klothob (KLB) e fgfr1c em célulasHeLa 28. A combinação de imagens tirf e análise de N&amp;B foi usada para mostrar que a dinamina-2 é principalmente tetramérica em toda a membrana celular29. Aplicamos a N&amp;B a imagens de varredura de raster e TIRF para provar a dimerização conduzida por ligand dos receptores de membrana celular uPAR e FGFR130,31.
Métodos de correlação de fluorescência, como N&amp;B, FCS e PCH, são baseados na noção de que, em um volume aberto, o número de bolhas de partículas segue uma distribuição de Poisson. Como somente os fótons que os fluorofônicos emitem podem ser detectados, o valor médio para uma intensidade <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> de fluorescência medida versus o tempo em um pixel da imagem, é o produto do número médio de fluorofosforas no volume de iluminação, n, e sua brilho molecular, ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
onde o ε é expresso como o número de fótons emitidos por unidade de tempo (convencionalmente por segundo) por molécula quando a molécula está no centro do volume de iluminação.
O brilho é propriedade de cada fluorofofóbico em uma determinada aquisição criada, enquanto a intensidade é a soma de todas as contribuições de todos os fluorofos. Em competições biológicas, o brilho aumentará com o aumento do número de fluorofos que flutuam junto, dando a informação no estado do oligomerization da proteína fluorescente-etiquetada. As amplitudes de flutuação em um determinado pixel é medido a partir da variação do sinal de fluorescência, σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Onde a média do quadrado <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> de intensidade, e o quadrado <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> da média de intensidade, são computados a partir dos valores de intensidade individual em cada pixel de cada quadro:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
onde K é o número de quadros totais na série de tempo. Experimentalmente, é necessário calcular para toda a série de imagens a variação que descreve a dispersão dos valores de intensidade individual em cada pixel de uma única imagem em torno do valor de intensidade média. A variação inclui todas as flutuações de diferentes origens. Em uma primeira aproximação, a variação devido às partículas de difusão no volume de iluminação, σ20,pode ser separada da variância devido ao ruído do tiro do detector, σ2d. As duas variações são independentes; assim, a variação total é dada por sua soma:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
A variação, devido a flutuações moleculares dentro e fora do volume de detecção, é linearmente dependente do brilho e intensidade moleculares:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Reorganizando eq. 6 de acordo com o eq. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
De acordo com o conceito típico de espectroscopia de correlação de fluorescência, a equação 7 afirma que a variação devido ao número de flutuações depende do quadrado do brilho das partículas.
Em seguida, a variação devido às flutuações do detector é uma função linear da intensidade detectada, a suposição de que o detector é operado abaixo de seu limite de saturação19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
No caso dos detectores de contagem de fótons =1e c=0, assim a variação do detector é igual à intensidade média:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
Para aplicar esses conceitos a medições reais em células vivas, Gratton e colegas18 definem o brilho aparente, B, para cada pixel como a proporção da variação sobre a intensidade média:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B é o parâmetro que é medido experimentalmente. Neste trabalho, imagens de séries de tempo de receptores FGFR1 na membrana plasmática das células HeLa são capturadas pela microscopia TIRF e o brilho aparente médio, B, é determinado pela análise de N&amp;B. Então, após a adição de FGF2, séries de tempo consecutivos são capturadas para acompanhar as mudanças na auto-montagem das moléculas receptoras na superfície da membrana após a estimulação do receptor com o ligand canônico.
No entanto, uma vez que o detector do microscópio TIRF é uma câmera EMCCD, a expressão para o brilho aparente precisa ser modificada como19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
onde o deslocamento é o deslocamento da intensidade da eletrônica da deteção que é uma característica das ajustes do detetor. A variação e a intensidade média de um detector analógico são, respectivamente, dadas por:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
onde G é o ganho analógico em níveis digitais (DL/fótons), S, os níveis digitais por fóton19, é dado pela inclinação de uma intensidade versus variação parcela para uma fonte de luz com intensidade constante (sem flutuações temporais). O fator γ está relacionado à forma do volume de detecção de pixels. De acordo com Hassler et al.32,o fator γ é igual a 0,3 para imagens TIRF trabalhando no ganho máximo da câmera de detecção19. Os parâmetros de deslocamento, S e G são características da câmera e do microscópio. O brilho aparente, B, é obtido reorganizando eq. 11 de acordo com eq. 12 e 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Experimentalmente, o ε é uma função complexa da intensidade do laser e da eficiência de detecção do sistema. No entanto, uma vez que B / S é linearmente dependente de ε, só é importante determinar o valor relativo do ε para um determinado modo de detecção:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
onde o ε' é proporcional ao ε. Ainda assim, uma calibração é realizada usando uma referência interna.

<table><tbody><tr><td>Microscópio invertido rápido de 3 cores do TIRF de Leica AM TIRF MC, com alinhamento smi-automático de TIRF. O microscópio está equipado com um laser de diodo de 488 nm, uma objetiva TIRF de óleo 100x 1,46, filtros passa-banda Ex/Em em 490/20 e 525/50, incubadora de temperatura/CO2 e câmera Andor DU 8285 VP EMCCD. O microscópio é operado pelo software Leica LIF.</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino 98% mínimo</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EUA</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sem vermelho de fenol com 25 mM HEPES</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>21063029</td><td>Soro usado livre para microscopia</td></tr><tr><td>DMEM de alta glicose GlutaMAX I</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>10566-016</td><td>Usado para meio completo</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 10x (PBS)</td> <td>Biowest, Nuaill, França</td><td>X0515-500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de divisão de emissão Photometrics DV2</td><td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, qualificado, Brasil</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>10270106</td><td>suplemento inativado de 10% para meio completo</td></tr><tr><td>Fundo de vidro 35 mm estéril 1,5 pratos</td><td>MatTek, Ashland, MA, EUA</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>não revestido, espessura do vidro 0,17 mícrons</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carcinoma cervical humano (HeLa), células de componente animal (AC) sem soro</td><td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Alemanha</td><td>CB_08011102</td><td></td></tr><tr><td>iXonEM+ 897 EMCCD (retroiluminado) Câmera ANDOR controlada pelo software ANDOR Solis</td><td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Reino Unido</td><td></td><td>Esta câmera, instalada em uma porta adicional do microscópio, é usada para adquirir o N& Série temporal B</td></tr><tr><td>Matlab Executável N& B Unidade</td><td>de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha</td><td></td><td>download em https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td></tr><tr><td>MatLab v.2018b</td><td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, EUA</td><td></td><<td>a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td></tr><tr><td>Penicilina:Estreptomicina para cultura de tecidos 100x</td><td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, EUA</td><td>LONZA 17-602E</td><td>suplemento para meio em Penicilina / Estreptomicina 100 U / 100 &micro; g.</td></tr><tr><td>Vetor de expressão pN1-mEGFP-FGFR1</td><td>Unidade de Pesquisa em Oncologia Ginecológica, Instituto Europeu de Oncologia IRCCS, Milão, Itália</td><td></td><td>Zamai et al., 2019</td></tr><tr><td>Vetor de expressão pN1-N-Gly-mEGFP-GPI</td><td>Unidade de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha</td><td></td><td>Hellriegel et al., 2011</td></tr><tr><td>Vetor de expressão pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI</td><td>Unidade de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha</td><td></td><td>Hellriegel et al., 2011</td></tr><tr><td>FGF2 recombinante</td><td>PeproTech EC, Ltd., Londres, Reino Unido</td><td></td><td>Solução de ligante: 20 ng/mL de FGF2 em PBS suplementado com 0,01% de BSA.</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio GIBCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>suplemento de 1 mM para meio</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção TransIt-LT1</td><td>MirusBio LLC, Madison, WI, EUA</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tipo F Líquido de imersão 10 mL</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha</td><td>11513 859</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td>Suplemento a 0,1% para meio sem vermelho de fenol usado para transfecções</td></tr></tbody></table>

dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, poucos métodos são aplicáveis para detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento. Aqui, descrevemos uma abordagem de imagem para determinar o estado oligomérico médio de homocomplexos do receptor marcado pelo mEGFP na membrana das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B). A N&B é um método semelhante à espectroscopia fluorescência-correlação (FCS) e fótons contando histograma (PCH), que são baseados na análise estatística das flutuações da intensidade da fluorescência da fluorofia difundindo dentro e fora de uma iluminação volume durante um tempo de observação. Em particular, a N&B é uma simplificação da PCH para obter informações sobre o número médio de proteínas em misturas oligoméricas. As amplitudes da flutuação da intensidade são descritas pelo brilho molecular do fluorophore e pelo número médio de fluorophores dentro do volume da iluminação. Assim, a N&B considera apenas o primeiro e segundo momentos da distribuição de amplitude, ou seja, a intensidade média e a variação. Esta é, ao mesmo tempo, a força e a fraqueza do método. Como apenas dois momentos são considerados, a N&B não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima apenas o estado médio de oligomerização da mistura. No entanto, ele pode ser aplicado a séries de tempo relativamente pequenas (em comparação com outros métodos de momento) de imagens de células vivas em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações de tempo da intensidade da fluorescência. Ele reduz o tempo eficaz por pixel para alguns microssegundos, permitindo a aquisição no intervalo de tempo de segundos a milissegundos, o que é necessário para cinética de oligomerização rápida. Finalmente, grandes áreas celulares, bem como compartimentos subcelulares podem ser explorados.

Os resultados de duas células representativas HeLa-mEGFP-FGFR1 semeadas no mesmo prato cultural são mostrados na Figura 5 e na Tabela Suplementar 1. As duas células foram capturadas no tempo 0 min(Figura 5A, superior) e 7 min(Figura 5A, inferior) após a adição do ligand FGF2.
<strong class=...

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B).

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

O agrupamento de receptores é onipresente e muitas vezes necessário para a sinalização de uma ativação em cascata. No entanto, poucos métodos estão disponíveis para medir o grau de agrupamento. Usamos fluorescência de reflexão interna total, microscopia DE TIRF, para acompanhar a difusão de moléculas FGFR1-mEGFP na membrana plasmática das células vivas.Em seguida, aplicamos brilho numérico, a análise de N&B, para descrever a dinâmica do agrupamento estimulado do receptor. O TIRF é ideal para imagens temporais rápidas de eventos moleculares que ocorrem perto da superfície celular, enquanto n&B determina o estado oligomerico médio de moléculas fluorescentes com base em onde a difusão entra e sai do volume de iluminação do microscópio. Na verdade, esta é uma ferramenta para conectar a organização temporal espacial dos receptores na superfície celular onde eles estão sinalizando.A N&B só precisa do acesso a um microscópio com um módulo de aquisição rápida. Você pode analisar grandes áreas de células vivas tendo apenas o conhecimento básico dos métodos de flutuação da fluorescência. Este método pode ser aplicado a proteínas que formam dimers ou clusters e podem ser rotulados estequiometricamente com o corante fluorescente.Se as proteínas estiverem em compartimentos intracelulares, outros tipos de microscópios são usados para a aquisição das imagens. É importante preparar uma construção que expresse a forma monomérica do fluoróforo para medir em condições experimentais o brilho monomérico puro como controle. No primeiro dia, as células HeLa sementes em 1,5 mililitros de meio completo a uma concentração de 100.000 a 200.000 células por mililitro em pratos de fundo de vidro.Sementes de seis a oito replicam pratos, e incubam em uma incubadora a 37 graus Celsius. No segundo ou terceiro dia, as células atingiram a subconfluência. Adicione meio sem soro com plasmídeo de proteína a metade dos pratos, e adicione plasmídeos de referência com o monômero e mais escuro à segunda metade dos pratos para transfetar as células.Depois de um dia, verifique se as células transfeinadas são aderentes ao fundo dos pratos e a membrana celular é fluorescente. Descarte pratos com células crescidas ou com fluorescência muito baixa. Quatro horas antes do experimento, ative a incubadora de temperatura do microscópio a 37 graus Celsius.Ligue o microscópio, computadores e câmeras, e espere que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho adequada de menos 75 graus Celsius. Coloque uma pequena gota de óleo na lente objetiva. Coloque um prato de amostra na incubadora do microscópio, e feche as portas da incubadora para deixar a temperatura do prato equilibrar por 10 minutos.Ligue a lâmpada de epifluorescência e o laser de 488 nanômetros. Selecione o modo de contraste de epifluorescência para explorar a amostra, procurando uma célula para se concentrar a partir da lente ocular. Selecione o filtro adequado para coletar a emissão verde através da câmera de microscópio com bandpass Ex 490/20 500 e bandpass Em 525/50 ou similar.Mude do ocular para o relatório da câmera no modo de epifluorescência. Refine o foco e mude para o modo TIRF. Em seguida, ative o alinhamento automático seguindo as instruções do microscópio TIRF.Escolha uma profundidade de iluminação adequada e otimize a direção do campo evanescente. Mude para uma segunda câmera. Defina uma região de interesse de pelo menos 256 por 256 pixels.Ajuste a exposição a um milissegundo e o ganho em EM para 1.000. Ajuste a potência do laser para 0,5 miliwatts. É necessário ter algumas informações sobre o coeficiente de difusão da proteína, pois o tempo de exposição deve ser menor do que o tempo médio gasto pelas moléculas fluorescentes no volume luminado.Execute uma primeira sequência de ensaios em condições iniciais, e aproximadamente estime o valor de sinal para ruído. As condições são aceitáveis em sinal-a-ruído igual a dois a três ou mais, conforme medido na primeira série. Em seguida, use o controle deslizante do sistema de divisão de emissões conectando a câmera número dois ao microscópio para mascarar um lado da imagem.Selecione a opção de salvamento automático do arquivo da câmera. Inicie a aquisição da série de imagens por um mínimo de 700 quadros a uma relação sinal-ruído mínima de dois. Sem tirar o prato do microscópio, adicione o ligante.Selecione uma célula com uma membrana de fluorescência brilhante e inicie rapidamente a primeira série da corrida cinética. Procure uma segunda célula, e adquira o segundo ponto de tempo da cinética. Capture uma nova célula para cada ponto de tempo da corrida cinética.Para cada novo prato, repita o alinhamento da linha laser e a otimização da iluminação TIRF. Agora converta e salve os arquivos de imagem adquiridos com o software da câmera como arquivos tif. Importe arquivos tif na rotina do software de análise ativando o usuário gráfico de N&B interfase MATLAB.Série de descarte para a qual o perfil médio de intensidade mostra mais de 10% fotobleaching e séries em que houve uma evidente distorção ou tradução da membrana celular durante a aquisição. Quadros de corte que estão evidentemente fora de foco. Mantenha para a análise apenas séries com pelo menos 500 prazos.Primeiro determine os parâmetros da câmera. Ative a câmera de calibração de rotina. Selecione uma área de pelo menos 20 por 50 pixels na região de ruído do detector.Na frequência de log versus gráfico de nível digital, mova o cursor vermelho linear para delimitar o gaussiano na parte linear da curva. Ative a tecla B. Aplique um binning mínimo de 2,2 para reduzir a dispersão dos dados e gerar o histograma B-I.Use o cursor quadrado iterativo para inspecionar o histograma B-I. Selecione um ROI quadrado para a análise e gere o mapa B do ROI selecionado. Em seguida, salve o arquivo ASCII dos valores B associados à seleção.Importe o ASCII em um software gráfico para calcular a distribuição de frequência dos dados e obter o valor B médio mais ou menos S.E.Aplique a equação epsilon para derivar o brilho médio de cada célula em cada ponto de tempo da corrida cinética. Normalize os dados de acordo com a equação de normalização, onde B't é o valor B médio medido no momento t após a adição de ligante e B'0 é o valor B médio medido no momento em que t é igual a zero, que é de 10 a 20 segundos após ligante additino. Plote o brilho médio normalizado versus o tempo de aquisição para construir a corrida cinética.Neste estudo, resultados representativos de duas células HeLa no mesmo prato expressando mEGFP-FGR1 capturado no tempo zero e sete, após a adição de 20 nanogramas por mililitro de FGF2, são mostrados aqui. Em comparação com os construtos de referência, GPI-mEGFP e dimer GPI-mEGFP-mEGFP, toda a sequência de análise mostra a intensidade média da série temporal. Enredo de todos os valores B.B-I histograma. Mapa B do ROI escolhido. E o histograma de distribuição B associado.Após a estimulação com 20 nanogramas por mililitro de FGF2, as corridas cinéticas representativas mostrando o brilho médio em função do tempo descrevem o lento processo de dimerização que persiste por vários minutos na superfície celular. Quando estimulado com 50 microgramas por mililitro de NCAM-Fc, o perfil cinético revela transições rápidas e cíclicas do receptor em misturas oligomeméricas, que também atinge valores de brilho acima do mais fraco. Um valor médio normalizado de três é repetidamente observado.É importante minimizar as variantes extras devido a não flutuações moleculares e branqueamento. E as células devem ser bem aderidas ao prato de fundo de vidro, não sobre-crescido, e não empilhados. Se estivermos interessados em uma proteína que difunde mais rápido dentro de compartimentos intracelulares, podemos aplicar zero vezes mais rápido e usar a varredura em microscópios focais ou multifotons para imagem dentro da célula.Com nossa abordagem, minimizamos os efeitos prejudiciais do fotobleaching quando queremos explorar a dinâmica de eventos como a dimerização. Esses eventos controlam uma variedade de respostas celulares e são muito difíceis de provar em células vivas com outras técnicas.

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Biologia

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Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho (Vídeo) | JoVE Journal

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