Name: Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a gerar esferóides multicelulares em plataforma lab-on-a-CD usando força centrífuga para deposição de células em micropoços. Este método simplifica a cocultura e acelera a formação de esferóides para engenharia de tecidos.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) e pelo Programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica (2018M3A9H1023141) da NRF e financiado pelo governo coreano, MSIT.

1. Fabricação de chips de cultura microfluídica (CMS) de base microfluídica (CMS)
<ol><li>Faça moldes de PC para as camadas superior e inferior do chip de cultura CMS por usinagem CNC. Dimensões detalhadas do chip são dadas na Figura 1.</li>
	<li>Misture a base pdms e pdms agente de cura em uma proporção de 10:1 (w/ w) para 5 min e coloque em um desidratador para 1 h para remover bolhas de ar.</li>
	<li>Depois de derramar a mistura PDMS nos moldes do chip de cultura CMS, retire as bolhas de ar para mais de 1 h e cure em uma câmara de calor a 80 °C por 2 h.</li>
	<li>Coloque-os no aspirador de plasma aspirado com as superfícies a serem ligados de frente e expô-los ao plasma assistido pelo ar a uma potência de 18 W para 30 s.</li>
	<li>Ligue as duas camadas do chip de cultura CMS e coloque-o na câmara de calor a 80 °C por 30 min para aumentar a força de adesão.</li>
	<li>Esterilizar o chip de cultura CMS em um esterilizador de autoclave em 121 °C e 15 psi.</li>
</ol>2. Preparação celular
<ol><li>Descongele o 1 mL do frasco contendo 5 × 105-1 × 106 hASCs ou células MRC-5s em um banho de água a 36,5 °C por 2 min.</li>
	<li>Adicione 1 mL do Modied Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco a um frasco e misture suavemente com uma pipeta de 1.000 μL.</li>
	<li>Coloque 15 mL do DMEM pré-aquecido a 36,5 °C em uma placa de Petri de 150 mm de diâmetro usando uma pipeta e adicione as células do frasco.</li>
	<li>Após 1 dia, aspirar o DMEM e substituir por 15 mL de DMEM fresco. Posteriormente, alterar a mídia a cada 2 ou 3 dias.</li>
	<li>Para separar as células da placa de Petri, adicione 4 mL de trippsina para as placas de Petri e colocá-los em uma incubadora em 36,5 ° C e 5% CO2 para 4 min.</li>
</ol>3. Formação esferóide da monocultura
<ol><li>Coloque 2,5 mL de 4% (w/v) solução plurônica F-127 no buraco de entrada do chip de cultura CMS (Figura 2A),enquanto gira o chip em 500-1.000 rpm e, em seguida, girar o chip em 4.000 rpm por 3 min usando o sistema CMS (Figura 2B). NOTA: O revestimento plurônico impede o acessório da pilha à porta da entrada quando a microplaqueta girar. Certifique-se de que o ar não está preso nos micropoços.</li>
	<li>Incubar o chip de cultura CMS preenchido com solução plurônica durante a noite a 36,5 °C em 5% CO2.</li>
	<li>Retire a solução plurônica, lave a solução plurônica restante com DMEM e seque o chip por 12 h em um banco limpo.</li>
	<li>Adicione 2,5 mL de DMEM ao chip de cultura CMS e gire o chip em ~ 4.000 rpm por 3 min para prewetting o interior do chip.</li>
	<li>Pare a rotação e retire 100 μL de DMEM para abrir espaço para injetar a suspensão celular.</li>
	<li>Adicione 100 μL de suspensões celulares que contêm 5 × 105 hASCs ou 8× 105 MRC-5s por pipetting Uniformemente distribuir as células por pipetting 3-5x para resuspensão.</li>
	<li>Gire o chip a 3.000 rpm para 3 min para prender as células em cada microwell por força centrífuga. NOTA: Velocidade rotacional excessiva pode causar fuga celular através de buracos de ejeção de solução.</li>
	<li>Cultura as células por 3 dias na incubadora em 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2, girando em 1.000-2.000 rpm. Mude a cultura a cada dia.</li>
</ol>4. Formação esferóide da cocultura
<ol><li>
Formação de esferóides concêntricos
	<ol>
<li>Adicione as primeiras células, 2,5 × 105 hASCs, e girar o chip em 3.000 rpm. Após 3 min, adicione as segundas células, 4 × 105 MRC-5s, e gire o chip em 3.000 rpm para 3 min. Injetar um total de 100 μL de suspensões celulares por pipetting. Quando as células são injetadas, mudar a velocidade de rotação para 500-1.000 rpm.</li>
		<li>Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides concêntricos são criados dentro de 24 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formação esferóide de Janus
	<ol>
<li>Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as primeiras células, 2,5 × 105 hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.</li>
		<li>Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.</li>
		<li>Adicione 100 μL das suspensões celulares contendo o segundo conjunto de células, 4 × 105 MRC-5s, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.</li>
		<li>Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides Janus são criados dentro de 24 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formação do sferoide do sanduíche
	<ol>
<li>Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as primeiras células, 1,5 × 105 hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.</li>
		<li>Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.</li>
		<li>Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as segundas células, 3 × 105 MRC-5s, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.</li>
		<li>Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.</li>
		<li>Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as terceiras células, 1,5 × 105 hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.</li>
		<li>Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides sanduíche são criados dentro de 12 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Coloração celular
<ol><li>Aqueça a corantes de fluorescência celular à temperatura ambiente (20 °C).</li>
	<li>Adicione 20 μL de anidro dimitilsulfoxida (DMSO) por frasco para fazer uma solução de 1 mM.</li>
	<li>Diluir a fluorescência a uma concentração de trabalho final de 1 μM usando DMEM.</li>
	<li>Adicione a fluorescência à suspensão celular e retire suavemente usando uma pipeta.</li>
	<li>Incubar 20 min a 36,5 °C, umidade de >95%, e 5% CO2.</li>
</ol>

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+Advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li>
<li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li>
<li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).</li>
<li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li>
<li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li>
<li>Park, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li>
<li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li>
<li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li>
<li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O CMS é um sistema fechado em que todas as células injetadas entram no micropoço sem resíduos, tornando-o mais eficiente e econômico do que os métodos convencionais de geração esferóide à base de microwell. No sistema CMS, a mídia é substituída a cada 12-24 h através de um buraco de sucção projetado para remover a mídia no chip (Figura 3A). Durante o processo de sucção da mídia, quase nenhuma mídia escapa de dentro do micropoço devido à tensão superficial entre a mídia e a parede do microwel...

É mais fácil simular microambientes in vivo biológicos com cultura celular esferóide tridimensional (3D) do que com cultura celular bidimensional (2D) (por exemplo, cultura celular convencional da placa de Petri) produzir experimental fisiologicamente mais realista resultados1. Os métodos de formação esferóide atualmente disponíveis incluem a técnica de queda suspensa2,a técnica de sobreposição líquida3,a técnica de celulose carboxtil4,a técnica microfluídica baseada em força magnética5,e o uso de biorreatores6. Embora cada método tenha seus próprios benefícios, é necessária uma melhora adicional na reprodutibilidade, produtividade e geração de esferóides da cocultura. Por exemplo, enquanto a técnica microfluídica baseada em força magnética5 é relativamente barata, os efeitos de fortes campos magnéticos em células vivas devem ser cuidadosamente considerados. Os benefícios da cultura esferóide, particularmente no estudo da diferenciação e proliferação de células-tronco mesenchymal, têm sido relatados em vários estudos7,8,9.
O sistema microfluídico centrífuga, também conhecido como laboratório-em-um-CD (disco compacto), é útil para controlar facilmente o fluido dentro e explorar a rotação do substrato e, portanto, tem sido utilizado em aplicações biomédicas, como imunoensaios10, Ensaios colorimétricos para detectar marcadores bioquímicos11, ensaios de amplificação de ácido nucleico (PCR), sistemas automatizados de análise de sangue12e dispositivos microfluídicos centrífugas de todos emum 13. A força motriz que controla o fluido é a força centrípeta criada pela rotação. Além disso, várias funções de mistura, valving e divisão de amostras podem ser feitas simplesmente nesta única plataforma de CD. No entanto, em comparação com os métodos de análise bioquímica acima mencionados, houve menos ensaios aplicando plataformas de CD para células culturais, especialmente esferóides14.
Neste estudo, mostramos o desempenho do sistema de esferóides microfluídicos (CMS) de base microfluífuga por monocultura ou cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano (hASC) e fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5). Este artigo descreve em detalhes a metodologia de pesquisa15do nosso grupo. Assim, a plataforma de cultura esferóide lab-on-a-CD pode ser facilmente reproduzida. Um sistema gerador cms compreendendo um chip de cultura CMS, um suporte de chip, um motor DC, uma montagem de motor, e uma plataforma rotativa, é apresentado. A montagem do motor é impressa em 3D com estireno butadiene acrilonitrile (ABS). O suporte de chip e a plataforma rotativa são CNC (controle numérico de computador) usinado com o PC (policarbonato). A velocidade de rotação do motor é controlada de 200 a 4.500 rpm codificando um algoritmo de PID (proporcional-integral-derivado) baseado na modulação da pulso-largura. Suas dimensões são de 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, tornando mais fácil de manusear. Usando o sistema CMS, os esferóides podem ser gerados várias condições de gravidade de 1 x g a 521 x g,de modo que o estudo da promoção de diferenciação celular alta gravidade pode ser estendido de células 2D16,17 a 3D Spheroid. A cocultura de vários tipos de células também é uma tecnologia fundamental para efetivamente imitar o ambiente in vivo18. O sistema CMS pode facilmente gerar esferóides de monocultura, bem como esferóides de cocultura de vários tipos de estrutura (por exemplo, concêntricos, Janus e sanduíche). O sistema CMS pode ser utilizado não só em estudos esferóides simples, mas também em estudos organóides 3D, para considerar estruturas de órgãos humanos.

<table><tbody><tr><td>Impressora 3D</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (hASC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Continha 1% do meio e tampão concluídos</td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>CellTracker Vermelho CMTPX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Controle numérico computadorizado (CNC) gravador rotativo</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>DC motor</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Dulbecco modificado (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Continha 10% de</td></tr><tr><td>fibroblastos pulmonares humanos médios completos (MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Autodesk</td><td></td><td>3D programa de design auxiliado por computador</td></tr><tr><td>Placa de Petri &Phi; 150 mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td> Limpador de plasma <td>tratado com superfície</td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11/6/9003</td><td>Diluir com solução salina tamponada com fosfato a 4% (p / v)</td></tr><tr><td>Policarbonato (PC)</td><td>Acrylmall</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

plataforma lab-on-a-cd para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Uma cultura tridimensional de células esferóides pode obter resultados mais úteis em experimentos celulares porque pode simular melhor microambientes celulares do corpo vivo do que a cultura celular bidimensional. Neste estudo, fabricamos uma plataforma elétrica de laboratório em um CD (disco compacto), chamada de sistema de cultura esferóide de base microfluídica (CMS), para criar esferóides de células tridimensionais (3D) implementando força centrífuga alta. Este dispositivo pode variar velocidades de rotação para gerar condições de gravidade de 1 x g a 521 x g. O sistema CMS tem 6 cm de diâmetro, tem cem 400 microwells μm, e é feito moldando com polidimetilsiloxano em um molde de policarbonato pré-feito por uma máquina de controle numérica de computador. Uma parede de barreira na entrada do canal do sistema CMS usa força centrífuga para espalhar as células uniformemente dentro do chip. No final do canal, há uma região de deslizamento que permite que as células entrem nos micropoços. Como demonstração, os esferóides foram gerados pela monocultura e pela cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano e dos fibroblastos pulmonares humanos em condições de alta gravidade usando o sistema. O sistema CMS usou um esquema de operação simples para produzir esferóides de cocultura de várias estruturas de concêntricos, Janus e sanduíche. O sistema CMS será útil em biologia celular e estudos de engenharia de tecidos que exigem esferóides e cultura organóide de tipos de células únicas ou múltiplas.

O chip de cultura CMS de 6 cm de diâmetro (Figura 2)foi feito com sucesso seguindo o protocolo acima. Primeiro, o chip foi feito separadamente de uma camada superior e uma camada inferior e, em seguida, ligado si por ligação plasmática. Esferóides resultantes podem ser facilmente reunidos, desanexando o chip. O canal do chip de cultura CMS compreende uma porta de inseto e regiões centrais, slide, e microwell (Figura 3). As soluções celular, média e plurônica são...

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Essa técnica pode ser usada para gerar esferoides celulares de tipos individuais e múltiplos de células usando uma plataforma lab-on-a-CD, um sistema pioneiro para a rápida geração de esferoides. A técnica utiliza força centrífuga para depositar células em microwells designadas, permitindo a euforia sequencial de vários tipos de células para a produção de diversos esferoides. Para a fabricação de chips de cultura CMS, primeiro faça moldes de policarbonato para as camadas superior e inferior do chip de cultura por usinagem de controle numérico de computador.Em seguida, misture a base PDMS e o agente de cura PDMS a uma proporção de 10 para um por cinco minutos antes de colocar a mistura em um desiccador por uma hora para remover bolhas de ar. Despeje a mistura PDMS desgaseada nos moldes de chip de cultura CMS e coloque os moldes no desiccator por mais uma hora para remover quaisquer bolhas de ar. No final do segundo desgaseamento, cure a mistura em uma câmara de calor a 80 graus Celsius por duas horas antes de colocar os chips em um aspirador de plasma aspirado com as superfícies a serem ligadas de frente para cima.Exponha os chips de cultura ao plasma assistido pelo ar a uma potência de 18 watts por 30 segundos, e ligue as duas camadas do chip na câmara de calor a 80 graus Celsius por 30 minutos para aumentar a força de adesão. Em seguida, esterilize o chip de cultura CMS em uma autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos. Para preparar as células para a formação de esferoides, descongele um frasco de um mililitro contendo cinco a dez vezes 10 às cinco células de interesse em um banho de água de 36,5 graus Celsius por dois minutos antes de adicionar um mililitro de DMEM às células com mistura suave.Em seguida, adicione as células a uma placa de Petri de 150 milímetros de diâmetro contendo 15 mililitros de 36,5 graus Celsius médio, e coloque o prato em uma incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, substitua o supernascedor por 15 mililitros de DMEM fresco, e devolva as células à incubadora. Para desprender as células, crie a cultura com quatro mililitros de trippsina por quatro minutos a 36,5 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, interrompendo a reação com meio fresco quando as células levantaram do fundo do prato.Para rotular as células, aqueça um corante de fluorescência celular apropriada à temperatura ambiente antes de adicionar 20 microliters de sulfóxido de dimetil anidro ao frasco para obter uma solução mililitro. Diluir a fluorescência a uma concentração final de trabalho de um micromolar em DMEM, e adicionar o corante à suspensão celular de interesse com mistura suave. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular por 20 minutos.Para a formação de esferoides monocultura, adicione primeiro 2,5 mililitros de solução F-127 plurônica de 4%plurônicos ao orifício de entrada do chip de cultura CMS enquanto gira o chip a 500 a 1.000 rotações por minuto. Quando toda a solução tiver sido adicionada, gire o chip a 4.000 rotações por minuto durante três minutos usando o sistema CMS. No final da rotação, incubar o chip de cultura durante a noite a 36,5 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono.Na manhã seguinte, remova a solução Pluronic e lave o chip de cultura com DMEM. Depois de secar o chip por 12 horas em um banco limpo, adicione 2,5 mililitros do meio à porta de entrada e gire o chip a 4.000 rotações por minuto durante três minutos. No final da rotação, substitua 100 microliters do meio na porta de entrada por 100 microliters da suspensão da célula preparada enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto.Em seguida, gire o chip a 3.000 rotações por minuto durante três minutos para prender as células em cada microwell por força centrífuga antes de colocar o chip na incubadora de cultura celular por três dias, refrescando o meio como demonstrado todos os dias. Para a geração de cocultura esferoide concêntrica, adicione a primeira população de células em 100 microliters de médio para a porta de entrada do chip enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos de rotação a 3.000 rotações por minuto. No final da rotação, adicione 100 microlitadores da segunda população celular enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto, e gire o chip a 3.000 rotações por minuto por mais três minutos.Quando ambos os volumes de células tiverem sido injetados, coloque o chip na incubadora de cultura celular em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante 24 horas. Para a formação de esferoides Janus, adicione 100 microlitadores da primeira população de células enquanto o chip está girando a 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos a 3.000 rotações por minuto. No final da rotação, coloque o chip na incubadora de cultura celular para rotação em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante três horas.No final da incubação, adicione 100 microlitadores da segunda população de células, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto antes de girar o chip a 3.000 rotações por minuto durante três minutos. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante 24 horas. Para a formação de sanduíches esferoides, primeiro adicione 100 microliters da população da primeira célula, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos de rotação a 3.000 rotações por minuto.No final da rotação, coloque o chip em uma rotadora na incubadora de cultura celular por duas horas a 1.000 a 2.000 rotações por minuto antes de adicionar 100 microliters da segunda população de células enquanto o chip está girando em 500 a 1.000 rotações por minuto. Gire o chip a 3.000 RPM por três minutos, e coloque o chip de volta na incubadora para uma incubação de três horas com rotação. Em seguida, adicione mais 100 microliters da primeira população celular, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto, e gire e cultue as células como apenas demonstrado por 12 horas.Seguindo o protocolo, como demonstrado, um chip de cultura CMS de seis centímetros de diâmetro pode ser fabricado com sucesso. O canal do chip de cultura CMS compreende um porto de entrada, e regiões centrais, deslizantes e microwell. Imagens de lapso de tempo de dois tipos de cultura celular tiradas a 2.000 rotações por minuto para as primeiras 24 horas de cultura dentro de chips CMS individuais, como demonstrado, mostram a formação bem sucedida de esferoides.Imagens dos microwells após três dias de cultura mostram que os esferoides demonstram uma excelente uniformidade e esfericidade. Esferoides coculturados com estruturas conentricas, janus e sanduíches também podem ser gerados. Além disso, culturas celulares expostas à alta gravidade por sete dias, seguidas por coloração viva/morta, demonstram que a maioria das células sobrevive à cultura de longo prazo dentro dos chips.As camadas superior e inferior do chip de cultura CMS devem ser cuidadosamente alinhadas quando estiverem ligadas, caso contrário, o número de células em cada microwell pode não ser igual. Este estudo pode diminuir a barreira de entrada para a pesquisa de esferoides de cocultura e pode ser amplamente utilizado em estudos de cocultura, por exemplo, para triagem de novos medicamentos de interesse.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Os esferoides são um tipo de modelo de cultura de células 3D usado para representar com mais precisão o ambiente de uma célula em comparação com os modelos de monocamada de cultura de células 2D. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem esferóides a partir de uma linha de células de câncer colorretal e aplicarem imagens de células vivas para rastrear o crescimento dos esferoides.

Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.

Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo

O presente protocolo descreve uma técnica para produzir esferoides de tecido em larga escala de forma econômica usando um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D.

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Há uma necessidade crítica de modelos 3D de câncer que capturem crosstalk heterocelular para estudar a metástase do câncer. Nosso estudo apresenta a geração de estroma-epitelial heteromulticelular em um ambiente scaffold e scaffold-free que pode ser usado para estudar a invasão e as distribuições espaciais celulares.

Células estromais heteromulticelulares em culturas 3D sem andaimes de células epiteliais cancerígenas para impulsionar a invasão

Aprenda a gerar esferóides multicelulares em plataforma lab-on-a-CD usando força centrífuga para deposição de células em micropoços. Este método simplifica a cocultura e acelera a formação de esferóides para engenharia de tecidos.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

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