Name: In Vitro Estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprenda a estabelecer linhas celulares de câncer de cabeça e pescoço murino usando sistema AAV-Cas9 para edição genômica. Este protocolo simplifica a criação de modelos com mutações específicas para estudo da neoplasia.

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Queremos agradecer ao Dr. Daniel Gitler por nos fornecer o plasmid pAd Delta 5 Helper. Este trabalho foi financiado pela Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (para ME), a United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (para ME e MS), a Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (para ME), a Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (para ME) e a Concern Foundation (#7895) (para ME). Companheirismo: a bolsa Alon para ME e Bolsas BGU Kreitman para SJ e MP.

Este estudo foi aprovado pela Universidade Ben Gurion do Negev Animal Care and Use Committee. Experimentos com animais foram aprovados pela IACUC (IL.80-12-2015 e IL.29-05-2018 (E)). Todos os aspectos dos testes em animais, habitação e condições ambientais utilizadas neste estudo foram em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório13.
1. Produção de vírus associada a Adeno
<ol><li>Dia 1: Cultura celular<ol>
<li>Sementes 4 x 106 células HEK293T por placa de 14,5 cm em 15 mL de DMEM. Prepare 10 placas para transfecção com polietiletilimina (PEI) (1 μg/μL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 2: Transfecção de células HEK293T usando PEI<ol>
<li>Retire a mídia e refeed com DMEM quente 1 h antes da transfecção.</li>
		<li>Reagentes de transfecção pré-enxame e DMEM.</li>
		<li>Use 10 μg do plasmídeo de interesse contendo AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 μg do AAV 2/9n capsid plasmid (com o gene de representação de AAV2 e o gene do tampão de AAV9, e 10 μg do plasmid do ajudante (ajudante do F5 do pAdDelta) por a placa (veja a tabela dos materiais). NOTA: Uma nova geração de plasmid ajudante - pAdDeltaF614,15,16 que também pode ser usado para a produção de AAV está disponível.</li>
		<li>Misture os plasmídeos em 1 mL de DMEM simples por placa. Em seguida, adicione 90 μL de polietilenomina (plasmídeo total: concentração PEI = 1:3) para a mistura plasmídeo e vórtice brevemente.</li>
		<li>Incubar a mistura de DNA PEI-plasmid por 20 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Adicione a mistura dropwise em cima das células HEK293T e transfira as placas para a incubadora de cultura celular em 37 °C com 5% de CO2 para 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 3: Mudança média após transfecção<ol>
<li>Retire o meio completamente e adicione 15 mL de DMEM fresco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 5: Colhendo o vírus<ol>
<li>Prepare um banho seco de gelo/etanol.</li>
		<li>Coletar as células com um raspador de células e transferi-los para tubos de 50 mL (2 placas por tubo de 50 mL).</li>
		<li>Tubos de spin a 800 x g por 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Descarte o supernatant de todos os tubos. Adicione 0,5 mL do buffer de lofe (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) por placa (ou seja, 5 mL para 10 placas) apenas para o primeiro tubo. Resuspenda as células e transfira o volume total para o próximo tubo e continue até o último tubo.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular para um tubo fresco de 50 mL. Lave os tubos com o mesmo volume de dbuffer de lyse (0,5 mL por placa) usando o mesmo método de transferência descrito na etapa 1.4.4.</li>
		<li>Subme a suspensão celular a três rodadas de ciclos de congelamento/degelo de ~10 min entre um banho seco de gelo/etanol e um banho de água de 37 °C. Vórtice brevemente após cada descongelamento.</li>
		<li>Se a purificação for realizada no mesmo dia, defina o tampão de equilíbrio e elução (ver Tabela 1 para a receita) na RT.</li>
		<li>Adicione 50 unidades de benzonase por placa e incubar a 37 °C para 1,5 h. NOTA: Benzonase é usado para digerir ácidos nucleic residuais das células produtoras hospedeiras e do DNA plasmídeo presente na suspensão celular.</li>
		<li>Gire os tubos a 3.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Colete o supernatant em uma seringa usando uma agulha de aço 18 G e empurre a solução através de um filtro de 0,45 μm em um tubo de 15 mL para obter o lysate bruto.</li>
		<li>Guarde o lysate bruto em 4 °C por algumas semanas até a purificação ou continuar a purificação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Purificação aAV
<ol><li>Dia 5 ou depois<ol>
<li>Coloque o tampão de equilíbrio e elução na RT.</li>
		<li>Lave colunas de cromatografia com 10 mL do amortecedor de equilíbrio.</li>
		<li>Adicione 0,5 mL por placa de heparina-agarose à coluna17 e, em seguida, adicione o buffer de equilíbrio (4x o volume da heparina-agarose). Misture as soluções invertendo a coluna e deixe o sedimento agarose.</li>
		<li>Elute o amortecedor de equilíbrio da coluna pela gravidade. NOTA: Deixe algum amortecedor de equilíbrio para evitar que a agarose seque.</li>
		<li>Carregue o lysate cru sobre a coluna e incubar por 2 h a 4 °C com agitação constante. Traga a coluna em uma posição ereta e permita que a agarose aos sedimentos.</li>
		<li>Lute o liceu bruto pela gravidade.</li>
		<li>Lave a coluna com tampão de equilíbrio (4x o volume da heparina-agarose).</li>
		<li>Coloque um filtro de proteína centrífuga de 100 kDa abaixo da coluna e alute o vírus usando um buffer de elução (3x o volume da heparina-agarose) no filtro. NOTA: O buffer de elução não deve exceder 15 mL.</li>
		<li>Centrífuga o filtro em 3.000 x g para ~ 30 min até menos de 1 mL é deixado no filtro.</li>
		<li>Encha o filtro com PBS e centrífuga a 3.000 x g por ~ 30 min até menos de 1 mL é deixado no filtro. Repita este passo 2x para remover todos os sais.</li>
		<li>Concentre a solução do vírus no filtro por centrífuga a 3.000 x g para chegar a um volume tão pequeno quanto possível (menos de 200 μL).</li>
		<li>Aspeto a solução do vírus com uma agulha e seringa e empurre a solução através de um filtro de 0,22 μm em um tubo.</li>
		<li>Faça alíquotas de partículas virais concentradas para armazenamento. NOTA: Os alíquotas devem ser ~20 μL para armazenamento a curto prazo em 4 °C e ~5 μL para armazenamento a longo prazo em -80 °C.</li>
		<li>Determine o titer viral e a eficiência viral da transdução como descrito previamente14,18,19,20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolamento e cultura das células primárias
<ol><li>Dia 1<ol>
<li>Eutanásia um B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia de CO2 ou qualquer outro protocolo aprovado pela IACUC. NOTA: Estes camundongos knockin CRISPR/Cas9 têm expressão dependente de crecombinase de endonuclease cas9 e EGFP dirigido por um promotor CAG. A sequência de Lox-Stopx (LSL) a montante, presente no genoma destes ratinhos, impede a expressão de Cas9 e EGFP na ausência de Cre recombinando. Quando usados em combinação com RNAs guia único (sgRNAs) e uma fonte Cre, eles permitem a edição de genes de camundongos individuais ou múltiplos in vivo ou ex vivo14.</li>
		<li>Dissecar a língua dos ratos eutanasiados usando tesoura cirúrgica.</li>
		<li>Dissociar manualmente o tecido, cendendo o tecido da língua em fragmentos muito pequenos usando um bisturi. Colete os fragmentos de tecido em um tubo de 15 mL contendo 4,5 ml de rpmi médio simples (com soro fora).</li>
		<li>Adicione a mistura de enzimatrips (200 μl) (ver Tabela 1 para a receita) aos fragmentos de tecido.</li>
		<li>Incubar a mistura tissue-enzima em 37 °C para 30 min e toque o tubo a cada 10 min para melhorar a dissociação enzimática do tecido.</li>
		<li>Adicione 5% de soro bovino fetal (FBS) contendo HBSS/PBS à mistura de enzimas de tecido para parar a ação enzimática.</li>
		<li>Filtre a suspensão celular acima através de uma malha de nylon estéril de 70 μm para separar as células dispersas e fragmentos de tecido maiores.</li>
		<li>Lave a suspensão celular filtrada por centrífuga por 300 x g por 5 min em HBSS/PBS na RT.</li>
		<li>Resuspenda a pelota no meio da cultura (10% FBS em RPMI/DMEM) e cresça em pratos da cultura de 60 milímetros até que as colônias distintas da pilha estejam dadas forma.<ol>
<li>Agregados de células culturais retidos em cima do filtro em um prato de cultura de 60 mm contendo 3 mL de mídia completa (10% FBS em RPMI/DMEM) até que as colônias celulares sejam formadas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Microscópico examinar as células primárias para a presença de contaminação por fibroblasto após 1 semana de cultura. Trate as células primárias desenvolvidas a partir de agregados e suspensões celulares com 0,25 solução EDTA de 0,02% a 37 °C por 1 min para remover fibroblastos. NOTA: Normalmente, a cultura primária dos agregados celulares produz mais colônias em comparação com suspensões unicelulares. As células dessas colônias fornecem melhor eficiência de transdução com transdução a AAV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Transdução de AAV de células primárias
<ol><li>Dia 10<ol>
<li>Semente 2 x 105 células primárias por poço em 6 placas de poço em 2 mL de mídia completa (10% FBS em RPMI/DMEM).</li>
		<li>No dia seguinte, transduza as células com 1012 genoma/mL viral (1010 unidades transducantes/mL) e incubam as células em meios contendo partículas virais por 48 h a 37 °C.</li>
		<li>Remova os meios de maquilista virais e alimente as células transinduzidas pelo AAV com mídia completa. NOTA: Somente as células que foram submetidas à transdução expressarão GFP e começarão a proliferar. As células que não sofreram transdução acabarão por morrer dentro de 2 semanas.</li>
		<li>Após 2 semanas de expansão da cultura, as células de semeadura para validação e os experimentos in vivo tumorigenic. NOTA: O DNA genômico das células transpolitadas com AAAV e células primárias normais de camundongos Cas9 foram extraídos para validar a edição específica do genoma usando protocolos padrão. O sequenciamento do DNA extraído e a análise dos dados sequenciados(Tabela 2)foram realizados por meio de um ensaio de sequenciamento de captura de hibridização baseada em captação (por exemplo, plataforma MSK-IMPACT) conforme descrito anteriormente21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validando a transformação de células normais para células tumorigenic usando imunofluorescência e borrão ocidental
<ol><li>Imunofluorescência<ol>
<li>Semente 2 x 105 células em 12 mm de vidro coverslips e colocá-los em uma incubadora durante a noite.</li>
		<li>Fixar células em paraformaldeído de 4% na PBS (pH = 7,4) e processo de rotulagem de imunofluorescência.</li>
		<li>Incubar as células fixas com o primeiro anticorpo primário em 1% de Soro BSA ou 1% em PBST em uma câmara umidificada por 1 h em RT ou durante a noite em 4 °C. Os anticorpos primários utilizados são o coelho monoclonal anti-KRT 14, anticorpo anti-E-cadherin monoclonal de coelho e mAb de rato Cas9.</li>
		<li>Retire a solução primária de anticorpos dos lábios covers, lavando as células 3x por 5 min com 1x PBS.</li>
		<li>Incubar as células com Cy3 burro anti-coelho IgG e / ou cabra Cy3 anti-mouse IgG anticorpos secundários em 5% BSA em PBST por 1 h em RT no escuro.</li>
		<li>Retire a solução de anticorpos secundários dos lábios e lave as células 3x conforme descrito na etapa 5.1.4.</li>
		<li>Monte os lábios com uma gota de montagem média contendo DAPI (DAPI Fluoromount).</li>
		<li>Guarde no escuro a 4 °C até que os slides sejam imagemdos usando microscopia de fluorescência.</li>
	</ol></li>
	<li>Manchaocidental<ol>
<li>Semente 1 x 106 células transformadas em um prato de cultura de 100 mm e colocá-los em uma incubadora durante a noite.</li>
		<li>Lave e raspe as células transformadas em 200 μl gelo frio PBS.</li>
		<li>Centrífuga o tubo contendo a suspensão celular por 10 min a 2.000 x g a 4 °C para dota as células.</li>
		<li>Aspirar o supernatant e lyse as células usando tampão de lofe (ver Tabela 1)contendo coquetéis inibidores de fósforo e um inibidor de protease por 10 min a 4 °C. Centrífuga sacia das lysates por 10 min a 10.000 x g e 4 °C e recolher os lysates limpos.</li>
		<li>Use um kit de ensaio de Bradford comercialmente disponível para determinar a concentração de proteínas seguindo o protocolo do fabricante. Use buffer de amostra 4x (500 mM Tris pH = 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromehenol azul) para ajustar as amostras de proteína para 0,5 ou 1 μg/μL. Ferva a 96 °C por 5 min. NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C ou até que uma análise de borrão ocidental seja realizada.</li>
		<li>Quantidades iguais separadas de lisato total (30 μg) por 10% de sulfato dodecyl-poliacrilamida gel (SDS-PAGE). Certifique-se de que o tinumodo atinja o fundo do gel. Transfira a proteína para a membrana de nylon por borrão semi-seco em 25 V por 30 min.</li>
		<li>Despeje 5% BSA em Tris-buffered salina (TBS) -0,1% Tween (TBST) sobre a membrana para cobri-lo completamente. Bloqueie a membrana por 1 h na RT. Incubar a mebrane com anticorpos primários (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, catetenina anti-β, anti p53, anti-fosfo-ERK e anti-β actin diluído em 5% BSA TBST) a 4 °C durante a noite.</li>
		<li>Após a incubação, lave as membranas por 10 min com 1x TBST certificando-se de que a solução cobre a membrana completamente. Realize esta lavagem 3x e, em seguida, adicione peroxidase de rábano (HRP) anticorpo secundário conjugado (diluído 1:10,000 em 5% BSA TBST) para a membrana. Incubar por 1 h em RT.</li>
		<li>Após a incubação, lave as membranas por 10 min com 1x TBST certificando-se de que a solução cobre a membrana completamente. Realize as imagens chemiluminescence (ver Tabela de Materiais)para expor as bandas, e capturar imagens em conformidade.</li>
	</ol></li>
	<li>Validando o potencial tumorigenic de pilhas transformadas em ratos imunocompetentes NOTA: Os ratos foram mantidos e tratados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade Ben-Gurion do Negev. Aceno. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Camundongos SCID) e C57BL/6 foram utilizados para os estudos in vivo. Os ratos foram alojados em armários de fluxo laminar filtrados pelo ar com um ciclo claro/escuro de 12 horas e foram alimentados com comida e água ad libitum.<ol>
<li>Use 6-8 semanas de idade nod feminino. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) e camundongos C57BL/6 para o estudo.</li>
		<li>Trypsinize as células transformadas a AAV-Cas9. Pare a trippsinização usando DMEM pré-aquecido a 37 °C e recolher em um tubo de 50 mL.</li>
		<li>Centrífuga do tubo a 800 x g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota de células no meio DMEM sem FBS. Executar a centrífuga novamente e resuspender a pelota celular em 1x PBS. NOTA: Não mantenha as células em 1x PBS por muito tempo. Mantenha sempre a suspensão da pilha no gelo para impedir a aglomeração da pilha.</li>
		<li>Use um contador automático da pilha para contar as pilhas e diluir as pilhas à concentração desejada (2.5 x 107 pilhas/mL) usando 1x PBS. Gerar tumores através de uma injeção subcutânea da suspensão celular transformada AAV-Cas9 no flanco direito de cada NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Rato SCID) (2 x 106 células/rato). Para gerar um modelo ortotrópico em camundongos singênicos, injete 0,5 × 106 células primárias ou as células transformadas a AAV-Cas9 na língua de camundongos imunocompetentes C57BL/6.</li>
		<li>Eutanásia os animais 2 semanas após a injeção por asfixia CO2, e dissecar os tumores dos ratos eutanasiados para análise imunohistoquímica.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490(2016).</li>
</ol>

M.S. faz parte do Conselho Consultivo do Instituto de Biociências, e Menarini Ricerche recebeu fundos de pesquisa da Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics e Menarini Ricerche. M.S. também é co-fundador da Medendi Medical Travel e, nos últimos 2 anos, recebeu homenageada de Menarini Ricerche e Da ADC Pharma. Todos os outros autores não têm nada a revelar.

Vários métodos já foram usados para transformar as células primárias na cultura com graus variáveis de sucesso25,26,27,28. A maioria desses métodos utiliza células fibroblasto de camundongos para transformação14,17,18,19 ou usa agentes cancerígenos como 4-nitroquinoli...

HNC é uma malignidade comum em todo o mundo1. Modelar a gênese da neoplasia hnc está atualmente em um ponto de viragem científica2. Enquanto muitas mutações genéticas foram identificadas no HNC2,3,4 (por exemplo, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 e RAS) as combinações específicas de alterações genômicas necessárias em conjunto para induzir o HNC permanecem obscuras.
O uso atual de linhas celulares humanas hnc tem ajudado significativamente a elucidar os mecanismos associados com patogênese e tratamento3. No entanto, o estudo das linhas celulares humanas em sistemas de urina imunocomprometida tem suas limitações, porque esses sistemas não abordam o processo neoplástico in vivo, o papel de mutações genéticas específicas e respostas de tratamento em um microambiente imunológico. Assim, o desenvolvimento e o estabelecimento de linhas celulares de urina com alterações genéticas específicas são de importância primária para estudar como diferentes genes contribuem para o processo de transformação e testar novas terapias baseadas em moléculas em camundongos imunocompetentes.
Estudos de função gênica em pesquisa biomédica têm sido significativamente afetados pelos avanços nas tecnologias de edição de DNA, introduzindo quebras de cadeia dupla (DSBs), porexemplo, 5. Essas tecnologias, incluindo o uso de nucleases de dedos de zinco, nucleases de efetores efetivos semelhantes a ativadores de transcrição e repetições palindrômicas curtas interespaçadas e agrupadas (CRISPR/Cas9), permitem a manipulação de qualquer gene de interesse em seu locus. Os mais recentes sistemas CRISPR/Cas9 são compostos por um RNA guia (gRNA) que direciona a nuclease Cas9 para gerar um DSB em um local específico do genoma. Este sistema ganhou amplo reconhecimento na modificação de genes endógenos em qualquer célula ou tecido alvo, mesmo nos organismos mais tradicionalmente difíceis de tratar5. Ele tem múltiplas vantagens sobre outros sistemas devido à sua simplicidade, velocidade e eficiência.
Em oncologia, a tecnologia CRISPR/CAS9 cumpriu a necessidade de imitar efetivamente as células cancerosas. Para estabelecer este sistema em HNC, manipulamos o potente oncogene KRAS e dois genes supressores tumorais importantes, APC e p536. De acordo com o banco de dadosgenie 7, esta combinação é rara no HNC. Mutações RAS (HRAS, NRAS e KRAS) estão presentes em apenas ~7% de todas as populações de HNC. Estes tumores tendem a ser resistentes à terapia8,9.
A entrega de Cas9 e seu gRNA é alcançada através da transdução viral usando AAVs ou lentivírus. O AAV recombinante é muitas vezes o método preferido para fornecer genes para células-alvo devido ao seu alto díter, resposta imune leve, capacidade de transduzir uma ampla gama de células e segurança geral. Usando um sistema AAV, várias linhas de células de camundongos específicas do tecido foram geradas, e novas linhas celulares ainda estão sendo desenvolvidas10,11,12. No entanto, um sistema de edição genômica eficiente que pode gerar células modelos de linha celular MNC murine continua a ser desenvolvida. Neste estudo, procuramos desenvolver um sistema in vitro baseado em AAV-Cas9 para transformar as células primárias da língua de urina em um estado tumorigenic. Este protocolo de transformação CRISPR/Cas9 único e a linha de células tumorais estabelecidas podem ser usados para entender melhor a biologia do HNC induzida por uma diversidade de alterações genômicas.

<table><tbody><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti camundongo HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td></td></tr><tr><td>Anti coelho HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr>Cas9 Tecnologia <td>de sinalização celular</td><td>mAb de camundongo</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>Cre</td><td>BioLegend</td><td>900901</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Cabra Anti-Camundongo IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-062</td><td></td></tr><tr><td>Cy-AffiniPure Cabra Anti-Coelho IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9996</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>Coelho monoclonal anti E caderina</td><td>Tecnologia</td> <td>de Sinalização Celular3195S</td><td></td></tr><tr><td>Coelho monoclonal anti-KRT 14</td><td>Abcam</td><td>AB-ab181595</td><td></td></tr><tr><td>&beta; actina</td><td>MP Biomedicals</td><td>691001</td><td></td></tr><tr><td>&beta; tecnologia</td><td>de sinalização celular</td> de catenina <td>9582S</td><td></td></tr><tr><td><forte>linhagens celulares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK93T</td><td>ATCC</td><td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td><td></td></tr><tr><td>Meios de Cultura, Produtos Químicos e Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Bio-Rad</td><td>30015484</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Amresco</td><td>0332-TAM-50G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Indústrias Biológicas Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>ECL (Westar Supernova e Westar Nova 2.0)</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3.0100 e XLS071.0250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>heparina de 04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr> - <tr><td>jogo genómico do ADN do isolado II</td><td>de Agarose Sigma</td> H6508 <td></td> Bioline BIO-52066 <td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Panreac AppliChem</td><td>300283</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Lab Ltd</td><td>1903059100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> PBS Indústrias biológicas <td></td></tr><tr><td></td><td> Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Estreptococos</td><td>para Caneta Indústrias Biológicas Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel do inibidor da fosfatase</td><td>Biotool</td><td>B15001A/B</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel do inibidor da protease</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td>MERCK Millipore</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-050-1B</td><td></td></tr><tr><td>Artigos de vidro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra de lamínulas</td><td>Naor</td><td>BNCB00130RA1</td><td></td></tr><tr><td>Barra de corrediças</td><td>Naor</td><td>BN9308C</td><td></td></tr><tr><td>Cepas de rato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td><td>Jackson labs</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td><td>Broad Institute of MIT</td><td></td><td>Gentil presente do Dr. Randall J Platt e Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT e Harvard, Cambridge, MA 02142, EUA</td></tr><tr><td>AAV 2/9 vetor de capsídeo</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAD Delta F5 ajudante</td><td>Ben Gurion Universidade do Negev</td><td></td><td>Fornecido pelo Dr. Daniel Gitler, Departamento de Fisiologia e Biologia Celular, Faculdade de Ciências da Saúde e Centro Zlotowski de Neurociência, Universidade Ben-Gurion do Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td></tr><tr><td><forte>Plástico wares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro Amicon-ULTRA 100 KDa</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m filtros estéreis, 4 mm</td><td>Millex</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; m filtros estéreis, 13 mm</td><td>Millex</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

O uso de células epiteliais normais primárias torna possível induzir reprodutivelmente alterações genômicas necessárias para a transformação celular através da introdução de mutações específicas em oncogenes e genes supressores tumorais, usando interespaçados regulamentares agrupados repetição palindrômica curta (CRISPR) baseado em tecnologia de edição do genoma em ratos. Esta tecnologia nos permite imitar com precisão as mudanças genéticas que ocorrem em cânceres humanos usando ratos. Ao transformar geneticamente as células primárias de urina, podemos estudar melhor o desenvolvimento do câncer, progressão, tratamento e diagnóstico. Neste estudo, usamos células epiteliais de língua de camundongo Cas9 indutoras para permitir a edição do genoma usando vírus associado ao adeno (AAV) in vitro. Especificamente, alterando KRAS, p53 e APC em células epiteliais normais da língua, geramos uma linha celular de câncer de murine na cabeça e no pescoço (HNC) in vitro, que é tumorigenic em camundongos singênticos. O método apresentado aqui descreve em detalhes como gerar linhas celulares HNC com alterações genômicas específicas e explica sua adequação para prever a progressão tumoral em camundongos singênicos. Nós imaginamos que este método prometedor será informativo e útil estudar a biologia e a terapia do tumor de HNC.

Usando o sistema AAV para transformar as células cas9 normais A Figura 1 fornece um mapa vetor detalhado do plasmid transgene AAV usado neste estudo. A Figura 2 descreve o design e o funcionamento do sistema baseado em AAV-Cas9. Para produzir partículas virais, as células HEK293T foram transpartidas com o vetor transgênico AAV e outros vetores de embalagens virais usando o método de transfecção PEI. Após a tra...

O desenvolvimento de modelos de urina com genes específicos mutados em pacientes com câncer de cabeça e pescoço é necessário para a compreensão da neoplasia. Aqui, apresentamos um protocolo para a transformação in vitro das células primárias da língua murina usando um sistema de vírus-Cas9 associado ao adeno para gerar linhas celulares murine HNC com alterações genômicas específicas.

In Vitro Estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Este protocolo possibilitou o desenvolvimento de modelos de câncer de cabeça e pescoço com operação genômica específica, impactando significativamente nossa compreensão do papel de mutações genéticas específicas no processo de neoplasia. A principal vantagem dessa técnica é a facilidade com que a linha celular pode ser desenvolvida a partir de praticamente qualquer órgão. Demonstrando o procedimento será Manu Prasad uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Comece usando uma tesoura cirúrgica para colher a língua de um rato transgênico B6 masculino ou feminino de seis semanas de idade. Use um bisturi para cortar o tecido em fragmentos muito pequenos e coletar os pedaços em um tubo de 15 mililitros contendo 4,5 mililitros de meio liso RPMI sem soro. Adicione 200 microliters de mistura de enzima tripla ao tubo e incubar a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos tocando o tubo a cada 10 minutos para melhorar a dissociação enzimática do tecido.No final da incubação, pare a reação com 5% de FBS no PBS e filtre a suspensão celular através de um coador de malha de 70 mímetros para separar as células dos fragmentos de tecido maiores. Colete as células por centrifugação e suspenda

in-vitro-establishment-genetically-engineered-murine-head-neck-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Source: Prasad, M. et al. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in vitro transformation of murine epithelial cells through viral delivery of Cre recombinase and mutation-inducing components. It outlines the steps for Cas9 activation, cancer-gene modification, and the establishment of a tumorigenic murine cell line.

Establishing a Murine Tumor Cell Line In Vitro Using a Virus-Cas9 System

Neste vídeo, descrevemos o isolamento de células epiteliais de uma língua murina. Essas células podem ser cultivadas posteriormente para dar origem a colônias de células.

Isolamento e cultura de células epiteliais da língua murina: um procedimento para isolar e cultivar células epiteliais da língua a partir de modelo de camundongo

Este protocolo descreve um método recentemente estabelecido para a entrega do vírus para a próstata murino. Usando tecnologia CRISPR/Cas9, superexpressão do gene ou entrega de recombinase Cre, a técnica permite ortotópico alteração da expressão gênica e implementa um modelo de romance do rato para câncer de próstata.

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

Aqui, apresentamos um protocolo para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad3 sinalização atividade usando um sistema de repórter de adenovírus. Este sistema controla a atividade transcricional em tempo real e pode ser aplicado para as duas células únicas em vitro e em animais vivosmodelos.

Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Aqui descrevemos uma metodologia rápida e direta de triagem in vivo CRISPR/Cas9 utilizando ultrassom guiado em injeções lentiviras embrionárias uterobrionárias para avaliar simultaneamente funções de vários genes na pele e cavidade oral de camundongos imunocompetrente.

Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

Aqui, apresentamos um protocolo para a realização de nocautes genéticos que são embrionários letais in vivo em tumores derivados de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, avaliando o efeito que o nocaute tem sobre o crescimento do tumor, proliferação, sobrevivência, migração, invasão e a transcrição in vitro e in vivo.

Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

Este protocolo descreve o processo de geração e caracterização de organoides uroteliais de camundongos que abrigam exclusões em genes de interesse. Os métodos incluem a colheita de células uroteliais de camundongos, transdução ex vivo com expressão de Adenovírus conduzindo Cre com um promotor de CMV, e caracterização in vitro , bem como caracterização in vivo .

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

Aprenda a estabelecer linhas celulares de câncer de cabeça e pescoço murino usando sistema AAV-Cas9 para edição genômica. Este protocolo simplifica a criação de modelos com mutações específicas para estudo da neoplasia.

In Vitro Estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9 (Vídeo) | JoVE Journal

In Vitro Estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9

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